Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh là gây nên tỷ lệ chết khá cao và có thể gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi trong thời gian ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh
Trang 1LỜI CẢM TẠ
Xin tạc dạ ghi lòng công lao biển trời của cha mẹ đã sinh thành và nuôi nấng tôi Tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường
ThS Nguyễn Thái Thủy, ThS Phan Thị Ngọc Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp
TS Phạm Hùng Vân, chị Phạm Thanh Thùy Trang, chị Võ Thị Thanh Thảo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tại công ty Nam Khoa
TS Nguyễn Hữu Thịnh đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kiến thức quý báu
Ban Giám đốc công ty Nam Khoa và quý Thầy Cô, cán bộ công chức trẻ Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp
Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ sinh học khóa 27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian thực tập
Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 08 năm 2005
Phạm Thị Mỹ Hạnh
iii
Trang 2TÓM TẮT
PHẠM THỊ MỸ HẠNH, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM
SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR”.
Hội đồng hướng dẫn:
ThS PHAN THỊ NGỌC THỦY
ThS NGUYỄN THÁI THỦY
Đề tài “Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú
(Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” được thực hiện tại Công Ty Nam
Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05 Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú Virus này gây dịch bệnh ảnh hưởng
nghiêm trọng đến sản lượng tôm sú nuôi (Penaeus monodon) trên thế giới và ở nước
ta Sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú
ở các giai đoạn nuôi nhằm phát hiện nhanh, chính xác; định lượng WSSV trên các mẫu tôm sú; góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát dịch bệnh đốm trắng
Những kết quả đạt được:
Xác định được quy trình ly trích ADN phù hợp cho phản ứng Real – time PCR
và Non Stop Nested PCR
Ứng dụng thành công phương pháp Real - time PCR để phát hiện và định lượng
số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú
Xác định khả năng định lượng chính xác của phương pháp Real – time với độ lặp lại cao
Xác định được độ nhạy của phương pháp Real - time PCR so với Non Stop Nested PCR
Ứng dụng Real - time PCR để phát hiện và định lượng WSSV trên 30 mẫu tôm
sú thu từ thực tiễn ở các giai đoạn nuôi, có 22 mẫu bị nhiễm WSSV từ rất nhẹ đến nặng và 8 mẫu âm tính về bệnh đốm trắng
Bước đầu đánh giá về khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV
iv
Trang 3PHAM THI MY HANH, Nong Lam University August, 2005 “DETECTION AND QUANTIFICATION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) IN BLACK
TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) BY USING REAL – TIME PCR”.
Guidance council:
Ms PHAN THI NGOC THUY
Ms NGUYEN THAI THUY
Thesis “Detection and Quantification of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in
Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) by Using Real - time PCR” was carried out in
Nam Khoa company and at Chemical & Biological Analysis and Experiment Center of Nong Lam University from March 1st, 2005 to August 1st, 2005 The object of the thesis is White Spot Syndrome Virus (WSSV) in black tiger shrimp This virus has caused an epidermic viral disease outbreak occurred on cultured black tiger shrimp
(Penaeus monodon) which had caused severe economic losses to the shrimp
production in Vietnam and around the world Using Real – time PCR for detection and quantification WSSV in cultured black tiger shrimp at all stages aims to rapidly, precisely detect and quantify WSSV in cultured black tiger shrimp in order to prevent the occurrence and outspread of the disease outbreak
My obtained results include:
An appropriate DNA extraction protocol for Real - time PCR and Non Stop Nested PCR reactions
Successful application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in black tiger shrimp
Capacity of precise WSSV quantification of Real - time PCR with highly repeated results
Comparision the sensitivity of Real - time PCR with Non Stop Nested PCR
Application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in 30 collected samples of cultured black tiger shrimp at all stages The result indicated that there are 22 samples infected with WSSV from very light to severe infection and 8 samples uninfected with WSSV
Preliminary evaluation of the success of cultured ponds stocked with WSSV infected shrimp seeds or cultured shrimp infected with WSSV
v
