Nghiên cứu ảnh hưởng của axit phytic đang được đánh giá toàn diện, nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con người, dinh dưỡng động vật, quản lý dinh dưỡn sản phẩm nông nghiệp.
Trang 1LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học
Các Thầy cô trong và ngoài Trường Đại Học Nông Lâm
Các anh chị trong bộ môn Di Truyền và Chọn Giống Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long
Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong thời gian em học tập tại trường
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:
TS Nguyễn Thị Lang- Trưởng bộ môn Di Truyền và Chọn giống- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp
đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa luận
TS Trần Thị Dung- Trưởng bộ môn Công Nghệ sinh Học trường Đại Học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này
Thạc sĩ Nguyễn Thanh Xà, Cử Nhân Đỗ Đức Tuyến , kỹ sư Trịnh Hoàng Khải đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận
Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm
Thủ Đức, ngày 15 tháng 08 năm 2005
iii
Trang 2TÓM TẮT
LÊ CÔNG THIỆN, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG
VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE”
Hội đồng hướng dẫn:
TS NGUYỄN THỊ LANG
TS TRẦN THỊ DUNG
Axit phytic còn được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphate và là hợp chất dự trữ photpho chính của thực vật Axit phytic được xem là nhân tố đối kháng dinh dưỡng bởi vì nó có thể liên kết với nhiều ion kim loại như Zn, Fe, Ca, Mg và gây ra sự thiếu khoáng ở người và gia súc
Năm trăm dòng lúa đột biến OM1490, OMCS2000 thế hệ M3, lúa mùa và lúa cao sản được phân tích để xác định những dòng lúa có hàm lượng axit phytic thấp bởi phương pháp sinh hóa
Bốn mươi dòng đột biến OM1490 thế hệ M4 cũng được phân tích sinh hóa
để xác định tính trạng axit phytic theo phương pháp sinh hóa
Phân tích bằng marker SSR qua phản ứng PCR với marker RM 207 đối với các dòng axit phytic thấp thuộc quần thể lúa mùa và lúa cao sản
Phân tích bằng marker SSR qua phản ứng PCR với marker RM 207 đối với
40 dòng đột biến OM1490 thế hệ M4
Kết quả phân tích sinh hóa cho thấy:
Tìm được 19 dòng lúa axit phytic thấp thuộc quần thể đột biến OM1490 thế
hệ M3 và 5 dòng lúa axit phytic thấp thuộc quần thể OMCS2000 thế hệ M3
Tìm được 2 giống lúa là nếp Trung Quốc và Tám Xoan biểu hiện tính axit phytic thấp trong 20 cá thể phân tích
iv
Trang 3Tìm được 6 giống biểu hiện tính axit phytic như: OM 2490, OM 4498 , OM
2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7, DS 2002 trong 130 giống lúa cao sản
Tìm được 9 cá thể trong 40 dòng đột biến OM1490 thế hệ M4 có biểu hiện tính trạng axit phytic thấp
Kết quả phân tích bằng marker phân tử:
Xác nhận lại được tính trạng axit phytic trong phân tích kiểu hình qua phân tích kiểu gen Ghi nhận có sự đa hình giữa cá thể có hàm lượng axit phytic thấp và axit phytic cao Kết quả cũng ghi nhận một số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp qua phân tích sinh hóa nhưng không ghi nhận qua phân tích bằng marker
Qua kết quả của khóa luận này giúp phần nào phát triển dòng lúa giàu dinh dưỡng
v
Trang 4Topic: Evaluating the phytic acid content in some mutant and local rice lines
by bio-chemical and microsatellite method.
Done by student: Lê Công Thiện
Advisor:Dr Nguyễn Thị Lang and Trần Thị Dung
Phytic acid is the myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphosphate and the major storage compound of phosphorus in plants Phytic acid is considered the anti-nutrional factor because it can bind to many ions such as Zn, Fe, Ca and causes mineral deficiency in human and animals
Five hundreds mutant lines of OM1490 , OMCS2000 M3 (the third generation), reasonal rice and high quality rice have been analyzed to determine the low phytic acid lines by biochemical method The result showed that there were 19 lines of 185 lines of OM 1490 and 5 lines of 165 lines of OMCS 2000 had low phytic acid trait In reasonal rice and local rice we found that there were two lines having the low phytic acid in reasonal rice and 6 lines of local rice having the low phytic acid trait Analysis with marker RM 207 showed that Tám xoan, OM
2718, OM 4498 having the low phytic acid trait OM1490 and OMCS2000 mutant lines, M3 were not identified by SSR marker due to DNA template problems
Forty (40) lines of OM 1490 M4 were also analyzed using both biochemical and microsatellite method In analysis of 40 lines OM 1490 M4 using the bio-chemical method, we found that there were 9 lines having the low phytic acid trait And the following analysis using SSR marker with marker RM 207, the result showed that there were 6 lines of OM 1490 population M4 having the low phytic acid trait in marker analysis We also found out that the marker RM 202 was able
to create the polymorphism among the mutant lines There were 3 lines having the low phytic acid trait in bio-chemical analysis but they didn’t show the low phytic acid trait in marker analysis All low phytic acid lines were then grown in the nethouse in order to be analyzed in the following generation
Our findings may help plant breeders to develope the nutritional rice lines
vi
Trang 5MỤC LỤC
Trang bìa i
Trang tựa ii
Lời cảm tạ iii
Tóm Tắt iv
Mục lục vii
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các hình xi
Danh sách các biểu đồ xiii
Danh sách các bảng xiv
1 Lời mở đầu 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2.Mục tiêu đề tài 2
1.3.Yêu cầu đề tài 2
2 Tổng quan tài liệu 3
2.1 Axit phytic 3
