CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ PHÔI VÔ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO pps

Nhờ đó mà phôi vô tính được nghiên cứu rất nhiều và được sử dụng để làm vật liệu để sản xuất hạt nhân tạo, đây là một phương pháp thu được nhiều lợi nhuận dựa trên khả năng nhân giống câ

CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ PHÔI VÔ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO

Một vấn đề trong việc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để tạo nên cây con mới nhằm thay thế phương pháp nhân giống bằng hạt là phải tính đến việc giảm nhân công lao động để từ đó giảm giá thành cây nuôi cấy mô Một trong những giai đoạn tốn nhiều sức lao động nhất là giai đoạn chuyển cây nuôi cấy mô

sang điều kiện ex vitro Phôi vô tính có một ưu thế rất đặc biệt so với các thể nhân giống in vitro khác là nó sở hữu một hệ thống vận chuyển tương tự như hạt ngoài

tự nhiên Nhờ đó mà phôi vô tính được nghiên cứu rất nhiều và được sử dụng để làm vật liệu để sản xuất hạt nhân tạo, đây là một phương pháp thu được nhiều lợi nhuận dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thông qua sự phát triển phôi sinh dưỡng

1 Phôi vô tính

Hạt là cơ quan bảo quản chất mầm và nhân giống ở tất cả thực vật có hoa Hạt có chứa phôi phát triển từ hợp tử sau khi sự thụ tinh giữa một tế bào trứng với một giao tử đực diễn ra Sự tái tổ hợp gene trong suốt quá trình hình thành cũng như sự kết hợp giữa hai giao tử đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hoá của thực vật hạt kín Trong suốt quá trình tiến hóa, nhiều loài thực vật đã phát triển nên những cách nhân giống mới để vượt qua các trở ngại gây ra bởi yếu tố môi trường, gene, yếu tố vật lý làm ngăn cản quá trình ra hoa, tạo hạt Các cách nhân giống mới này bao gồm sự tạo thành những cấu trúc như thân củ, thân rễ, củ, thân bò, Một hình thức tiến bộ khác xuất hiện ở những loài có khả năng sinh sản vô tính đó

là tạo phôi từ giao tử không được thụ tinh hoặc từ các tế bào sinh dưỡng Cũng giống như phôi hợp tử, các phôi vô tính này phát triển trong hạt, được bảo vệ và phân tán đi như các hạt tự nhiên Sinh sản vô tính được coi như là không chịu kiểm soát bởi gene, nhưng các điều kiện môi trường về nhiệt độ, quang kỳ cũng thúc đẩy sự phát triển từ hữu tính sang vô tính

Sự tạo phôi vô tính bất định xuất hiện ở một số loài thực vật hạt kín trong

tự nhiên hay trong các thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp nuôi cấy mô

và tế bào thực vật in vitro Quá trình hình thành phôi vô tính này được mô tả bằng

thuật ngữ “somatic embryogenesis” Những mô tả đầu tiên về sự hình thành phôi

vô tính trong nuôi cấy tế bào được đưa ra khi nuôi cấy tế bào cà rốt Kể từ đó thì hiện tượng này được nghiên cứu thành công trên nhiều đối tượng một lá mầm thuộc các họ: Alliaceae, Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae, Henerocallidaeae, Iridaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae

1.1 Khái niệm về phôi vô tính

Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là khái niệm

để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh Sự hình thành phôi vô tính được xem như là một con đường phát triển riêng biệt, khác hẳn với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ Trong đó, một tế bào sẽ phát triển thành một cấu trúc có mô phân sinh chồi và rễ đầy đủ và không

có kết nối với hệ thống mao mạch của mô mẹ ban đầu Sự tạo phôi vô tính là một quá trình nguyên vẹn và vì vậy sự phát sinh chồi chỉ là một biến đổi của quá trình cảm ứng và phát triển của phôi Với quan niệm như trên thì sự tạo phôi có thể được coi như là kết quả của một chuỗi các sự kiện phát sinh cơ quan cạnh tranh nhau

