XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ ppsx

Kết quả: Các mẫu sán lá, sán dây và ấu trùng của chúng được thu thập từ 22 tỉnh ở cả 3 miền trong cả nước đã được giải trình tự v# so sánh với các chuỗi chuẩn.. Mục tiêu nghiên cứu đề tà

Mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định thành phần loài sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam

Phương pháp: sử dụng hệ gen ty thể (cob, cox, nad1) và/hoặc phần giao gen (ITS-2) và 18S ribosome của hệ gen nhân, so sánh với các chủng đã biết của Việt Nam và trên thế giới

Kết quả: Các mẫu sán lá, sán dây và ấu trùng của chúng được thu thập từ 22 tỉnh ở cả 3 miền trong cả nước đã được giải trình tự v# so sánh với các chuỗi chuẩn

Kết luận: loài sán lá phổi được xác định là Paragonimus heterotremus; loài sán lá gan lớn là Fasciola gigantica (có lai với F hepatica); loài sán lá gan nhỏ ở

miền Bắc là Clonorchis sinensis; loài sán lá gan nhỏ ở miền Nam là Opisthorchis viverrini; loài sán lá ruột lớn trên người là Fasciolopsis buski; loài sán lá ruột nhỏ trên người là Haplorchis taichui và H pumilio

ABSTRACT

Common parasitic trematodes such as small liver fluke was determined in more than 24 provinces; giant liver fluke in more than 43 provinces, giant intestinal fluke in more than 16 provinces, small intestinal flukes in more than 15 provinces, lung fluke in more than 10 provinces in Vietnam

Objectives: Used molecular method for identification of species of human Trematode

Methods: molecular method (PCR technique) using mitochondrial genetic markers as cob, cox1, nad1, nuclear markers as ITS-2 and ribosomal 18S rRNA

Results: Adult worms and larvae were collected from 22 provinces in Vietnam were taxonomically identified by the sequence obtained for the above species were compared with those of the known species from different geographical origins in the world

Conclusions: The Vietnamese isolates were identified as Paragonimus heterotremus; Fasciola gigantica (pure and hybrid with F hepatica); Clonorchis

sinensis in the North, Opisthorchis viverrini in the South; Fasciolopsis buski; Haplorchis pumilio; H taichui

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, có trên 40 triệu người nhiễm sán

lá truyền qua thức ăn phân bố ở nhiều nước, đặc biệt ở các nước nhiệt đới(11)

Trong 10 năm gần đây và hiện nay, phương pháp sinh học phân tử dựa vào

kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen nhân và

hệ gen ty thể đang được ứng dụng rộng rãi và có độ tin cậy cao, đặc biệt được coi

là rất có hiệu quả trong giám định và phân loại ký sinh trùng(11)

Tại Việt Nam, bệnh sán lá phổ biến hầu khắp trong cả nước như sán lá gan nhỏ (Clonorchis và Opisthorchis) lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh với tỷ lệ nhiễm, có nơi 37-40% (Nam Định, Hà Tây, Thanh Hoá, Phú Yên)(16); sán lá gan lớn (Fasciola) lưu hành ở ít nhất 43 tỉnh(14,16), có nơi tỷ lệ nhiễm 11,1% (Khánh Hoà)(10); sán

lá phổi (Paragonimus) lưu hành ở ít nhất 9 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 15% (Sơn La)(12,15)

Từ trước đến nay, việc xác định thành phần loài giun sán ở Việt Nam thường dựa vào đặc điểm hình thái học Vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài ký sinh trùng, song vẫn còn

những hạn chế nhất định và chính phân loại bằng sinh học phân tử sẽ khắc phục được những khiếm khuyết đo(5,6)

Do vậy, việc nghiên cứu sinh học phân tử đối với các loài giun sán nói riêng và ký sinh trùng nói chung là hết sức cần thiết ở nước ta hiện nay Mục tiêu nghiên cứu đề tài này là: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR và phân tích chuỗi gen) để xác định thành phần loài của một số loài sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thu thập mẫu

Thu thập mẫu trên người

Sán lá gan, sán lá ruột từ bệnh nhân bằng đãi phân khi điều trị; mẫu sán lá phổi từ đờm bệnh nhân khi điều trị Các mẫu được thu thập từ các địa phương như sau:

Sán lá gan nhỏ tại: Nam Định, Ninh Bình, Hà Tây, Thanh Hoá, Hà Nam, Hoà Bình, Quảng Ninh, Nghệ An, Thừa Thiên- Huế, Quảng Nam, Phú Yên, Bình Định và Đắc Lắc; sán lá phổi tại: Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hoà Bình, Yên Bái; sán lá ruột lớn tại: Nam Định, Ninh Bình, Nghệ An, Thừa Thiên- Huế, Cần Thơ và

An Giang; sán lá ruột nhỏ tại Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng

