Để có thể đề ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với những giống hiện có. Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện có.
Trang 1LỜI CẢM ƠN
Tất cả những gì con có được ngày hôm nay và sẽ có được trong tương lai đều bắt nguồn từ công lao sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ - những người chỉ
vì con mà đã phải chịu bao vất vả, gian nan Con xin thành kính ghi khắc trong lòng con trọn đời công ơn cha mẹ để trên đường đời con luôn sống tốt và có ý nghĩa hơn như những gì mà cha mẹ đã dạy dỗ Anh hai cũng gửi lời cảm ơn đến hai em gái đã lo lắng và giúp đỡ anh trong suốt quá trình làm đề tài tốt nghiệp.
Em xin chân thành gửi lòng biết ơn đến:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
Ban Giám Đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM.
Ban Chủ nhiệm và các Thầy – Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
cô Trần Thị Dung – Chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh học và cô Trần Thị Kim Linh – Chủ nhiệm lớp Công Nghệ Sinh Học 27.
Đã chăm lo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập tại Trường và trong suốt thời gian hoàn thành đề tài
Em xin trân trọng biết ơn đến:
Thầy TS Bùi Minh Trí – giáo viên hướng dẫn đề tài.
Các anh chị: chị Liên, chị Huệ, chị Hưng, anh Thế, chị Phương, chị
Hà, anh Toàn ở TT Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh – Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM.
Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp.
iii
Trang 2Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến những người nông dân tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện điều tra và thu thập mẫu lá điều
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những người bạn cùng lớp với tôi đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường và thời gian làm đề tài tốt nghiệp Chúc các bạn đạt được những điều mà mình ước mơ
Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005
Nguyễn Quỳnh Anh
iv
Trang 3TÓM TẮT
NGUYỄN QUỲNH ANH, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9/2005,
“BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ
ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ
THUẬT RAPD VÀ AFLP”
Giảng viên hướng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ
Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là cây điều hiện đang được trồng tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Cây điều là một loại cây công nghiệp quan trọng của Việt Nam Để
có thể đề ra một chiến lược phát triển cây điều lâu dài đem lại lợi ích kinh tế cao, phải
có những chương trình bảo tồn, phổ biến những giống điều tốt, thích nghi trên diện rộng và lai tạo những giống điều có chất lượng ưu việt so với các giống hiện có Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện
có Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RAPD và AFLP để bước đầu đánh giá mức độ
đa dạng di truyền của quần thể điều đang được canh tác trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu
Các kết quả đạt được:
Thu thập được 80 mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật (về năng suất, đặc điểm thực vật học,…) trên địa bàn toàn tỉnh
Thực hiện tách chiết DNA 80 mẫu lá, kết quả thu được 50 mẫu DNA có chất lượng đạt yêu cầu để thực hiện kỹ thuật RAPD
Thực hiện phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 với 50 mẫu DNA, kết quả có 41 mẫu thực hiện thành công Nhận diện được 11 band, trong đó có 3 band đồng hình và 8 band đa hình Những band đồng hình có độ dài khoảng 550 base pairs,
900 base pairs và 1050 base pairs có thể là những band đặc trưng của cây điều khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 Những band đa hình có độ dài
v
Trang 4khoảng 600 base pairs, 700 base pairs, 750 base pairs, 1.200 base pairs, 1.400 base pairs, 1.600 base pairs, 1.900 base pairs và 2.300 base pairs, trong đó band 600 base pairs và 700 base pairs khá đặc biệt, có thể được nghiên cứu thêm và sử dụng như là chỉ thị phân tử của những tính trạng đáng quan tâm Qua kỹ thuật RAPD đánh giá tính
đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình
Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP trên DNA lá điều, chúng tôi chọn được 4 tổ hợp primer phù hợp:
- MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI +
AGG (Green) cho 36 band, trong đó có 1 band đồng hình và 35 band
đa hình Chúng tôi nhận thấy có 7 band có thể là chỉ thị phân tử
- MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI +
ACG (Green) cho 14 band, trong đó có 1 band đồng hình và 13 band
đa hình Có 2 band có thể là chỉ thị phân tử
vi
Trang 5MỤC LỤC
Trang tựa ii
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt v
Mục lục vii
Danh sách các từ viết tắt xiii
Danh sách các bảng xv
Danh sách các hình xvii
Chương 1: GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2
1.2.1 Mục tiêu 2
1.2.2 Yêu cầu 2
1.3 Hạn chế của đề tài 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1 Giới thiệu chung về cây điều 4
2.1.1 Nguồn gốc cây điều 4
2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây điều 4
2.1.2.1 Thân và cành cây 4
2.1.2.2 Hệ rễ 4
2.1.2.3 Lá 5
2.1.2.4 Hoa và quả điều 5
vii
Trang 62.1.3 Đặc điểm sinh thái của cây điều 6
2.1.3.1 Khí hậu 6
2.1.3.2 Đất đai 7
2.1.3.3 Mật độ trồng 7
2.1.4 Giống điều và các phương pháp nhân giống 7
2.1.4.1 Đặc điểm thực vật học của các giống điều 7
2.1.4.2 Phương pháp nhân giống cây điều 8
2.1.5 Sản xuất điều trên thế giới 8
2.1.6 Sản xuất điều ở Việt Nam 10
2.1.7 Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 14
2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 15
2.2.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử 15