Không như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào không chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng có mang tính toàn thế Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa hoàn toàn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định Sự lặp lại toàn bộ chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gene cần thiết Sau khi đã hoàn toàn thoát khỏi chức năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh dưỡng mang tính toàn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng tương tự như phôi hợp tử

Phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hoá, trưởng thành và phát triển thành cây con Cây có thể phát triển từ một hay từ một cụm tế bào phôi

Sự sinh phôi từ một tế bào sinh dưỡng được định nghĩa là một quá trình mà trong đó một hay vài tế bào sinh dưỡng, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật), có thể tham gia vào một quá trình phân chia theo một trật tự nhất định để tạo thành một phôi, theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử

Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phôi

có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt

là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng

lưới nội chất nhỏ Các tế bào có khả năng sinh phôi được phân biệt rõ ràng với các

tế bào không có khả năng sinh phôi dựa trên những đặc tính trên

Phôi vô tính được hình thành sau khi được cảm ứng sẽ trải qua những giai đoạn phát triển tương tự như phôi hợp tử Đối với phôi của thực vật hai lá mầm thì sau giai đoạn tiền phôi sẽ là giai đoạn phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và giai đoạn 2 lá mầm tương tự như ở phôi hữu tính (Hình 3.1) Phôi của thực vật một lá mầm sẽ trải qua giai đoạn hình cầu (hình trứng hay hình chùy), bao lá mầm và lá mầm (một lá mầm hay thuẫn) Quá trình hình thành cơ quan tính từ khi phôi hình cầu phát triển sang giai đoạn lá mầm được gọi là sự biệt hóa mô Sự tạo cơ quan phôi một lá mầm về căn bản giống ở cây hai lá mầm trừ vài khác biệt về số tử diệp hay tính đối xứng của phôi

Hình 3.1 Các biến đổi hình thái hợp tử cây Capsella bursa-pasturis

Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái Về nguyên tắc, tất cả những cây con được tái sinh bằng con đường này đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gene thì các cây tái sinh là cây chuyển gene Nhân giống vô tính thực vật qua con đường phát sinh phôi vô tính cho hệ số nhân rất cao Tuy nhiên, sự phát triển bình thường của tất cả các phôi này là cả một vấn

đề Các công ty hạt giống đang nghiên cứu quá trình này để sản xuất hạt nhân tạo

1.2 Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phôi vô tính

Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều có chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn thiện với đầy đủ các chức năng cần thiết Trong suốt quá trình phát triển, sự biểu hiện gene ở thực vật được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa của rất nhiều cơ quan trong cơ thể Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gene trong mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế

nó bằng chương trình biểu hiện của gene sinh phôi Thuật ngữ IEDC (induced embryogenic determined cell) nhằm mô tả những tế bào có khả năng sinh phôi xuất phát ban đầu là những tế bào không sinh phôi Những tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gene sinh phôi thì được gọi bằng thuật ngữ PEDC (pre-embryogenic determined cell) Cả IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả hai có thể được gọi chung bằng thuật ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay gọi đơn giản là EC – embryogenic cell Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi vì sự hình thành phôi vô tính không phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy

là các tế bào sinh phôi này có tính mềm dẻo trong một số trường hợp

Các thí nghiệm nhằm hình thành phôi vô tính đều phụ thuộc vào việc mô cấy chứa các PEDC hoặc là EC Nếu mô cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính trực tiếp bởi vì phôi xuất hiện trực tiếp từ mô cấy Ngược lại, nếu các mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phôi Các tế bào được sinh ra do nhiều lần phân chia nguyên nhiễm được gọi là mô sẹo, và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính gián tiếp vì phải thông qua giai đoạn tạo mô sẹo Sự chuyển vị từ các tế bào mô sẹo sang trạng thái sinh phôi đi kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống từ định hướng ngẫu nhiên

để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau

Trong thực tế, một mô cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có đặc tính sinh phôi và không sinh phôi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mô cấy