Thu mẫu từ vật chủ trung gian

ấu trùng sán lá gan từ cá tại Hà Nội, Nam Định; ấu trùng sán lá ruột nhỏ tại Nam Định, Ninh Bình; ấu trùng sán lá phổi thu thập từ cua tại Hoà Bình, Sơn La, Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái theo phương pháp tiêu cơ bằng pepsin acid

Bảo quản mẫu

- Mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý

- Mẫu được cố định trong cồn 70% và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi

sử dụng

Các bước tiến hành kỹ thuật

Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu:

ADN tổng số được tách chiết bằng bộ hoá chất Genomic-Tip Kit hoặc DNeasy hoặc QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất

Mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cồn 70% được lấy ra và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết

Chọn mồi cho phản ứng PCR

Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) hoặc gen cob (cytochrome oxidase b) hoặc nad1 (nicotinamide dehydrogenase subunit 1) là gen ty thể, vùng giao gen ITS-2 (internal transcribed spacer 2) của hệ gen nhân hay gen 18S ribosome được chọn làm đích nghiên cứu

Quy trình phản ứng PCR

ADN đích đã được nhân bản bằng PCR tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega) Chu trình nhiệt của PCR trên máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm các bước như sau: 940C/5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 940C/1 phút, 500C/1 phút và 720C/1 phút; chu kỳ cuối kéo dài

10 phút ở 720C Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) và được dòng hoá vào vector có tên gọi là pCR2.1 hoặc pCR2.1TOPO của bộ hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.) Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào dòng tế bào IVNaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (Sambrook và Russell, 2001) ADN của plasmid có chứa sản phẩm PCR cần nghiên cứu được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN Inc.)(5,7,8)

Trình tự nucleotid của ADN trong plasmid chứa sản phẩm PCR tái tổ hợp được giải trình trên máy tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer của hãng Perkin-Elmer (Mỹ) Chuỗi nucleotid được xử lý bằng chương trình SeqEd1.3; sau

đó so sánh sử dụng chương trình AsemblyLIGN1.9 và MacVector8.2 (Accelrys

Inc.) Trong phân tích phả hệ, tất cả các chuỗi của các chủng chọn lọc trong đó có các chủng của Việt Nam được sắp xếp theo chương trình GENEDOC2.5, sau đó được đưa vào phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA3.1 về thành phần nucleotid và acid amin, sử dụng hệ số tiến hoá thấp ME (minimum evolution index) (Kuma và cs, 2004)

Phương pháp xử lý nucleotid/ chuỗi acid amin và ứng dụng tin-sinh học xử

lý kết quả

Giải trình nucleotid trực tiếp hoặc sau khi dòng hoá, từ ADN của plasmid tái tổ hợp, được thực hiện bằng máy giải trình tự động, xử lý bằng các phần mềm được cung cấp chuyên biệt Giám định chuỗi ADN (gen chẩn đoánểttước hết bằng truy cập Ngân hàng gen (GenBank) bằng chương trình BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul và cs, 1997) Sự đồng nhất giữa

2 hay nhiều chuỗi được thu nhận qua so sánh đa chuỗi (multiple alignment) bằng chương trình ClustalW bố trí sẵn trong hệ chương trình MacVector8.2 Tra cứu so sánh sử dụng các phần mềm có trong các Trung tâm tin-sinh học quốc tế (NCBI = National Centre for Biotechnology Information/USA (http://ww.ncbi.nlm.nih.gov) hay sử dụng một số chương trình đặc biệt có ở ExPASy (http://expasy.ch) Sự sai khác về nucleotid và acid amin dưới 5% thông thường được đánh giá là biến đổi nội loài (intraspecific variation) và 5% trở lên là biến đổi ngoại loài (Interspecific variation) (Blair và Agatsuma, 1993)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả xác định loài sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis

Bảng 1: So sánh nucleotid tại 10 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen cox1 của Clonorchis spp Việt Nam với C sinensis chủng Trung Quốc (CsCN)

Clonorchis ở Quảng Ninh; CsNgNA= mẫu Clonorchis ở Nghệ An; CsNgDN= Đồng Nai; CsMeND= mẫu ấu trùng Clonorchis ở Nam Định; CsMeHNo= mẫu ấu trùng Clonorchis ở Hà Nội

Nhận xét: Trình tự nucleotid của các mẫu Clonorchis spp thu thập từ người

ở Ninh Bình, Nam Định, Thanh Hoá, Bắc Giang, Hoà Bình, Hà Tây, Hà Nam, Quảng Ninh đều giống nhau (tương đồng 100%), chúng đều sai khác với C sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc ở vị trí thứ 69 và 441 (mức độ tương đồng 99,6%) Trong khi đó chủng Clonorchis sp Đồng Nai có mức độ sai khác với chủng C sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc 3 nucleotid (mức độ tương đồng 99,3%); chủng Clonorchis sp Nghệ An có mức độ sai khác với chủng C sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc 4 nucleotid (mức độ tương đồng 99,1%) Trình tự về acid amin của tất cả các chủng C sinensis Việt Nam hoàn toàn giống với C sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc (mức độ tương đồng 100%) Trình tự nucleotid của ấu trùng sán lá gan (metacercaria) từ cá Nam Định và Hà Nội giống nhau và

so với C sinensis của Trung Quốc, Hàn Quốc có sai khác 5 nucleotid (mức độ tương đồng nucleotid là 98,9%) và tương đồng acid amin 100%

