XÁC LẬP CÁC GIÁ TRỊ TRUNG VỊ CHO BỘ BA XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC TRƯỚC SINH pdf

XÁC LẬP CÁC GIÁ TRỊ TRUNG VỊ CHO BỘ BA XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC TRƯỚC SINH TÓM TẮT Đặt vấn đề: Xét nghiệm sàng lọc trước sinh ngày càng được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới gi

XÁC LẬP CÁC GIÁ TRỊ TRUNG VỊ CHO BỘ BA XÉT NGHIỆM

SÀNG LỌC TRƯỚC SINH

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Xét nghiệm sàng lọc trước sinh ngày càng được áp dụng rộng

rãi ở nhiều nước trên thế giới giúp nhận diện các thai phụ có nguy cơ sinh con bị một số dị tật bẩm sinh

Mục tiêu nghiên cứu: nhằm xác định các giá trị trung vị (median) của bộ

ba xét nghiệm sàng lọc ở 3 tháng giữa thai kì gồm AFP, beta hCG tự do và uE3 cho mỗi tuần tuổi thai của thai phụ để phục vụ cho việc sàng lọc trước sinh Các giá trị trung vị được sử dụng để tính nguy cơ cho mỗi thai phụ tham gia làm xét nghiệm sàng lọc nhằm phát hiện các thai phụ có nguy cơ cao mang thai bị hội chứng Down, hội chứng Edward và dị tật ống thần kinh

Phương pháp nghiên cứu: Tiền cứu, cắt ngang

Kết quả: 1448 mẫu huyết thanh được thu thập từ 1448 thai phụ với các tiêu

chuẩn chọn lọc như có cân nặng từ 40 đến 60 kg, mang đơn thai có tuần tuổi từ 14 đến 21 Các thai phụ bị loại trừ nếu bị bệnh tiểu đường phụ thuộc Insulin, hút thuốc lá, có tiền sử xảy thai liên tiếp ³ hai lần hoặc có thai/con trước mắc hội chứng Down, Edward hay dị tật ống thần kinh Các mẫu huyết thanh thu thập sẽ được thực hiện đo nồng độ của AFP, beta hCG tự do và uE3 bằng phương pháp

ELISA (kit T21 Gamma-Bỉ) và xác định các giá trị trung vị bằng phần mềm STATISTICA Các giá trị trung vị của 3 thông số AFP, beta hCG tự do và uE3 trong huyết thanh thai phụ theo tuần tuổi thai đã được xác lập và cài đặt vào phần mềm tính nguy cơ T21 Gamma- Bỉ

Thảo luận và kết luận: Sau khi xác lập được các giá trị trung vị của 3

thông số AFP, beta hCG tự do và uE3 trong huyết thanh thai phụ theo tuần tuổi thai ở 3 tháng giữa thai kỳ, chúng tôi phải tiến hành ứng dụng các giá trị trung vị của bộ ba xét nghiệm sàng lọc này trên mọi thai phụ có tuần tuổi thai từ 15 đến 21 tình nguyên tham gia vào chương trình sàng lọc kết hợp với thực hiện xét nghiệm chẩn đoán để có thể tìm được tỉ lệ phát hiện dị tật cũng như là tỉ lệ dương tính giả thực sự của bộ kit này để từ đó có thể có kết luận chính xác về bộ kit làm sàng lọc

Introduce: Prenatal screening is applied commonly in many countries on

the world to find out the high risk pregnancies for the prenatal diagnosis of fetal chromosomal abnormalities

Aim : To establish medians for second-trimester maternal serum markers,

including alpha feto protein ( AFP), free beta human chorionic gonadotropin (hCG) and unconjugated oestriol ( uE3) for each gestation week Then we use these parameters for calculating the risk for pregnancies who attend the prenatal screening for Down, Edward syndrome and Neural tube defect