đó Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính Từ đó có thể giải thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phôi của các loại mô cấy khác nhau Ví dụ, mô cấy cây đậu nành, cà chua, cây lanh chứa các tế bào già thì tạo những phôi bất bình thường hơn những tế bào còn non Khi các phôi hợp tử

đậu nành đạt đến giai đoạn khi mà mọi sự phân chia tế bào đều kết thúc thì không thể nào cảm ứng sự hình thành phôi vô tính nữa

Hình 3.2 Vai trò tuổi sinh lý của mẫu cấy trong việc khởi phát

sự sinh phôi vô tính

Mẫu cấy bao gồm các tế bào có thể rơi vào các trạng thái giữa trạng thái có khả năng sinh phôi (PEDC) và không có khả năng sinh phôi (non-EC) (A) Phôi hợp tử còn non có nhiều khả năng sinh phôi nhất và sẽ đáp ứng các xử lý cytokinin

để hình thành phôi vô tính (B) Phôi hợp tử trưởng thành hơn sẽ không còn khả năng đáp ứng cytokinin riêng lẽ nữa mà đòi hỏi một nhân tố auxin để tạo phôi vô tính (C) Ở những loài thực vật và mô cấy mà có thể đảo ngược từ trạng thái không sinh phôi sang có khả năng sinh phôi sẽ hình thành phôi vô tính thông qua giai đoạn mô sẹo khi được xử lý kết hợp auxin và cytokinin Những mô cấy này bao gồm các tế bào cần được cảm ứng để có khả năng sinh phôi (IEDC)

1.3 Nguồn gốc của phôi vô tính

Một chủ đề có liên quan khác đó là phôi vô tính có nguồn gốc từ một tế bào hay nhiều tế bào Một giả thuyết cho rằng mô PEDC thì sẽ tạo thành phôi có nguồn gốc từ nhiều tế bào, trong khi phôi vô tính thứ cấp (phôi vô tính có nguồn gốc từ phôi vô tính khác) có khuynh hướng là từ tế bào đơn

Quan điểm khác thì cho rằng các hệ thống tạo phôi vô tính không thông qua giai đoạn mô sẹo thì phôi vô tính sinh ra có nguồn gốc từ một tế bào Những hệ thống khác, đặc biệt là hệ thống đòi hỏi phải thông qua giai đoạn tạo mô sẹo trong nuôi cấy lỏng, huyền phù tế bào thì nguồn gốc một tế bào của phôi vô tính không chắc chắn lắm và vẫn còn gây nhiều tranh cãi Tuy nhiên, không thể biết chính xác rằng các tế bào nằm trong khối sinh phôi này là những tế bào đã được quyết định sinh phôi hay không Hơn nữa, trong hệ thống nuôi cấy lỏng, chính điều kiện vật lý

đã làm thay đổi hình dạng của các phôi vô tính, ngăn chặn sự hình thành một khối tiền phôi có thể nhìn thấy được từ một tế bào đơn

Một tế bào đã cô lập thì gần giống với phôi hợp tử, có nghĩa là nó được giải phóng khỏi tế bào bên cạnh cũng như các chất tiết của tế bào bên cạnh và do vậy phát triển thành phôi giống như một hợp tử Giả thuyết này nghe có vẻ hợp lý và thuyết phục nhưng vẫn chưa được ủng hộ bởi những nghiên cứu mà trong đó phôi

vô tính xuất hiện trên bề mặt hoặc sâu bên trong các mô nuôi cấy và mô sẹo có tổ chức bằng sự biến đổi của các tế bào có liên kết hữu cơ với những tế bào trung gian bên cạnh

Khi một tế bào đã được quyết định để trở nên sinh phôi thì không phải tất cả các tế bào có khả năng sinh phôi đó đều phát triển thành phôi vô tính Trong hệ thống biểu mô của cây lúa, bằng cách xem xét những tương đồng trong cấu trúc của các tế bào người ta thấy rằng nhiều tế bào có khả năng tạo phôi Tuy nhiên, chỉ một vài phôi vô tính xuất hiện Tương tự như vậy, ở cà rốt chỉ có một hoặc vài phôi vô tính được tạo thành từ một khối tiền phôi Người ta cho rằng có một sự cạnh tranh giữa các tế bào này vì vậy chỉ có những tế bào nào chiếm ưu thế hơn thì mới tạo nên phôi vô tính Ở các hệ thống nuôi cấy khác nhau thì một tế bào tạo nên một phôi vô tính có thể bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua vài chu kỳ phân chia, tuy nhiên điều kiện nuôi cấy, sự tương tác với các tế bào bên cạnh có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này

