Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp.
Trang 1LỜI CẢM TẠ
CHÚNG TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN
Công ty Bio – Rad đã tài trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này
CHÚNG TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này
Thầy Trần Nhật Phương đã giúp đỡ chúng tôi rất nhiều về kinh phí và hóa chất
để thực hiện đề tài này
Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh
Chị Phan Thị Thu Hiền đã tận tình chỉ dạy chúng tôi các thao tác, kĩ năng phòng thí nghiệm
Anh Nguyễn Đức Thành và anh Phương (Trung tâm Y Tế Quận 9) đã nhiệt tình chỉ dẫn chúng tôi trong kỹ thuật rửa phim X- quang
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp
đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập
Trang 2TÓM TẮT
LÊ MINH KHA, NGUYỄN VĂN LẪM, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2005 “THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT”
Giảng viên hướng dẫn:
TS LÊ ĐÌNH ĐÔN
Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên
vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được thực hiện theo qui trình của Kurt Weising và
ctv (1995) và qui trình của kit Gene Image AlkPhos Direct Labelling and Detection System Amersham Qui trình trải qua các giai đoạn từ bước chuẩn bị mẫu lai như tăng sinh vi khuẩn; ly trích genomic DNA; thực hiện phản ứng cắt; điện di chuyển lên màng
và làm khô màng đến tạo được phân tử đánh dấu từ sản phẩm PCR của gen phlD sau khi
đã được tinh sạch bằng phương pháp cắt gel, cuối cùng thực hiện phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X-ray Với kết quả đạt được là:
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn
- Đánh dấu probe từ sản phẩm PCR trên cặp primer B2BF, BRR4
- Thiết lập được phản ứng lai và cho phát hiện kết quả lai trên phim X – ray Tuy nhiên, đề tài vẫn chưa được hoàn thiện trên các mẫu là genomic DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn
Tóm lại, chúng tôi đã thiết lập được qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens nhưng vẫn chưa hoàn thiện được qui trình ở mức genomic DNA Kết quả này là cơ sở ban đầu trong việc hoàn thiện phương pháp lai phân tử để
phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật
MỤC LỤC
Trang 3Trang Trang tựa
Lời cảm tạ i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt vi
Danh mục các hình vii
Danh mục các bảng ix
Phần 1 MỞ ĐẦU 1
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU – PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT 3
2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp Southern blot 3
2.2 Nguyên tắc của phương pháp Southern blot 4
2.3 Một số ứng dụng của phương pháp Southern blot 4
2.4 Sự khác nhau giữa Southern blot, Northern blot, và Western blot 5
2.5 Một số phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn 5
2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS 6
2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB 7
2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel TM (Jones và Bartlet, 1990) 8
2.6 Một số phương pháp định tính và định lượng DNA 9
2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế 9
2.6.2 Điện di (Electrophoresis) 10
2.6.3 Định lượng DNA bằng phân tử Mass 11
2.7 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme) 12
2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn 12
2.7.2 Các loại enzym giới hạn 13
2.7.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn 13
2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng 15
2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 15
2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA Polymerase .16
2.8.2 Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense định cư trong đất và trong vùng rễ cây trồng 16
2.9 Phương pháp tinh sạch DNA 17
Trang 42.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol 17
2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX 17
2.10 Các phương pháp chuyển DNA lên màng 19
2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer) 19
2.10.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống (Downward Capillary Transfer) 21
2.10.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều (Simultaneous Transfer to Two Membranes) 21
2.10.4 Phương pháp chuyển bằng điện (electrophoresis transfer) 22
2.10.5 Phương pháp chuyển bằng chân không 23
2.11 Đánh dấu probe 24
2.11.1 Tác nhân đánh dấu 24
2.11.1.1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ 24
2.11.1.2 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ 25
2.11.2 Phương pháp đánh dấu 29
2.11.2.1 Phương pháp nick – translation 29
2.11.2.2 Phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên) 30