Methods : Prospective and cross-section study

Results : Sera were collected from 1448 women who have singleton

pregnancy with gestation week from 14 to 21 and maternal weigh from 40 to 60 kgs The pregnancies that were excluded had successive miscarriage ≥2, smoking, insulin dependent diabetics and history of abnormal fetus/child Then we carried out measurement of concentrations of AFP, free beta hCG and uE3 by ELISA technique and established median values by STATISTICA software These medians set up for our population in T21 soft for calculating the risk for pregnancies who attend prenatal screening program

Discussion and conclusion: Apply the medians for find out the high risk

pregnancies of Down, Edward syndrome for prenatal diagnostics Then we calculate the detection rate and false positive rate of this Gamma kit on prenatal screening

ĐẶT VÂN ĐỀ

Hiện nay, ở các nước phát triển tiêu biểu như Anh và Mỹ, ngoài một số cơ sở vẫn thực hiện bộ ba hay bộ hai xét nghiệm sàng lọc thì nhiều viện nghiên cứu, bệnh viện trường Đại học và các bệnh viện đã bước đầu áp dụng các loại xét nghiệm phối hợp gồm tuổi mẹ, siêu âm đo khoảng mờ da gáy và các xét nghiệm PAPP-A (protein trong huyết tương liên quan đến thai kì), hCG tự do ở 3 tháng đầu của thai kì (combined test) hay xét nghiệm tích hợp giữa 3 tháng đầu và 3 tháng giữa của thai kì (integrated test) Các loại xét nghiệm này có ưu điểm là tỉ lệ phát hiện tăng lên có thể tới 85-95% với tỉ lệ dương tính giả 5%, nhưng cần phải có trang thiết bị phù hợp cũng

như kinh nghiệm trong siêu âm hay xét nghiệm sàng lọc [2,3] Ở các nước đang phát triển như Việt nam, lại ở bước đầu nghiên cứu áp dụng xét nghiệm sàng lọc trước sinh trong việc phát hiện thai phụ có nguy cơ cao mang thai bị dị tật bẩm sinh, tốt nhất chúng ta nên sử dụng bộ ba xét nghiệm sàng lọc để tích lũy kinh nghiệm và học hỏi các kỹ thuật mới để sau một thời gian ngắn chúng ta có thể áp dụng được các chương trình sàng lọc tiên tiến Chính vì vậy, mục tiêu của chúng tôi là xác định các giá trị trung vị của các thông số bộ ba xét nghiệm sàng lọc ở dân số thai phụ bình thường trong 3 tháng giữa của thai kì, nhằm phục vụ sàng lọc trước sinh cho mọi thai phụ tham gia để tìm ra đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị hội chứng Down, hội chứng Edward, hay dị tật ống thần kinh[1]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Tính giá trị trung vị của AFP, beta hCG tự do và uE3

Mẫu bệnh phẩm

Huyết thanh: 1448 mẫu cho các tuần thai từ 14-21 tuần

Tiêu chuẩn chọn mẫu

Phụ nữ có thai từ tuần tuổi 14 đến tuần 21

Trong độ tuổi mang thai

Mang một thai

Cân nặng 40-60 kg

Tiêu chuẩn loại trừ

Thực hiện IVF thụ tinh trong ống nghiệm

Hút thuốc lá

Bị tiểu đường phụ thuộc insulin (type 1)

Có tiền sử sản khoa như xảy thai liên tiếp ³ hai lần hoặc có thai/con trước mắc hội chứng Down, Edward hay khiếm khuyết ống thần kinh

Thuốc thử: T21 kit (dùng cho huyết thanh) của hãng Gamma – Bỉ

Phần mềm tính nguy cơ: Phần mềm T21 Gamma do hãng Gamma – Bỉ

Phương pháp

Thu mẫu

Lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch của thai phụ Cho mẫu máu vào tube để tách huyết thanh (thời gian tách huyết thanh không quá 4 giờ) Huyết thanh được cho vào tube và trữ ở -30oC[5]