1.4 Đặc điểm của thực vật tái sinh từ con đường hình thành phôi vô tính

Mặc dù rõ ràng là hệ thống tạo phôi có khả năng sản xuất ra một số lượng đáng kể các thể nhân giống ở vài loài thực vật có giá trị thương mại quan trọng,

nhưng công việc kiểm tra sự biểu hiện của cây từ phôi vô tính ex vitro vẫn còn cần

được tìm hiểu kỹ Về nguyên tắc thì phôi vô tính không giống như phôi hữu tính là

nó không trải qua quá trình trao đổi chéo và tái tổ hợp của DNA, do đó phôi vô tính tiêu biểu cho một hệ thống nhân giống vô tính mà trong đó cây con được tạo thành vẫn duy trì các đặc tính của cây mẹ Nếu có sinh ra đột biến thì đó là đột

biến sinh ra trong quá trình nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, tần số đột biến ở sự tạo

phôi vô tính thấp hơn là từ hệ thống tái sinh cây từ mô sẹo, vì phôi vô tính phát triển nhanh để tạo thành cá thể hoàn chỉnh nên đặc tính chống chịu với đột biến và những biến đổi cá thể thấp hơn ở sự nuôi cấy cơ quan Điều này rất quan trọng trong nhân giống cây trồng vì phải duy trì tính đồng nhất của các cây nhân giống

Trong phân tích các cây con tái sinh từ phôi vô tính người ta nhận thấy các cây này có sức sống cao, dễ sống khi chuyển ra môi trường đất và sinh trưởng, phát triển tốt nhờ nó có các trục rễ và chồi mạnh Có lẽ một trong những đặc điểm quan trọng của cây từ phôi là nó không xuất hiện những bất thường về hình thái trong tự nhiên và không có những thay đổi nào về di truyền và tế bào Điều này có thể là do nguồn gốc một tế bào của phôi và do sự chọn lọc tế bào nghiêm ngặt trong suốt quá trình phát triển thành phôi

1.5 Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính

Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn và

có tính thương mại to lớn, đặc biệt trong vi nhân giống in vitro Trên lý thuyết, từ

một mẫu mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi Tốc độ nhân giống từ phôi cao hơn nhiều so với việc nhân giống từ mô phân sinh Đây chính là

một ưu thế của nhân giống từ phôi so với các phương pháp nhân giống in vitro

khác Ngoài ra, số lượng lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất lượng cây trồng (là nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene, lai soma, tạo những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các

chất biến dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro

1.5.1 Sự chọn lọc tế bào

Sự chọn lọc tế bào là việc tái sinh thực vật từ các quần thể tế bào kết hợp với việc chọn lọc những đặc tính mong muốn của gene Việc cần thiết nhất là phải

sử dụng những hệ thống tái sinh thực vật có khả năng tái tạo nên một cây mới từ tế bào đơn nhằm tránh sự xuất hiện các biến dị trên gene Quá trình hình thành phôi

vô tính cho phép tái tạo nên những cây hoàn chỉnh từ các tế bào đơn, từ đó ứng dụng trong các chương trình chọn lọc tế bào

Các quần thể tế bào dùng trong chọn lọc tế bào có thể được gây đột biến một cách nhân tạo, tuy nhiên không cần phải tốn thời gian và tiền bạc để gây đột

biến các tế bào trong nuôi cấy in vitro bởi vì bản thân chúng trong quá trình nuôi

cấy cũng đã xuất hiện những biến đổi phân dòng soma Thực vật có nguồn gốc từ

nuôi cấy in vitro có thể mang những biến đổi về kiểu hình và thường là di truyền

được Những biến đổi này gọi là biến dị soma và các cây có nguồn gốc từ phôi vô tính cũng xuất hiện những biến dị trên