Trang 4MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các hình xii
Danh sách các bảng xv
1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon) 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2.Vùng phân bố 3
2.1.3 Chu kỳ sống 4
2.2 Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam 5
2.2.1 Trên thế giới 5
2.2.2 Ở Việt Nam 5
2.3 Bệnh đốm trắng trên tôm 7
2.3.1 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 7
2.3.1.1 Định danh và phân loại 7
2.3.1.2 Đặc điểm hình thái 8
2.3.1.3 Đặc tính sinh học 8
2.3.2 Vật chủ mang mầm bệnh WSSV 9
2.3.3 Các con đường lây truyền WSSV 9
2.3.4 Cơ chế xâm nhập 10
2.3.5 Triệu chứng của bệnh 10
vi
Trang 52.3.6 Phương pháp chẩn đoán 11
2.4 Phương pháp PCR và các cải tiến 12
2.4.1 Phương pháp PCR 12
2.4.1.1 Nguyên tắc 12
2.4.1.2 Các thành phần của phản ứng PCR 13
2.4.1.3 Các bước phản ứng 13
2.4.1.4 Ứng dụng 14
2.4.1.5 Ưu và nhược điểm 14
2.4.2 Kỹ thuật Nested PCR 15
2.4.2.1 Nguyên tắc 15
2.4.2.2 Ưu và nhược điểm 16
2.4.3 Kỹ thuật Real - time PCR 16
2.4.3.1 Lịch sử phát triển 16
2.4.3.2 Khái niệm 17
2.4.3.3 Nguyên tắc 17
2.4.3.4 Hệ thống Real - time PCR 17
2.4.3.5 Phương pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR 18
2.4.3.6 Nguyên lý định lượng của kỹ thuật Real - time PCR 22
2.4.3.7 Ưu và nhược điểm 23
2.4.3.8 Ứng dụng 23
3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25
3.1.1 Thời gian thực hiện 25
3.1.2 Địa điểm thu mẫu 25
3.1.3 Địa điểm phân tích mẫu 25
3.2 Nội dung nghiên cứu 25
3.3 Nguyên vật liệu 25
3.3.1 Mẫu xét nghiệm 25
3.3.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 26
3.3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 26
3.3.2.2 Hoá chất 27
vii
Trang 63.4 Phương pháp nghiên cứu 28
3.4.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu 28
3.4.2 Ly trích mẫu 28
3.4.2.1 Pha dung dịch tách chiết 28
3.4.2.2 Tiến hành ly trích 29
3.4.3 Tiến hành thực hiện Real - time PCR 30
3.4.3.1 Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR 30
3.4.3.2 Thiết lập chương trình thực hiện Real - time PCR trên phần mềm máy iCycler iQ 30
3.4.3.3 Chạy Real - time PCR 31
3.4.3.4 Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính 31
3.4.4 Thực hiện Non Stop Nested PCR 33
3.4.4.1 Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop Nested PCR 33
3.4.4.2 Thiết lập chương trình thực hiện Non Stop Nested PCR trên phần mềm của máy iCycler 33
3.4.4.3 Chạy Non Stop Nested PCR 33
3.4.4.4 Điện di và phân tích kết quả 34
3.4.5 Cách đọc kết quả 36
3.4.5.1 Real - time PCR 36
3.4.5.2 Non Stop Nested PCR 39
3.5 Bố trí thí nghiệm 40
3.5.1 Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 40
3.5.2 Thí nghiệm 2: sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV 41
3.5.3 Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR 42 3.5.4 Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR
viii
Trang 7và Non Stop Nested PCR 43
3.5.5 Thí nghiệm 5: ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế 43
3.5.6 Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra 44
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1 Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 45
4.2 Kết quả sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV 46
4.3 Kết quả khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR 53
4.4 Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR 57
4.5 Kết quả ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế 60
4.6 Kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra 67
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70
5.1 Kết luận 70
5.2 Đề nghị 70
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72
7 PHỤ LỤC 75
Phụ lục A TRỌNG LƯỢNG MẪU LY TRÍCH 75
Phụ lục B HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU THÔ KẾT QUẢ CHẠY REAL – TIME PCR VÀ NON STOP NESTED PCR 76
Phụ lục C CÁC THUẬT TỪ THƯỜNG DÙNG TRONG REAL – TIME PCR 88
Phụ lục D CÁC BƯỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ 90
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ix
Trang 8DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT
ADN: acid deoxyribonucleic
KHCN: Khoa học Công nghệ
NTTS: nuôi trồng Thủy sản
Copy number: số bản sao
Correlation coefficient: hệ số tương quan (r2)
Ct: threshold cycle: chu kỳ ngưỡng - chu kỳ ở đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền
Cycle: chu kỳ
Log starting quantity: log số lượng bản sao ban đầu
MK: thang ADN chuẩn (ADN marker)
N/A: not available: kết quả âm tính, không xác định
PCR baseline subtracted CF RFU: nồng độ huỳnh quang đo được trong suốt phản ứng PCR khi đã trừ tín hiệu nền
PCR efficiency: hiệu quả phản ứng PCR