Elisa so màu để xác định nồng độ AFP, b hCG tự do hay uE3

Nguyên tắc

Phản ứng màu dựa trên nguyên tắc ELISA kẹp chả (ELISA -sandwich), các giếng được phủ kháng thể kháng AFP, kháng b-hCG hay kháng uE3, sau khi ủ với huyết thanh thai phụ (có chứa AFP, b –hCG và uE3) và rửa các thành phần không đặc hiệu khác, thêm thành phần cộng hợp gồm kháng thể kháng AFP, b –hCG hay

uE3 Phức hợp được tạo thành là: Anti-AFP IgG*AFP*Cộng hợp của anti-AFP và peroxidase; Anti-b–hCG IgG*b-hCG*Cộng hợp của anti-b-hCG và peroxidase và Anti-uE3 IgG*uE3*Cộng hợp của anti-uE3 và peroxidase Sau đó phức hợp miễn dịch sẽ được phát hiện nhờ phản ứng với cơ chất TMB và đổi màu từ xanh sang vàng sau khi ngưng phản ứng enzym bằng acid sulphuric Cường độ màu tỉ lệ trực tiếp với nồng độ của AFP, b-hCG và uE3 có trong mẫu huyết thanh Đo mật độ quang ở bước sóng 450nm hay 450/650 nm hay 450/690nm

Chứng nội

Ngoài mẫu chứng nội có sẵn trong mỗi hộp thuốc thử do nhà sản xuất cung cấp, sử dụng thêm mẫu kiểm chứng nội do hãng Biorad cung cấp gồm 3 mức nồng độ khác nhau là cao, trung bình và thấp trong mỗi lần làm phản ứng để đảm bảo chất lượng của bộ thuốc thử và quá trình thao tác

Độ lặp lại và độ đúng của nồng độ hiệu chuẩn

Được lặp lại hai lần với độ tương quan phù hợp, kết quả đo độ hấp thu ở các bước sóng 450nm hay 450/650 hay 450/690 của các nồng độ hiệu chuẩn phải nằm trong khoảng cho phép theo bảng kiểm tra chất lượng đi kèm trong mỗi hộp thuốc thử

Độ lặp lại của mẫu huyết thanh (MS)

Trong mỗi bản 96 giếng sẽ có từ 5 –10 mẫu huyết thanh được lặp lại

Phương pháp xử lý thông tin

Sử dụng phần mềm STATISTICA để tính trung vị đối với từng tuần tuổi thai

Các thông tin cần thiết về thai phụ như ngày lấy mẫu, ngày sinh, ngày siêu âm, đường kính lưỡng đỉnh (hay chiều dài đầu mông), ngày đầu kỳ kinh cuối, cân nặng phải được cung cấp phải chính xác Sau khi có đủ số liệu ít nhất 100 thai phụ cho mỗi tuần tuổi thai, thì dùng phép thống kê mô tả để tính giá trị trung vị cho mỗi tuần tuổi thai

Xác định nguy cơ cho mỗi thai phụ tham gia sàng lọc trước sinh

Xác định các giá trị bội số trung vị (MoM = Multiple of median) của các thông số AFP, bhCG tự do và uE3 cho mỗi thai phụ bằng cách lấy giá trị đo được của từng thông số chia cho giá trị trung vị của thông số đó của nhóm thai phụ bình thường có cùng tuổi thai Dựa trên các giá trị MOM này, phần mềm tính nguy cơ xác định tỉ lệ nguy cơ cho từng thai phụ[4,6]

Nguy cơ mắc hội chứng Down theo tuổi

Dựa theo tuổi của thai phụ lúc đến thực hiện xét nghiệm, phần mềm sẽ cho nguy cơ về tuổi của thai phụ có khả năng mang thai mắc phải hội chứng Down khi sinh con