Biến đổi soma là một vấn đề nghiêm trọng trong nhân giống vô tính, tuy nhiên nó lại có giá trị trong các chương trình chọn lọc tế bào Các biến đổi soma

có thể tạo ra những đặc tính quan trọng trong nông nghiệp chẳng hạn như làm tăng khả năng chịu mặn, hay trở nên kháng được thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, chịu phèn hay chịu hạn, hoặc có thể xuất hiện những đột biến sinh hóa thú vị khác Ví dụ như

sự chọn lọc tế bào và tái sinh cây thông qua phôi vô tính đã được ứng dụng để tăng tính chịu mặn và kháng bệnh ở cây Citrus, kháng virus ở cây mía, kháng phytotoxin

ở cây cà phê

5.1.2 Sự tái sinh các thực vật chuyển gene

Có nhiều cách để tái sinh cây sau khi đã được chuyển gene bằng con đường phôi vô tính:

 Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thông qua tạo phôi vô tính trực tiếp

 Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thông qua tạo phôi vô tính gián tiếp

 Biến nạp vào tế bào có khả năng sinh phôi và sau đó tái sinh bằng con đường sinh phôi gián tiếp

 Biến nạp vào phôi vô tính và tái sinh thông qua con đường sinh phôi thứ cấp hoặc sinh phôi gián tiếp

 Biến nạp vào trong phôi vô tính, tăng sinh thông qua con đường hình thành phôi thứ cấp và sau đó tái sinh thông qua con đường hình thành cơ quan

5.1.3 Sự tạo các dòng đồng hợp tử và đa bội

Quá trình hình thành phôi vô tính cũng có thể làm xuất hiện những cây tái sinh đa bội Xử lý colchicine hoặc amiprophos-methyl làm ngăn chặn sự hình thành vi ống trong môi trường nuôi cấy phôi vô tính sẽ thúc đẩy sự hình thành các phôi đa bội Những thực vật tam bội cũng có thể được tái sinh nếu phôi vô tính được hình thành có nguồn gốc từ nội nhũ

Hoặc cũng có thể tạo được những cây đơn bội khi nuôi cấy các mẫu cấy đơn bội như hạt phấn, bào tử thông qua con đường hình thành phôi vô tính Sự kết hợp của sự tạo cây đơn bội và các kỹ thuật nhân đôi bộ nhiễm sắc thể cũng giúp tạo nên các cây đồng hợp tử ở thế hệ đầu tiên

1.5.4 Sự loại trừ virus

Phôi vô tính có một hệ mao mạch rất phát triển, tuy nhiên hệ thống này không nối liền với hệ mạch dẫn của mô cấy Điều này có nghĩa là việc tạo phôi vô tính cũng có thể giúp để tạo được các dòng cây sạch bệnh virus, có thể kết hợp với biện pháp sốc nhiệt để đạt được kết quả tốt hơn

Các loại virus GFLV (Grapevine Fan Leaf Virus) và A-2 và 3-GLR (Grapevine Leafroll associated virus) đã được loại trừ bằng cách sử dụng phương pháp tạo phôi vô tính kết hợp với các liệu pháp nhiệt Mô sẹo hình thành từ bao phấn và bầu noãn của những cây bị nhiễm GFLV và các loại virus GLR khác Các

mô sẹo này được sốc nhiệt (35oC) và phôi vô tính được tạo ra sau đó đã nảy mầm

và phát triển thành cây Các cây tái sinh này được kiểm tra bằng phương pháp miễn dịch học và các kiểm nghiệm huyết thanh học Kết quả sau đó cho thấy sự hình thành phôi vô tính kết hợp với sốc nhiệt là một quá trình hiệu quả nhằm loại trừ các bệnh virus

Phương pháp này cũng được áp dụng thành công ở cây Citrus Vòi nhụy của cây chanh thuộc các giống khác nhau đã bị nhiễm các bệnh virus có khả năng sinh phôi vô tính Cây tái sinh từ phôi vô tính này cho kết quả âm tính khi thử nghiệm sự hiện diện của virus và viroid