2.2 Đặc điểm của axit Phytic và vai trò của nó 4
2.2.1 Axit phytic đối với cây trồng 6
2.2.2 Axit phytic với con người, vật nuôi và môi trường 7
2.2.2.1 Ảnh hưởng của axit phytic đối với con người 7
2.2.2.2 Ảnh hưởng của axit phytic đối với vật nuôi và môi trường 7
2.3 Công nghệ sinh học phân tử trên cây lúa 9
2.4 Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp 11
2.5 Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsattelite) 15
2.6 Quá trình sinh tổng hợp axit phytic 15
3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18
vii
Trang 63.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18
3.2 Vật liệu 18
3.3 Nguồn gốc vật liệu 18
3.4 Dụng cụ và hóa chất 20
3.4.1 Dụng cụ 20
3.4.2 Hóa chất 20
3.4.2.1 Hóa chất phân tích sinh hóa 20
3.4.2.2 Hóa chất phân tích phân tử 20
3.5 Xác định lượng photpho trong hạt bằng phương pháp sinh hoá 21
3.5.1 Phương pháp thực hiện 21
3.5.2 Tiến hành phân tích 22
3.6 Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử 23
3.6.1 Phân lập DNA từ mẫu lá lúa 22
3.6.2 Kiểm tra chất lượng DNA 25
3.6.3 Phân tích SSR 26
3.6.3.1 PCR dùng cho một phản ứng 27
3.6.3.2 Phương pháp tiến hành 27
3.6.3.3 Phân tích mẫu trên gel 28
4 Kết quả và thảo luận 29
4.1 Đánh giá tính trạng axit phytic thấp qua phản ứng sinh hóa 29
4.1.1 Quần thể lúa mùa và lúa cao sản 29
4.1.2 Quần thể lúa đột biến 31
4.1.2.1 Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M3 31
4.1.2.2 So sánh với kết quả ở thế hệ M2 được nghiên cứu trước đây 36
4.1.2.3 Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M4 36
4.2.Đánh giá tính trạng axit phytic thấp bằng Marker SSR 38
4.2.1.Trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản 32
4.2.2 Trên quần thể đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4 40
5 Kết luận và đề nghị 43
viii
Trang 75.1 Kết luận 42
5.2 Đề nghị 44
6 Tài liệu tham khảo 45
6.1.Tài liệu tiếng việt 45
6.2 Tài liệu tiếng nước ngoài 45
Phụ lục 47
ix
Trang 8DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HIP: high inorganic phosphorous
InsP: myo-inositol mono-photphate
InsP2: myo-inositol bis-photphate
InsP3: myo-inositol tris photphate
InsP4: myo-inositol tetrakisphotphate
InsP5: myo-inositol pentakisphotphate
InsP6: myo-inositol hexakisphotphate
PCR : polymerase chain reaction
SSR: simple sequence repeat
P: photpho
K: Kali
Zn: Kẽm
Fe: Sắt
Ca: Canxi
M2, M3, M4: Thế hệ thứ 2, 3,4
MAS: Marker assisted selection
x
Trang 9DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1.Cấu trúc của inositol 3
Hình 2.2 Cấu tạo lập thể của axit Phytic 4
Hình 2.3.Công thức cấu tạo của muối Phytate 4
Hình 2.4 Sơ đồ chu trình photpho trong tự nhiên 8
Hình 2.5 Phân tích bằng phương pháp Northern-blot cây yến mạch 13
Hình 2.6 Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ hoa ở cây yến mạch 14
Hình 2.7 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryot 17
Hình 3.1 Thang photpho chuẩn 22
Hình 3.2 Kết quả DNA đã ly trích được kiểm tra chất lượng 26
Hình 4.1 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị phosphate tự do trên quần thể lúa địa phương và lúa cao sản 29
Hình 4.2 Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do trên quần thê lúa mùa và lúa cao sản 30
Hình 4.3 Kết quả phân tích sự biểu hiện chất chỉ thị photphate tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M3 31
Hình 4.4 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M3 32
Hình 4.5 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M3 32
Hình 4.6 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị Photphat tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M3 33
Hình 4.7 Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M3 34
xi
Trang 10Hình 4.8 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị
photphat tự do thế hệ M4 37
Hình 4.9 Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer
RM 207 trên quần thể lúa mùa và cao sản 39
Hình 4.10 Kết quả phân tích bằng microsatellite với
primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 41
Hình 4.11 Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer
RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 41
Hình 4.12 Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer
RM 207 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 41
Hình 4.13 Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer
RM 207 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M4 42
xii
Trang 11DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1 Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu
hiện tính axit phytic thấp và cao ở giống OM 1490 đột biến
và OMCS 2000 đột biến thế hệ M3 35
Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể hiện phần trăm tính trạng axit phytic thấp
theo 5 mức thuộc quần thể OM 1490 và OMCS 2000 thế hệ M3 35
Biểu 4.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lượng axit phytic thấp
ở M2 và M3 thuộc quần thể OM 1490 36
Biểu đồ 4.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lượng axit phytic thấp
giữa thế hệ M3 và M4 thuộc quần thể đột biến OM 1490 38
Biểu đồ 4.5 Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit thấp
và cao thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M4 38
xiii
Trang 12DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng 5
Bảng 3.1 Tên các giống lúa được phân tích 18
Bảng 3.2 Thành phần các hóa chất trong dung dịch Chen’s 21
Bảng 3.3 Thang photpho chuẩn theo 5 mức 21
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 27
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28
Bảng 4.1.Các cá thể được ký hiệu theo số trong bằng điện di 40
xiv