Đề tài được thực hiện trên nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm có thể gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau., ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng.
Trang 1Lời Cảm Tạ
Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ suốt đời dạy dỗ, tận tuỵ vì con cho con có được ngày hôm nay
Chân thành cám ơn:
Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học trường đại học Nông Lâm thành phố
Hồ Chí Minh
Các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi kiến thức quí giá trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này
Trân trọng biết ơn cô Từ Thị Mỹ Thuận đã hết lòng tận tuỵ và động viên tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện khoá luận này
Chân thành cảm ơn thầy Bùi Minh Trí , và các anh chi thuộc trung tâm phân tích
đã tân tình giúp tôi trong quá trình hoàn thành khoá luận này
Cảm ơn tấc cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này
Thủ Đức, ngày 08 tháng 08 năm 2005
Người thực hiện
Lê Tuấn Kiệt
Trang 2TÓM TẮT
LÊ TUẤN KIỆT, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh , tháng 9/2005
“BƯỚC ĐẦU ĐỌC TRÌNH TỰ VÙNG rDNA-ITS CỦA NẤM Rhizoctonia solani
KUHN”
Giáo viên hướng dẫn
Th.S TỪ THỊ MỸ THUẬN
Đề tài được thực hiện trên nấm Rhizoctonia solani Đây là nấm có thể gây bệnh
trên nhiều loại cây trồng khác nhau., ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng Chúng tôi bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm này để bổ sung them thong tin về quần thể nấm này ở nước ta làm cơ sở cho việc phát triển các chương trình lai tạo thích hợp cho các vùng sinh thái riêng biệt Đề tài được thực hiện tại phòng Bệnh cây khoa Nộng Học và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm, Tp
Hồ Chí Minh, từ 01/03/2005 đến 30/08/2005
Nội dung nghiên cứu
• Thu thập các mẫu thực vật bệnh ở nhiều tỉnh và phân lập nấm R solani.
• Nuôi cấy sinh khối các dòng nấm đã phân lập được
• Li trích DNA các dòng nấm trên
• Tiến hành phản ứng PCR với DNA vừa li trích trên vùng ITS của rDNA
sử dụng hai mồi (primer) ITS4 và ITS5
• Đọc trình tự vùng rDNA – ITS với hai primer ITS1 và ITS4
Kết quả thu đư ợc
• Thu thập và phân lập được 20 dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều mẫu thực vật bệnh do nấm này gây ra
• Cải thiện được qui trình li trích DNA của nấm R solani bằng cách thêm
một khâu khử protein DNA tổng số thu được có thể sử dụng cho phản ứng PCR mà không cần xử lí Rnase cho 20 dòng nấm này
• Chọn được thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng
rDNA-ITS của nấm R solani.
• Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của 2 dòng nấm R
Solani là BV-62-03 và SR-650
Trang 3Mục lục
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Mục viết tắt viii
Danh sách các bảng ix
Phần I Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 1
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Giới hạn đề tài 2
Phần II Tổng quan tài liệu 2.1 Nấm Rhizoctonia solani 3
2.1.1 Vị trí phân loại 3
2.1.2 Đăc điểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani 3
2.1.3 Đặc điểm sinh lí 3
2.1.4 Phổ kí chủ của nấm Rhizoctonia solani 4
2.1.5 Sự xâm nhiễm và khả năng gây bệnh 5
2.2 Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 5
2.2.1 Giới thiệu kĩ thuật PCR 5
2.2.2 Qui trình 5
2.2.2.1 Biến tính 5
2.2.2.2 Giai đoạn lai 6
2.2.2.3 giai đoạn kéo dài 6
Trang
Trang 42.2.3.1 DNA khuôn (template) 6
2.2.3.2 Enzyme 7
2.2.3.3 Primer 7
2.2.3.4 Ion magnesium 8
2.2.4 Ứng dụng của kĩ thuật PCR 8
2.3 Đọc trình tự (sequencing) 9
2.3.1 Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật sequecing 9
2.3.2 Các phương pháp sequencing 9
2.3.2.1 Phương pháp Maxam và Gilbert (phương pháp hóa học) 9
2.3.2.2 Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger 11
2.4 Vùng ITS (internal transcribed spacer) của rDNA 13
2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 14
2.5.1 Nghiên cứu trong nước 14
2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 14
Phần III Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.2.Phương pháp 16
3.2.1 Lấy mẫu và phân lập 16
3.2.2 môi trường phân lập nà nuôi cấy 16
3.2.3 Nuôi thu sinh khối 17
3.2.4 Li trích DNA 17
3.2.5 Phản ứng PCR 18
3.2.6 Sequencing 19
Phần IV Kết quả vào thảo luận 4.1 Phân lập mẫu 21
4.2 Li trích DNA 22
4.3 Phản ứng PCR 24
4.4 Đọc trìmh tự 26
Trang 5Phần V Kết luận và đề nghị
1 Kết luận 34
2 Đề nghị 34
Phần VI Tài liệu tham khảo 1 Tiếng Việt 35
2 Tiếng Anh 35
3 Internet 37
Phần VII Phụ lục Phụ lục 1 38
Phụ lục 2 39
Phụ lục 3 40
Phụ lục 4 41
Trang 6Các mục viết tắt
DNA : deoxynucleic acid
PCR : polymerase chain reaction
RFLP Restriction fragment length polymorphism
ITS : internal transcribed spacer
PGA : potato glucose agar
PDA : potato dextrose agar
PGB : potato glucose broth
dNTP: deoxynucleotide triphophate
A : Adenine
T : Thiamine
G : Guanine
C :Cytosine
Mg2+ : ion magnesium
RAPD : Random amplified polymorphism DNA
RE : Restriction Endonuclease
M : methylase
Nu : nucleotide
U : unit (đơn vị quốc tế)
µl : microlit
ng : nanogram
pmol : picomol
ctv: cộng tác viên
Trang 7Danh sách các hình và các bảng
Hình 1 Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert 10
Hình 2 Lược đồ phương pháp đọc trình tự của Sanger 12
Hình 3 Lược đồ công thức của dNTP và ddNTP 12
Hình 4 Lược đồ đoạn ITS – rDNA và các primer 13
Hình 5 DNA tổng số li trích theo qui trình của Lee và Taylor 22
Hình 6 DNA tổng số li trích theo theo qui trình của Lee và Taylor cải tiến 23
Hình 7 DNA tồng số sau khi pha loãng chuẩn bị cho phản ứng PCR 24
Hình 8 Sản phẩm PCR có nồng độ primer là 1µM (1 pmol/µl) 24
Hình 9 Sản phẩm PCR có nồng độ primer là 0,4µM (0,4 pmol/µl) 25
Hình 10.Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03……… 27
Hình 11 Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 28
Bảng 1: Thành phần của phản ứng PCR 18
Bảng 2: Qui trinh nhiệt của phản ứng PCR 18
Bảng 3: Danh sách các dòng nấm R Solani nghiên cứu 21