2.11.2.3 Phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi) 32
2.11.2.4 Phương pháp photobiotin 32
2.12 Các phương pháp lai phân tử 35
2.12.1 Cơ sở của sự lai phân tử 35
2.12.1.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA 35
2.12.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA 36
2.12.1.3 Khái niệm về lai phân tử 37
2.12.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử 37
2.12.2 Các kiểu lai phân tử 37
2.12.2.1 Lai trong pha lỏng 37
2.12.2.2 Lai trên pha rắn 38
2.12.2.3 Lai tại chổ (in situ hybridization) 39
Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .40
3.1 Thời gian và địa điểm 40
3.2 Nội dung nghiên cứu 40
3.3 Phương pháp nghiên cứu 40
Trang 53.3.1 Vật liệu thí nghiệm 40
3.3.2 Phương pháp tiến hành 43
3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB 42
3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 42
3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass 45
3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng ezyme giới hạn 46
3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR trên hai cặp primer B2BF, BRR4 48
3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel 50
3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4 51
3.3.2.8 Tạo mẫu lai 52
3.3.2.9 Lai Southern 55
Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57
4.1 Kết quả tăng sinh, ly trích và định lượng DNA 57
4.1.1 Kết quả ly trích genomic DNA 57
4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ 58
4.1.3 Kết quả định lượng bằng phân tử Mass 59
4.2 Kết quả phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn 59
4.3 Kết quả phản ứng PCR với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b 61
4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel 62
4.5 Kết quả lai Southern 63
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69
5.1 Kết luận 69
5.2 Đề nghị 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 75
Phụ lục 1 77
Phụ lục 2 79
Phụ lục 3 82
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Trang 6bp: base pair
DANH SÁCH HÌNH
Trang 7Hình 2.1Thang chuẩn về nồng đô của phân tử Mass 10
Hình 2.2 Sự mao dẫn hướng lên 20
Hình 2.3 Sự mao dẫn hướng xuống 21
Hính 2.4 Sự mao dẫn hai chiều 22
Hình 2.5 Phương pháp chuyển bằng điện 23
Hình 2.6 Phương pháp chuyển bằng chân không 23
Hình 2.7 Phản ứng khởi động của chemiluminescence 26
Hình 2.8 Cấu trúc của digoxigenin- 11- dUTP 28
Hình 2.9 Cấu trúc của biotin và hai thể đồng phân của biotin nucleotide, biotin- 7- dATP và biotin- 14- dATP 28
Hình 2.10 Đánh dấu probe bằng phương pháp nick translation 29
Hình 2.11 Đánh dấu DNA bằng phương pháp random priming 30
Hình 2.12 Đánh dấu “end labelling” dùng enzym polynucleotide kinase (PNK) 32
Hình 2.13 Cấu trúc của photobiotin acetate 34
Hình 2.14 Sự tạo liên kết giữa nucleic acid và tác nhân đánh dấu (biotin) tại vị trí N-7 của purine 33
Hình 2.15 Cơ chất chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase 35
Hình 3.1 Qui trình cho một thử nghiệm Southern blot 43
Hình 3.2 Tổ hợp 6 gen sinh tổng hợp chất 2,4 – DAPG 49
Hình 3.3 Hệ thống mao dẫn chuyển DNA lên màng Hybond N chưa hoàn chỉnh 53
Hình 3.4 Hệ thống chuyển DNA lên màng Hybond N hoàn chỉnh 53
Hình 3.5 Đánh dấu bề mặt chứa DNA của màng Hybond N 54
Hình 3.6 Làm khô màng Hybond N bằng tủ sấy ở 65 oC 54
Hình 3.7 Để màng Hybond N vào máy GS Gene Linker TM UV chuẩn bị xử lý UV 54
Hình 3.8 Phản ứng lai trong buồng lai HB – 1000 Hybridizer ở 55 oC 55
Hình 4 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường LB ở nhiệt độ 27oC 57
Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng Pseudomonas fluorescens khác nhau 58
Hình 4.3 Kết quả định lượng mẫu 130 bằng phân tử Mass 59
Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzym giới hạn 60
Trang 8Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b 61
Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28, 9, 13120, 154 bằng phương pháp cắt gel 62
Hình 4.7 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, thời gian ủ 30 phút 64
Hình 4.8 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút 64
Hình 4.9 Kết quả thí nghiệm 2 66
Hình 4.10 Kết quả lai ở nhiệt độ 48oC 67
DANH SÁCH BẢNG
Trang 9Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot, Northern blot và Western
blot 5
Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass 10
Bảng 2.3 Một số enzyme thường sử dụng và các trình tự đặc hiệu 15
Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR 16
Bảng 2.5 Phương pháp đánh dấu không phóng xạ và hệ thống phát hiện dùng cho oligonucleotide 31
Bảng 3.1: Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 25 µl 47
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl 47