Bệnh do sán lá lớn ở gan là bệnh phổ biến ở trâu bò và các động vật khác như dê, cừu. Bệnh có khả năng lây truyền qua người do ăn rau sống mọc dưới nước có chứa nang trùng. Có hai loại sán lá lớn ở gan là Fasciola gigantica và Fasciola hepatica.
Trang 1LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng thành, đời đời nhớ ơn công lao sinh thành, dưỡng dục và tất
cả những gì ba mẹ đã dành cho con để con có được như ngày hôm nay
Với tất cả lòng kính trọng, em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã giảng dạy và truyền thụ kiến thức cho em trong suốt bốn năm học qua
Con xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS TSKH Nguyễn
Lê Trang - người thầy hết sức tận tâm hướng dẫn, dạy dỗ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại Viện Pasteur
Em xin chân thành cảm ơn TSKH Nguyễn Ngọc Hải - Giảng viên Khoa Chăn Nuôi - Thú Y đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận
Em xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Thị Nguyệt Thu, CN Đỗ Thị Châm,
CN Võ Thị Mỹ Duyên, chị Thêm, chị Sim và đặc biệt là CN Dương Ngọc Diễm phòng Miễn Dịch, Viện Pasteur đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên ủng
hộ tinh thần cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận
Trong lúc thực hiện đề tài này, chúng tôi có được sự giúp đỡ rất tận tình của
GS BS Trần Vinh Hiển và PGS TS Trần Thị Kim Dung, Bộ môn Ký Sinh Trùng đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur - Thành phố Hồ Chí Minh đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại Viện
Tôi xin cảm ơn các bạn lớp DH01SH - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã gắn bó và giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm học qua
SV: Nguyễn Thị Quỳnh Nga
Trang 2TÓM TẮT KHÓA LUẬN
NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “THU THẬP DỊCH TIẾT TỪ FASCIOLA GIGANTICA VÀ SỬ DỤNG LÀM KHÁNG NGUYÊN TRONG CHẨN ĐOÁN”
Hội đồng hướng dẫn:
PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG
TSKH NGUYỄN NGỌC HẢI
Bệnh sán lá gán lớn ở trâu bò và các động vật nhai lại khác như dê, cừu là một trong những nguyên nhân gây tổn thất kinh tế trong ngành công nghiệp chăn nuôi Ngoài ra, bệnh còn gặp ở người với những triệu chứng lâm sàng không rõ ràng nên gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh Trước những yêu cầu cấp thiết như vậy, được sự đồng ý của Viện Pasteur TPHCM và trường đại học Nông Lâm TPHCM, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu thập dịch tiết từ
Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán”
Các kết quả thu được:
Số lượng sán thu thập cho nghiên cứu là 17 con và 80 ml dịch tiết Xác định được nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn bằng phương pháp Bradford
Xác định được thành phần protein trong dịch tiết bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 12%
Dùng phương pháp Ouchterlony, sử dụng protein tiết từ sán làm kháng nguyên, phát hiện kháng thể ở huyết thanh bệnh nhân
Tạo giá sắc ký ái lực Sepharose 4B – protein(s) tiết để tinh chế kháng
thể đặc hiệu ở huyết thanh người nhiễm sán Fasciola sp.
Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân
nhiễm sán lá gan lớn
Sử dụng kháng thể tinh chế qua sắc ký ái lực miễn dịch để chế tạo hệ thống thử nghiệm phát hiện kháng nguyên
ii iv
Trang 3MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các bảng viii
Danh sách các hình ix
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích của đề tài 2
1.3 Yêu cầu 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu sán lá gan và bệnh do sán lá gan lớn gây nên 3
2.2 Vòng đời của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 3
2.3 Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 5
2.4 Tác hại của bệnh do sán lá lớn ở gan 6
2.4.1 Ở gia súc 6
2.4.2 Ở người 7
2.5 Chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn 8
2.5.1 Ở gia súc 8
2.5.2 Ở người 9
2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học 11
2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch 11
2.6.2 Hoạt động protease 12
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 3.1 Thời gian và địa điểm 13
3.2 Vật liệu 13
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 13
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 13
3.2.2.1 Thiết bị 13
3.2.2.2 Dụng cụ 14
3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch 14
3.3 Phương pháp 17
3.3.1 Quy trình lấy mẫu 17
3.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp đo mật độ quang OD280 17
3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford 18
3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Fasciola gigantica 21
3.3.5 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony 26
Trang 43.3.6 Quy trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch để tinh chế kháng thể đặc
hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn 27
3.3.7 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc trong phân bệnh nhân 28
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được xác định bằng phương pháp Bradford 31
4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn 31
4.3 Kết quả khuếch tán miễn dịch Ouchterlony kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó 33
4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân 33
4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết 35
4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng phương pháp ELISA 35
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO .38
PHỤ LỤC 41
ii vi
Trang 5DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ELISA Enzyme Linked Immunospecific Assay Thử nghiệm miễndịch
cộng hợp enzyme
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Trang 6DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.3.3 – Tổ chức thực hiện đường chuẩn protein theo nồng độ BSA 20 Bảng 3.3.4 – Cách chuẩn bị một gel polyacrylamide 12%T 24 Bảng 3.3.7 – Bố trí hệ thống ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong
huyết thanh bệnh nhân 29 Bảng 4.6 – Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng
hệ thống ELISA 3 5
ii viii
Trang 7DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 – Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 4
Hình 2.2 – Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 6
Hình 2.5.1 – Trứng sán lá gan lớn (Fasciola sp) 8
Hình 2.5.2.1 – Hình chụp CT bệnh nhân bị nhiễm sán lá gan lớn 10
Hình 2.5.2.2 – Hình chụp siêu âm của bệnh nhân nhiễm sán lá lớn ở gan 10
Hình 3.3.2 – Biểu đồ quang học máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – VIS) 18
Hình 3.3.3 – Cấu trúc hóa học của Coommassie Brilliant Blue G-250 19
Hình 3.3.4.1 – Các thành phần được sử dụng để tạo gel polyacrylamide 22
Hình 3.3.4.2 – Phản ứng chuỗi đa phân hóa acrylamide 22
Hình 3.3.4.3 – Phản ứng tạo liên kết chéo nối hai sợi đa phân acrylamide 23
Hình 3.3.5 – Phân tích kết quả từ các miễn dịch khuếch tán kép trên thạch agarose (Ouchterlony) 26
Hình 3.3.7 – Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên 28
Hình 4.2.1 – Kết quả điện di để xác định trọng lượng phân tử của các protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn 31
Hình 4.2.2 – Đồ thị tuyến tính giữa đường di chuyển của các protein chuẩn và trọng lượng phân tử 32
Hình 4.3 – Kết quả miễn dịch khuếch tán kép phát hiện kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân 33
Hình 4.5 – Tinh chế kháng thể qua sắc ký ái lực dùng Sepharose – 4B cộng hợp với protein tiết từ Fasciola gigantica 34
Hình 4.6.1 – Đồ thị hệ thống ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân 35 Hình 4.6.2 – Đồ thị biểu hiện sự biến động của kháng nguyên tuần hoàn trong máu
Trang 8iix