2.2.1.1 Chỉ thị hình thái 16
2.2.1.2 Chỉ thị allozyme 16
2.2.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA 16
2.2.2 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 17
2.2.3 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 17
2.2.4 Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites) 17
2.2.5 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 18
2.2.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA 18
2.2.6.1 Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD 19
2.2.6.2 Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD 22
viii
Trang 72.2.6.3 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 22
2.2.6.4 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 22
2.2.7 Kỹ thuật AFLP 23
2.2.7.1 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 23
2.2.7.2 Các bước của kỹ thuật AFLP 24
2.2.7.3 Những ưu điểm của kỹ thuật AFLP 27
2.2.7.4 Những hạn chế của kỹ thuật AFLP 27
2.2.7.5 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 27
2.2.8 So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 28
2.2.9 Kỹ thuật PCR 28
2.2.9.1 Nguyên lý của kỹ thuật PCR 28
2.2.9.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR 30
2.2.9.3 Tối ưu hoá phản ứng PCR 31
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
3.1 Vật liệu 33
3.1.1 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 33
3.1.1.1 Nguyên liệu 33
3.1.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 33
3.1.2 Hóa chất cần thiết 33
3.1.2.1 Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều 33
3.1.2.2 Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD 35
3.1.2.3 Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP 35
ix
Trang 83.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 36
3.1.3.1.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết và kiểm tra DNA 36
3.1.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD 36
3.1.3.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP 37
3.2 Phương pháp nghiên cứu 37
3.2.1 Phần thu thập mẫu 37
3.2.1.1 Phương pháp chọn mẫu 37
3.2.1.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 38
3.2.2 Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 38
3.2.2.1 Phương pháp tách chiết và kiểm tra DNA lá điều 39
3.2.2.2 Kỹ thuật RAPD 40
3.2.2.3 Kỹ thuật AFLP 43
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48
4.1 Phần điều tra và thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 48
4.2 Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 50
4.2.1 Kết quả tách chiết DNA 50
4.2.1.1 Kết quả chung 50
4.2.1.2 Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều 50 4.2.2 Kết quả thực hiện kỹ thuật RAPD, bước đầu
đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nhận diện
x
Trang 9một số band có thể là chỉ thị phân tử 52
4.2.2.1 Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác giả nước ngoài 52
4.2.2.2 Kết quả thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hóa chất như thí nghiệm 1 53
4.2.2.3 Kết quả thí nghiệm 3: Tăng số chu kỳ lên 37 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hóa chất như thí nghiệm 1 54
4.2.2.4 Kết quả thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất, thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ 55
4.2.2.5 Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD 56
4.2.2.6 Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD 61
4.2.2.7 Phân tích kết quả phản ứng PCR – RAPD bằng phần mềm NTSYS 61
4.2.2.8 Đánh giá đa dạng di truyền 62
4.2.2.9 Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 79
4.2.2.10 Hạn chế của kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD 71
4.2.3 Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 72
4.2.3.1 Kết quả cắt giới hạn và gắn adapter 72
4.2.3.2 Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc 72
4.2.3.3 Kết quả thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc 73
4.2.3.4 Phân tích kết quả AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 74
xi
Trang 104.2.3.5 Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD 78
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79
5.1 Kết luận 79
5.1.1 Phần thu thập mẫu 79
5.1.2 Phần tách chiết DNA 79
5.1.3 Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử 79
5.1.3 Phần kỹ thuật AFLP 80
5.2 Đề nghị 80
5.2.1 Về phương hướng phát triển canh tác cây điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 80
5.2.2 Về những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều 81
Tài liệu tham khảo 82
Phụ lục 1: Mẫu phiếu điều tra nông dân
Phụ lục 2: Danh sách các hộ được khảo sát
Phụ lục 3: Danh sách các mẫu tách được DNA
Phụ lục 4: Danh sách các mẫu thực hiện phản ứng PCR – RAPD
Phụ lục 5: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả PCR – RAPD
Phụ lục 6: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả AFLP 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45
Phụ lục 7: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả AFLP 4 mẫu TT1, TT31,CD40, M78
xii
Trang 11DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFLP: Amplifed fragment length polymorphism
A: Nucleotide có gắn base adenine
T: ………thymine
G: ………guanine
C: ………cytosine
bp: Base pairs – những cặp base trong chuỗi DNA
BR: Thị xã Bà Rịa
CTAB: Hexadecyltrime-thylammonium-bromide
CNSL: Cashew nut shell liquid
ctv: cộng tác viên
CIA: Chloroform-isoamylalcohol
CD: Huyện Châu Đức
ĐC: Đối chứng
DNA: Desoxyribose Nucleic Acid
dNTPs: Những loại Deoxyribose Nucleotide Triphosphate (A, T, G, C) ĐVT: Đơn vị tính
EB: Extraction buffer – dung dịch ly trích DNA
EDTA: Erhylenediamine-tetra acetate
g: Gram
LD: Huyện Long Điền
mM: Mili Mol
xiii
Trang 12ng: Nanogram.