1.5.5 Sự thành lập khuẩn căn

Việc kết hợp giữa sự hình thành phôi vô tính và sự hình thành khuẩn căn in vitro được đưa ra đầu tiên do Redenbaugh và cộng sự vào năm 1987 Các ứng

dụng của nó rất hấp dẫn nhưng đến nay vẫn có rất ít các công trình nghiên cứu về điều này Các nghiên cứu cho thấy việc ủ các nấm khuẩn căn ngoài vào môi trường đã thúc đẩy sự phát triển của cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính

2 Công nghệ hạt nhân tạo

Giống như phôi từ hạt, phôi vô tính có mang sẵn các mô rễ và chồi, nghĩa là

đã được thiết lập sẵn một chương trình để phát triển thành cây hoàn thiện Bên cạnh đó, phôi vô tính không như chồi bất định là vì nó không có hệ thống mao mạch nối liền với nguồn mô ban đầu Vì tất cả lý do trên mà phôi vô tính không như bất kỳ thể nhân giống thực vật nào khác là nó không cần giai đoạn kéo giãn chồi, cắt chồi và giai đoạn ra rễ trước khi chuyển sang môi trường đất trồng tự nhiên Tuy vậy, phôi vô tính cũng có những khác biệt so với phôi hữu tính: (1) không được phát triển bên trong một vỏ bọc hạt, (2) không phải trải qua quá trình làm khô nhờ nguồn mô mẫu ban đầu, và (3) không được trang bị một hệ thống

chất dự trữ, nghĩa là không được cung cấp năng lượng cần thiết và các nhân tố cần thiết khác cho đến khi nó có thể bắt đầu thực hiện quang hợp Do vậy, các nghiên cứu về vấn đề tạo hạt nhân tạo nhờ phôi vô tính đã tập trung chủ yếu vào việc thiết

kế ra các phương pháp tạo vỏ bao, thực hiện các xử lý làm khô và cải thiện chất lượng phôi

Mặc dù quan niệm về việc tạo các hạt tổng hợp bằng cách bao bọc phôi vô tính được Murashige giới thiệu đầu tiên vào năm 1977, nhưng mãi cho đến vài năm sau đó mới có thí nghiệm đầu tiên được thực hiện, và cho đến năm 1986 thì Redenbaugh và cộng sự mới tóm lại về tất cả các nhân tố cần thiết để tạo nên một

vỏ bọc hiệu quả nhất Nguyên liệu để tạo vỏ bao cần phải có độ bền đủ cao để vừa bảo vệ phôi trong suốt quá trình vận chuyển và gieo vào đất và vừa cho phép phôi nảy mầm tốt được Ngoài ra, khả năng tái sinh một số loài thực vật từ phôi vô tính

và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công trong việc tạo hạt này

2.1 Khái niệm về hạt nhân tạo

Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để chỉ phôi vô tính hay những thể nhân giống khác được bọc bởi một lớp gel, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài và vận chuyển trở nên dễ dàng hơn Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính cho thấy có tầm quan trọng đối với những thực vật: 1) không tạo được hạt, 2) hạt được tạo thành với một số lượng thấp, 3) khả năng hạt sống sót rất thấp, 4) việc nhân giống thực vật khó khăn, và chất mầm không thể bảo quản được

Tuy nhiên, để có thể thương mại hóa hạt nhân tạo thì trước tiên đòi hỏi quá trình tạo phôi vô tính trên các đối tượng thực vật đó phải cho ra những phôi phát triển bình thường, có kiểu hình đồng nhất

2.2 Các nhân tố cần thiết trong tổng hợp hạt nhân tạo

2.2.1 Các nguồn mẫu sử dụng làm hạt nhân tạo

Phôi vô tính:

Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện qua nhiều bước Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính có chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi

từ phôi đến cây con cao Sử dụng phôi vô tính ở giai đoạn hình tim muộn và hình