Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp.
Trang 1Phụ lục 2 CÁCH PHA HÓA CHẤT
1 Dung dịch chuyển: 20X SSC (NaCl 3M; Natri citrate 0,3 M; pH 7,0)
Hòa tan 175,3 g NaCl và 88,2 g Na citrate trong 800 ml nước cất Điều chỉnh
pH đến 7,0 bằng NaOH 10 N Thêm nước lên đến 1000 ml Vô trùng bằng autoclave Với những nồng độ SSC khác nhau, hòa tan SSC 20X với lượng nước thích hợp
2 Dung dịch biến tính: NaCl 1,5 M; NaOH 0,5 N.
Hòa tan hoàn toàn 20 g NaOH và 87,7 g NaCl trong 800 ml nước cất Thêm nước lên đến 1000 ml
3 Dung dịch trung tính: Tris-HCl 1 M; NaCl 1,5 M; pH 7,0.
Hòa tan hoàn toàn 121,1 g Tris - HCl và 87,7 g NaCl trong 800 ml nước cất Điều chỉnh pH đến 7,5 bằng HCl Thêm nước lên đến 1000 ml
4 Dung dịch lai (hybridization buffer)
Thêm 14,5 g NaCl và 20 g blocking reagent vào 500 ml đệm lai Thêm blocking reagent một cách từ từ Khuấy dung dịch ở nhiệt độ phòng khoảng 1 – 2 giờ trên máy khuấy từ Dung dịch có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản ở khoảng - 15oC đến - 30oC
5 Dung dịch rửa 1
Thành phần Nồng độ cuối
SDS 1 g 0,1 % (g/v)
Na phosphate 0,5M; pH 7,0 100 ml 50 mM NaCl 8,7 g 150 mM MgCl2 1M 1 ml 1 mM Blocking reagent 2 g 0,2 % (g/v) Các thành phần trên được hòa tan trong 1000 ml nước cất Dung dịch này có thể bảo quản 1 tuần ở 2oC – 8oC
Trang 26 Dung dịch rửa 2
Thành phần nồng độ cuối
Tris base 121 g 1 M NaCl 112 g 2 M
Pha dung dịch 20X
Hòa tan 121 g Tris base và 112 g NaCl trong 800 ml nước cất Điều chỉnh pH đến 10,0 Thêm nước lên đến 1000 ml Dung dịch này có thể giữ trong 4 tháng ở nhiệt độ
2oC – 8OC
Pha loãng dung dịch rửa 2 đến nồng độ sử dụng
Pha loãng dung dịch 20X xuống 20 lần và thêm 2 ml MgCl2 1 M vào dung dịch Dung dịch này sử dụng ngay không được bảo quản
7 Dung dịch rửa phim
Dung dịch developer
Thành phần: dung dịch A (5 lít), dung dịch B (1 lít), dung dịch C (475 ml)
Cách pha: cho 12 lít nước vào thùng chứa lớn, thêm từ từ dung dịch A vào, vừa cho vừa khuấy đều khoảng 5 phút, cho tiếp dung dịch B và dung dịch C vào (thực hiện tương tự như dung dịch A) Thêm nước vào hỗn hợp trên để đạt thể tích 20 lít
Dung dịch fixer
Thành phần: dung dịch A (5 lít), dung dịch B (950 ml)
Cách pha: cho 12 lít nước vào thùng chứa lớn, thêm từ từ dung dịch A vào, vừa cho vừa khuấy đều khoảng 5 phút, cho tiếp dung dịch B Thêm nước vào hỗn hợp trên để đạt thể tích 20 lit
8 Pha Natri phosphate 0,5 M
Cân 13,8 g NaH2PO4 .H2O trong 200 ml nước Điều chỉnh pH đến 7,0 bằng NaOH
9 Pha MgCl 2 1 M
Hòa tan 1,9 g MgCl2 trong 10 ml nước cất
10 Tris – HCl 1,0 M stock solution
Hòa tan 6,055 g Tris - HCl trong 40 ml nước Điều chỉnh pH 7,5 bằng HCl Điều chỉnh thể tích lên 50 ml
11 EDTA 0,5 M stock solution
Trang 3Thêm vào 9,305 g Na2EDTA 2H2O trong 40 ml nước Khuấy trộn mạnh Điều chỉnh
pH 8,0 bằng NaOH (khoảng 1 g) Điều chỉnh thể tích lên 50 ml
12 TE: Tris 10 mM, EDTA 1 mM , pH 8,0
Trộn 10 ml của Tris – HCl 1 M stock solution (pH 8,0), 2 ml của EDTA 0,5 M stock solution, và 988 ml nước
13 NaOH 5 M
Hòa tan 2 g NaOH trong 10 ml nước, khuấy cho tan hết
14 HCl 5 M
Hòa tan 1,875 g HCl trong 10 ml nước, khuấy cho tan hết
15 TAE 0,5 X
Cần sử dụng 5 lít, cần 50 ml TAE 50X
16 Ethidium Bromide
Hút 7.5 µl ethidium hòa tan trong 300 ml TAE 0,5X
17 NaOH 50 mM, NaCl 0,1 M
Thêm vào 5 ml NaOH 10 N trong 800 ml nước Sau đó thêm vào 5,85 g NaCl Điều chỉnh thể tích lên 1 lít
18 NaOH 0,4 N, SDS 0,1 %
Trộn 40 ml NaOH stock solution 10 N, 10 ml SDS 10 %, và 950 ml nước
19 Tris 0,2 M, SSC 0,1X
Trộn 200 ml Tris – HCl (pH 7,5) stock solution 1M, 5 ml SSC 20X, và 795 ml nước
20 EDTA 2 mM, SDS 0,1 %
Trộn 4 ml EDTA 0,5 M, 10 ml SDS 10 %, và 986 ml nước