Nguy cơ mắc hội chứng Down theo sinh hóa

Dựa trên giá trị đo được của các thông số AFP, b hCG và uE3, phần mềm tính MoM tương ứng (Multiple of median = bội số của trung vị đối với từng thông số) Theo hàm quy ước trên các giá trị MoM, phần mềm tính nguy cơ mang thai mắc hội chứng Down Nguy cơ này đã được hiệu chuẩn theo những yếu tố khác có ảnh hưởng đến nồng độ của các thông số như cân nặng, hút thuốc, tiểu đường týp 1

Nguy cơ mang thai mắc hội chứng Edward (mang 3 NST 18)

Dựa trên giá trị MoM của các thông số xét nghiệm, phần mềm tính nguy cơ mang thai mắc hội chứng Edward khi ba thông số AFP, b hCG và uE3 đều giảm

Nguy cơ mang thai bị dị tật ống thần kinh (Neural tube defect)

Dựa trên giá trị MoM của AFP ở 3 tháng giữa thai kỳ thai MOM của AFP tăng >2,5 lần so với giá trị trung vị AFP của nhóm thai phụ bình thường có cùng tuổi thai

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Độ lặp lại của các nồng độ hiệu chuẩn (calibrator), chứng nội kiểm tra và huyết thanh trong một lần và trong các lần xét nghiệm khác nhau

Bảng.1 Độ lặp lại của các nồng độ hiệu chuẩn (2 giếng khác nhau) trong

mềm Ascent Software để vẽ đường cong biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và

độ hấp thu của các chất hiệu chuẩn có nồng độ biết trước với trục tung là mật độ quang và hoành độ biểu diễn trị số logarit thập phân về nồng độ của các giếng hiệu chuẩn Từ đó giúp tính toán nồng độ của chất AFP, beta-hCG và uE3 có trong các mẫu huyết thanh, chứng nội và ngoại kiểm tra Độ độ lặp lại trong một lần thử nghiệm cũng như trong các lần thử nghiệm khác nhau đạt kết quả tốt với hệ số biến thiên CV < 10%

Các thông số đánh giá nguy cơ mang thai hội chứng Down trong dân số Bảng 4 Giá trị trung vị của các thông số sàng lọc

Tuổi thai (tuần)

AFP (IU/mL)

Free beta hCG (ng/mL)

Free oestriol (ng/mL)

Số trường hợp

Tuổi thai (tuần)

AFP (IU/mL)

Free beta hCG (ng/mL)

Free oestriol (ng/mL)

Số trường hợp

AFP, beta hCG tự do và Oestriol tự do

Bảng 5 Các thông số của phương trình hồi quy số mũ

Các

thông số

AFP IU/mL

Free beta

hCGng/mL

UE3 ng/mL

Hình 2 Đường cong biểu thị phương trình hồi qui của beta hCG tự do theo

tuổi thai qua phương trình y=2.50103 + exp (7.88208+(0.331365)*x) r = 0.99567

n = 1448

Hình 3 Đường cong biểu thị phương trình hồi qui của uE3 theo tuổi thai

số mũ Bio = a + exp ( b + c x GA), trong đó GA là tuổi của thai nhi tính theo tuần, Bio là tương ứng với các giá trị sinh hóa (bảng 1, 2 và 3) Các hình này còn nói lên mối tương quan giữa tuổi thai với các giá trị của từng thông số AFP, b hCG tự do,

và uE3 và biểu thị bằng các hệ số tương quan (r) tương ứng với mỗi thông số Với

AFP và uE3, nồng độ của các thông số này tăng dần theo tuổi thai, còn với b hCG thì ngược lại, giảm dần theo tuổi thai

Vì việc đánh giá nguy cơ mang thai bị hội chứng Down của mỗi thai phụ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi, nồng độ của các thông số sinh hóa và các tình trạng bệnh lý của thai phụ, trong đó mỗi yếu tố lại thể hiện một đơn vị tính khác nhau, nên để thống nhất tất cả các yếu tố nguy cơ đơn lẻ lại tạo thành một yếu tố nguy cơ duy nhất cho mỗi thai phụ khi làm xét nghiệm sàng lọc, nhiều chương trình phần mềm tính nguy cơ đã ra đời, trong đó đa số các phần mềm tính nguy cơ đều sử dụng thuật toán phân phối Gaussian đa biến do Ward và cộng sự