PL: Postlarvae – hậu ấu trùng tôm
SD: standard deviation: độ lệch chuẩn
Slope: độ nghiêng
Std: standard: chuẩn
SQ: starting quantity: số lượng bản sao ban đầu
Unknown: mẫu cần kiểm tra (các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu nằm trên đường chuẩn)
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG ANH
x
Trang 9bp: base pair
CCD: charge coupled device
dNTP: 2’ – deoxynucleoside – 5’ - triphosphate
EDTA: ethylen diamine tetraacetic acid
FAO: Food and Agriculture Organization
FRET: fluorescence resonance energy transfer
MBV: Monodon Baculovirus
PCR: polymerase chain reaction
RFU: relative fluorescence unit
SDS: sodium dodecyl sulfate
Taq: Thermus aquaticus
TE: tris EDTA
UNG: uracil N – glycosylase
UV: ultraviolet
WSSV: White Spot Syndrome Virus
DANH SÁCH CÁC HÌNH
xi
Trang 10HÌNH TRANG
Hình 2.1 Vòng đời tôm sú Penaeus monodon 4
Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dưới kính hiển vi điện tử 8
Hình 2.3 Virus nhuộm âm ở trong huyết tương của tôm sú nhiễm bệnh WSSV, một số thể virus có đuôi 8
Hình 2.4 Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng WSSV trong ao nuôi 10
Hình 2.5 Tôm sú bị bệnh đốm trắng dạt vào bờ và chết 11
Hình 2.6 Vỏ đầu ngực tôm bị bệnh đốm trắng 11
Hình 2.7 Nguyên tắc của Nested PCR 15
Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR 17
Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR 18
Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đôi 19
Hình 2.11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe 20
Hình 2.12 Nguyên tắc của FRET probe 21
Hình 2.13 Nguyên tắc của TaqMan probe 22
Hình 3.1 Máy ly tâm và vortex mixer 26
Hình 3.2 Máy nhiệt khô 26
Hình 3.3 Máy iCycler 26
Hình 3.4 Bộ kit Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm 27
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ 36
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 37
Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR 40
Hình 3.8 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 41
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 1 và 2 45
Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú 46 Hình 4.3 Kết quả kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR của 12 mẫu
xii
Trang 11tôm sú 47
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 3 mẫu tôm sú 49
Hình 4.5 Kết quả Non Stop Nested PCR của 3 mẫu tôm sú 49
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 12 mẫu tôm sú 50
Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 3 mẫu tôm sú 52
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 53
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 54
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 55
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 56
Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 10-1 đến 10-8 58
Hình 4.13 Kết quả kiểm tra Non Stop Nested PCR ở các nồng độ pha loãng của mẫu nhiễm WSSV 59
Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế 61
Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế 62
Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo 63
Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo 64
Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại 65
Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại 66
SƠ ĐỒ
xiii
Trang 12Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase 14
Sơ đồ 3.1 Quy trình thực hiện Real - time PCR 32
Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR 35
DANH SÁCH CÁC BẢNG
xiv
Trang 13BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng 8
Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR 39
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra WSSV trên 12 mẫu tôm sú 48
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú 50
Bảng 4.3 Số bản sao ban đầu trung bình của 12 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 51
Bảng 4.4 Số bản sao ban đầu trung bình của 3 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 52
Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại 54
Bảng 4.6 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 7 sau 3 lần lặp lại 57
Bảng 4.7 Kết quả chạy Real - time PCR và Non Stop Nested PCR trên mẫu tôm nhiễm WSSV ở các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 60
Bảng 4.8 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình của 10 mẫu tôm thu thực tế 62
Bảng 4.9 Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo 64
Bảng 4.10 Số chu kỳ ngưỡng và số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại 66
Bảng 4.11 Bảng kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra 68
xv