NT: nghiệm thức
OD: Optical density
PCR: Polymerase Chain Reaction
Pimer F: Forward primer – primer xuôi
Primer R: Reverse primer – primer ngược
RFLP: Restriction fragment length polymorphisms RAPD: Random amplified polymorphic DNA SSR: Simple sequences repeat (Microsatellites) SSCP: Single – strand conformation polymorphism STS: Sequence – tagged sites
Ta: Nhiệt độ bắt cặp của primer vào DNA khuôn TAE: Tris – Acetate – EDTA
TE: Tris – EDTA
Tm: Nhiệt độ nóng chảy của primer
TT: huyện Tân Thành
U: Unit
XM: huyện Xuyên Mộc
μl : Microlitre.l : Microlitre
μl : Microlitre.M: Micro Mol
xiv
Trang 13DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Sản xuất nhân hạt điều của thế giới niên
vụ 1997 và 2000 – 2001 9
Bảng 2.2 Tình hình sản xuất, xuất nhập khẩu nhân điều của Việt Nam 11
Bảng 2.3 Thị phần xuất khẩu nhân điều của Việt Nam 3 năm 2000, 2001 và 2002 12
Bảng 2.4 Tình hình phát triển sản xuất điều tại Việt Nam dự kiến đến năm 2010 13
Bảng 2.5 Sản lượng điều tại tỉnh BR – VT phân theo đơn vị hành chính 14
Bảng 2.6 Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA 21
Bảng 2.7 Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc 25
Bảng 2.8 Những primer MseI nhân bản chọn lọc 26
Bảng 2.9 So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 28
Bảng 3.1 Thành phần và cách pha EB 34
Bảng 3.2 Thành phần và cách pha TE 1X 34
Bảng 3.3 Các primer sử dụng cho kỹ thuật PCR – RAPD 40
Bảng 3.4 Thí nghiệm 1 41
xv
Trang 14Bảng 3.5 Thí nghiệm 2 41
Bảng 3.6 Thí nghiệm 3 42
Bảng 3.7 Thí nghiệm 4 43
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản tiền chọn lọc 45
Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản chọn lọc 47
Bảng 4.1 Kết quả thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 48
Bảng 4.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD 56
Bảng 4.3 Các band đa hình và mối liên quan với các đặc điểm của cây lấy mẫu 60
Bảng 4.4 Kết quả thực hiện AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 74
xvi
Trang 15DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 19
Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 23
Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR 30
Hình 4.1 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi trưởng thành 50
Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi còn non 51
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD primer 11 của thí nghiệm 1 53
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 2 với primer 11 (A) và primer 2 (B) 53
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 3 với primer 11 (C) và primer 2 (D) 54
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 4 với primer 11 (E) và (F) 55
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT1 – TT13 57
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT14 – TT25 57
xvii
Trang 16Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD
các mẫu từ TT27 – XM79 58
Hình 4.9A Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27– CD53 58
Hình 4.9B Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD các mẫu từ XM61 – XM79 59
Hình 4.10 Màn hình phát hiện band các kết quả PCR – RAPD 59
Hình 4.11 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với các mẫu thu được tại huyện Châu Đức 62
Hình 4.12 Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Châu Đức 63
Hình 4.13 Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Xuyên Mộc 64
Hình 4.14 Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Tân Thành 64
Hình 4.15 Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu 65
Hình 4.16 Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho năng suất cao 66
Hình 4.17 Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho hạt to 67
Hình 4.18 Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm ra hoa nhiều 68
Hình 4.19 Cây di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 70
Hình 4.20 Kết quả phản ứng cắt và gắn adapter 72
Hình 4.21 Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc 73
xviii