đề ra

Đơn vị tính toán chung được đưa ra là giá trị MOM (multiple of median) hay còn gọi là bội số trung vị MOM của từng thông số là tỉ lệ giữa nồng độ của từng thông số sinh hóa của mỗi thai phụ và giá trị trung vị tương ứng của thông số

đó trong dân số thai phụ bình thường theo tuần tuổi thai Việc sử dụng MOM là do nồng độ của các thông số sinh hóa xác định trong máu thai phụ thay đổi theo từng tuần tuổi thai và cần phải tiêu chuẩn hóa các phương pháp đo lường để có thể cho

ra một cách tính kết quả thống nhất và cung cấp cho mỗi thai phụ một khả năng tính theo tỉ lệ có thể mang thai bị dị tật, từ đó giúp các bác sĩ có hướng tư vấn di truyền cho thai phụ Như vậy, giá trị MOM phản ánh nồng độ các thông số sàng lọc của từng thai phụ so với giá trị chung trong dân số thai phụ bình thường có cùng tuổi thai[17]

Anh hưởng về cân nặng của thai phụ khi tính nguy cơ

Tuỳ theo tuần tuổi thai, các giá trị MOM của tất cả các thông số sinh hoá của mỗi thai phụ đều được hiệu chuẩn dựa trên cân nặng của họ

Bảng 6 Giá trị trung vị của các thông số sinh hoá thay đổi theo cân nặng

Free beta hCG (MOM)

Free oestriol (MOM)

Số trường hợp

Sử dụng phần mềm Statistica để tính phương trình hồi qui tuyến tính Bio =

a + b x MW với MW= trọng lượng thai phụ và Bio= giá trị của thông số sinh hóa (tính theo MOM) của 1432 thai phụ có cân nặng từ 40 đến 62kg

Giá trị MOM chịu ảnh hưởng của một số yếu tố mà trong đó nổi bật là trọng lượng của thai phụ (bảng 3.6) Sử dụng phần mềm Statistica để xác định mối liên quan tuyến tính Bio = a + b x MW với MW là trọng lượng thai phụ và Bio là giá trị của các thông số sinh hóa tính theo MOM

Qua hình 4, 5, 6 chúng tôi thấy có mối tương quan rõ rệt giữa cân nặng của thai phụ và nồng độ của các thông số dấu ấn sinh hóa tính theo MOM Vì vậy cần phải có một yếu tố hiệu chỉnh về trọng lượng trong quá trình đánh giá nguy cơ của hội chứng Down Yếu tố này là giá trị nghịch đảo của phương trình tuyến tính trên

vì cân nặng càng tăng thì nồng độ của các thông số sinh hóa sẽ càng giảm, hiện tượng này được giải thích là do hiện tượng pha loãng máu ở những thai phụ có cân nặng quá mức, nếu không được hiệu chỉnh về mặt trong lượng, số thai phụ này có

tỉ lệ sàng lọc dương tính cao bất thường[8]

Hình 4 Biểu thị phương trình hồi qui của AFP theo cân nặng của thai phụ

với AFP=2.1734 – 0.224*Weight và r = -0.7929, n = 1432

Hình 3.1.8 Biểu đồ tính hCG tự do không theo phân phối Gaussian (trên)

va phân phối Gaussian log 10 (MOM) (dưới)

Hình 5 Biểu thị phương trình hồi qui của $hCG tự do theo cân nặng của thai phụ với free $hCG = 1.3437 - 0.0086*weight và r=-0.8169 n=1432

Với số lượng mẫu nghiên cứu 1432 trường hợp thai phụ có cân nặng từ 40 đến 62kg, hệ số tương quan giữa cân nặng và giá trị MOM của các thông số sinh hóa mới đạt được r = -0.7929 cho AFP, r = -0.8169 cho beta hCG tự do và r = -