PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR pps

Kết quả: 100 mẫu thực phẩm kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính đối với Salmonella là 8% và 20%; đối với E.. Kết luận: Sử dụng PCR

PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC

do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP HCM cung cấp

Kết quả: 100 mẫu thực phẩm kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính đối với Salmonella là 8% và 20%; đối với E coli là 44 và 88%; đối với S aureus là 32 và 46%; đối với Listeria monocytogenes là 8 và 13% 70 mẫu thủy hải sản kiểm tra

V parahaemolyticus cho kết quả nuôi cấy là 11,4% và PCR 17,1% So sánh

về độ nhạy cho thấy phương pháp PCR cho kết quả tốt hơn (100%)

Kết luận: Sử dụng PCR giám sát mẫu thực phẩm nhằm phát hiện và chọn nhanh các mẫu đạt yêu cầu (cho kết quả âm tính) khi kiểm tra chất lượng vệ sinh thực phẩm sẽ tiết kiệm được thời gian trả lời kết quả so vớI phương pháp nuôi cấy

Results: The survey results showed that: 100 samples were analyzed

by traditional culture-based technique and PCR technique for Salmonella is 8% and 20%; for E coli is 44 and 88%; for S aureus is 32 and 46%; for Listeria monocytogenes is 8 and 13%, respectively 70 samples were analyzed by traditional culture-based technique and PCR technique for Vibrio parahaemolyticus is 11.4% and 17.1%, respectively A comparation

the sensity of two methods between PCR and culture method showed that: PCR have the sensity higher (100%)

Conclusion: PCR method can use in monitoring food hygiene-safety

to detect and eliminate rapidly the foods of bacterial contamination and time-saving

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay trong công tác kiểm tra chất lượng vệ sinh thực phẩm về mặt

vi sinh vật tại các phòng thí nghiệm trong cả nước chủ yếu vẫn sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống(5,7,8,9) Để đáp ứng cho nhu cầu giám sát mẫu thực phẩm với số lượng nhiều cùng một lúc thì công tác nuôi cấy sẽ tốn nhiều thời gian, môi trường nuôi cấy, hơn nữa để góp phần trong chẩn đoán nhanh các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với quy mô ngày càng lớn, trong đó, phần lớn có nguyên nhân là do vi sinh vật thì kỹ thuật PCR sẽ đáp ứng kịp thời cho những nhu cầu đó Các tác nhân vi khuẩn thường gây ngộ độc thực phẩm là Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus và Listeria monocytogenes(2,3,5,7,9) Để đánh giá khả năng ứng dụng của bộ kit PCR do trường Đại học Khoa học Tự nhiên

TP Hồ Chí Minh sản xuất chúng tôi đã tiến hành phân tích mức độ ô nhiễm

vi sinh vật một số nhóm mẫu thực phẩm như thịt, thủy hải sản, sữa và các loại bánh được bày bán tại các chợ và các hàng quán trên địa bàn thành phố bằng kỹ thuật PCR và so sánh độ nhạy phát hiện của hai phương pháp Từ những kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số khuyến cáo khi sử dụng

bộ kit PCR chẩn đoán nhanh các vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐH Quốc gia TP HCM)

Phương pháp

- Mẫu thực phẩm được phân tích các chỉ tiêu vi sinh dựa trên qui định của Bộ Y tế (QĐ 867/1998)(9) bằng cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy

- Phân tích mẫu bằng phương pháp nuôi cấy được thực hiện theo các tiêu chuẩn như sau: Salmonella (TCVN 4829:2001), E coli (TCVN 5155:90), S aureus (TCVN 5156:1990), V parahaemolyticus (QĐ 3349/QĐ-BYT) và Listeria monocytogenes (AOAC 2000 - 993.12)

- Phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR(7,8):

+ Xử lý mẫu: đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh thích hợp, ủ từ 16 - 22h Hút 1ml mẫu sau khi tăng sinh, xử lý

+ Thu nhận DNA bản mẫu từ 1ml dịch sau tăng sinh, ly tâm 800vòng/phút, loại bỏ mảnh vụn thực phẩm, thu dịch nổi Ly tâm 5000vòng/5phút, lấy cặn Rửa cặn 2 lần bằng nước cất vô trùng Ly tâm và huyền phù cặn trong 200ml TE, đun ở 100oC/10phút Ly tâm 12.000 vòng/5 phút Hút 3ml dịch nổi là DNA khuôn cho vào tube chứa 21,5ml PCR mix

và 0,5ml Taq DNA polymerase (tổng thể tích là 25ml)

+ Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt (thermal cycler) của hãng Bio-Rad theo chương trình đã cài đặt, gồm các bước sau:

Chu kỳ 1: (x1) Bước 1: 940C x 5 phút

Chu kỳ 2: (x35) Bước 1: 940C x 30 giây

- Phương pháp PCR-ELISA theo bộ kit của hãng Bio-Rad: để phát hiện Salmonella

- Thống kê, đối chiếu kết quả ghi nhận bằng phương pháp PCR và nuôi cấy dựa trên độ nhạy của hai phương pháp theo tiêu chuẩn của HC (Health Canada) and CFIA (the Canadian Food Inspection Agency)

KẾT QUẢ

Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện Salmonella

Bảng 1: Kết quả nuôi cấy, PCR-ELISA và PCR phát hiện Salmonella (n=100)

Mẫu thực phẩm

Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện E coli

Bảng 2: Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện E coli (n=100) Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR

44,00

56,00

88,00

12,00

Hình 2: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn E coli

Ghi chú: Các mẫu từ D1 đến D14 (14 mẫu) E coli đều dương tính, vạch 299bp

Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện S aureus

Bảng 3: Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện S aureus (n=100)

Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR +

Hình 3: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn S aureus

Ghi chú: các mẫu từ D1 đến D4 (4 mẫu) S aureus đều dương tính, vạch 276 bp

Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện Listeria monocytogenes (hình 4) Bảng 4: Kết quả nuôi cấy và PCR Listeria monocytogenes (n=100)

Nuôi cấy

PCR +

Hình 5: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn V parahaemolyticus

Ghi chú: - H1, G4, G5 và G7: (+) - H2, H3, H4, H5, G1, G2, G3, G6 và F1: (-)

BÀN LUẬN

Bảng 1 cho thấy kết quả kiểm tra định tính Salmonella trong thực phẩm bằng 3 phương pháp: nuôi cấy, PCR-ELISA và PCR như sau: nuôi cấy cho kết quả dương tính là 8 mẫu (8%), PCR-ELISA (bộ kit của hãng Bio-Rad) cho số mẫu dương tính là 19 (19%) và PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho số mẫu dương tính là 20 (20%)

Như vậy, hai phương pháp PCR-ELISA và PCR cho kết quả tương đương (19% và 20%) khi phát hiện Salmonella, nhưng cho tỉ lệ phát hiện cao hơn hẳn phương pháp nuôi cấy (8%), sự khác bệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Điều này có thể lý giải như sau: trong các thực phẩm qua chế biến

có Salmonella bị chết, không thể phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy nhưng vẫn phát hiện được bằng phương pháp PCR, nguồn thực phẩm ban đầu đưa vào chế biến chưa đảm bảo vệ sinh vì theo chỉ tiêu đã qui định: Salmonella không được hiện diện trong nguyên liệu chưa chế biến ngoài ra, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy nên cho kết quả phát hiện cao hơn

Bảng 2 thể hiện kết quả kiểm tra vi khuẩn E coli trong thực phẩm bằng 2 phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho số mẫu dương tính là 44 (44%), PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho 88 mẫu dương tính (88%) Như vậy, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn hẳn phương pháp nuôi cấy (88% so với 44%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Để ứng dụng bộ kit này trong công tác giám sát vệ sinh thực phẩm, cần thực hiện kỹ thuật bán định lượng cho qui trình PCR, nghĩa là đối với từng chủng loại thực phẩm cho phép sự có mặt của E coli bao nhiêu thì chúng ta sẽ pha loãng mẫu đến đậm độ cho phép rồi sau đó mới tăng sinh và kiểm nghiệm bằng PCR, nếu mẫu điện di dương tính có nghĩa mẫu là vượt quá giới hạn cho phép

Bảng 3 cho thấy kết quả kiểm tra S aureus trong thực phẩm bằng 2 phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho 32 mẫu dương tính (32%), PCR (bộ kít của trường Ðại học KHTN) cho 46 mẫu dương tính (46%) Phương pháp PCR cho kết quả dương tính cao hơn phương pháp nuôi cấy (46% so vớI 32%, p<0,05) Có thể lý giải này như sau: một số vi khuẩn S aureus bị chết trong quá trình chế biến nên không phát hiện được qua nuôi cấy và độ nhạy của phương pháp PCR cao hơn phương pháp nuôi cấy

Bảng 4 thể hiện kết quả kiểm tra Listeria monocytogenes trong thực phẩm phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho 8 mẫu dương tính (8%), PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho số mẫu dương tính là 13 (13%)

Như vậy, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy (p<0,05) Ngoài ta, có thể do mẫu ban đầu nhiễm, qua xử lý vi khuẩn bị chết và không thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy nhưng vẫn phát hiện được bằng PCR Khi kết quả PCR dương tính chúng ta chỉ xác định được chắc chắn các mẫu thực phẩm không bị nhiễm trước khi chế biến (các mẫu PCR âm tính) Để xác định chắc chắn các mẫu thực phẩm có bị nhiễm trước khi sử dụng hay không, phải phương pháp nuôi cấy lại mới kết luận được chính xác

Bảng 5 cho thấy có 70 mẫu hải sản được kiểm tra bằng nuôi cấy và PCR để phát hiện Vibrio parahaemolyticus: nuôi cấy phát hiện được 8 mẫu dương tính (11,4%) trong khi PCR cho số mẫu dương tính là 12 (17,1%) Cách lý giảI cũng tương tự như ở phần trên

KẾT LUẬN

1 Quy trình và bộ kít PCR phát hiện Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus và Listeria monocytogenes gây ô nhiễm thực phẩm do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên,

ĐH Quốc gia - TP HCM xây dựng có thể được ứng dụng để phát hiện nhanh các loài vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm nhằm giảm thiểu thời gian trả lời kết quả so với phương pháp nuôi cấy (tốn 3 - 6 ngày)

2 Các qui trình và bộ kit PCR này dễ dùng, dễ thao tác và có độ nhạy cao (100%) Với ưu điểm như trên, phương pháp PCR rất thích hợp cho công tác kiểm tra và giám sát cùng lúc một số lượng lớn các mẫu thực phẩm hoặc chẩn đoán nhanh các vụ ngộ độc có liên quan đến ô nhiễm vi sinh vật với nhiều chỉ tiêu mà không tốn nhiều công sức và thời gian theo dõi kết quả như phương pháp nuôi cấy

3 Tuy nhiên, phương pháp PCR phát hiện cả những mầm bệnh đã chết (vẫn cho kết quả PCR dương) Do đó, phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm có giá trị thực tiễn nhất trong việc chọn được nhanh các mẫu cho kết quả âm tính – các mẫu thực phẩm đạt chất lượng tốt qua giám sát