Như vậy các mẫu Clonorchis sp thu thập từ người và metacercaria thu thập

từ cá trong nghiên cứu này là C sinensis thuộc họ Opisthorchiidae

Kết quả xác định loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini

Các mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành thu thập từ người tại các địa phương được xác định bằng sinh học phân tử sử dụng chuỗi gen cox1 hệ gen ty thể Trình

tự nucleotid được so sánh với các chuỗi đã biết trước của Thái Lan (chủng Khon Kaen)

Bảng 2: Danh mục các mẫu sán lá gan trưởng thành thu nhận trên người tại Việt Nam sử dụng giám định phân tử trong nghiên cứu

Trình tự nucleotid đoạn gen cox1 với 326 nucleotid của Opisthorchis spp Việt Nam hoàn toàn giống với trình tự của đoạn gen này thu nhận từ loài O viverrini chủng Khon Kaen của Thái Lan (mức độ tương đồng 100%) Điều này khẳng định mẫu sán lá gan nhỏ thu thập từ bệnh nhân ở Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Thừa Thiên-Huế và Đắc Lắc là loài Opisthorchis viverrini thuộc họ Opisthorchidae

Kết quả xác định loài sán lá gan lớn Fasciola

Các mẫu sán lá gan lớn trưởng thành thu thập từ bệnh nhân ở Hà Tây (FspNgHT), Nghệ An (FspNgNA), Bình Định (FgNgBD) và TP Hồ Chí Minh (FspNgHCM) và trên súc vật tại Hoà Bình (FVN1HB), Lai Châu (FVN2LC), Lạng Sơn (FVN3LS); miracidium nở từ trứng trong phân bệnh nhân ở Nghệ An (FspMirNA), ở TP Hồ Chí Minh (FspMirHCM) được xác định loài sử dụng gen nad1 và ITS2 so sánh với Fasciola gigantica chủng Nhật Bản (FgJp), Hàn Quốc (FgKor), Indonesia (FgIndo) Đồng thời so sánh với F hepatica chủng Australia (FhAUS) và Mỹ (FhUS)

Bảng 3: So sánh nucleotid tại 9 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen nad1 của Fasciola spp nghiên cứu với Fasciola gigantica chủng Nhật Bản và Hàn Quốc

Ký hiệu

111 trong chuỗi nad1 Fasciola gigantica Nhật Bản là FG thì trong chuỗi tương ứng chủng Việt Nam là LV hoàn toàn giống với F hepatica, đây là điểm đặc biệt của sán lá gan lớn Việt Nam

Kết quả xác định loài sán lá phổi Paragonimus

Các mẫu sán lá phổi ở Việt Nam bao gồm: sán trưởng thành thu thập từ chó nhiễm tự nhiên tại Lai Châu (PhetLChdog1,2,3), Sơn La(PhetSLdog), Hoà Bình (PspHBdog); mèo gây nhiễm thực nghiệm bằng metacercara lấy từ cua đá tại Sơn

La (PspSLcat), Lào Cai (PspLCacat), Hoà Bình (PspHBcat) và Yên Bái (PspYBcat); mẫu sán trưởng thành thu thập trên người tại Hoà Bình (PspHBHuma); miracidium nở từ trứng trong đờm bệnh nhân ở Yên Bái (PspYB Mira); metacercaria thu thập trên cua đá Potamicus sp tại Sơn La (PspSLcrab), Hoà Bình (PspHBcrab), Lào Cai (PspLCacrab), Yên Bái (PspYBcrab) đều được

áp dụng phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể để phân tích đoạn gen cytochrome oxidase 1 (cox1) gồm 390 cặp nucleotid so sánh với P heterotremus của Thái Lan (PhetTL), Trung Quốc (PhetCN)

Bảng 4: So sánh nucleotid tại 13 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen cox1 của mẫu nghiên cứu với Paragonimus heterotremus Trung Quốc và Thái Lan

Ký hiệu

Nhận xét: Mức độ tương đồng nucleotid của Paragonimus spp ở Việt Nam

so với P heterotremus của Trung Quốc, Thái Lan đạt 99,0-99,7%, trong khi đó chủng PhetCN2 và chủng PhetTL tương đồng với chủng PhetCN1 là 99,0% Mức

độ tương đồng acid amin đạt 100% trong tất cả các mẫu so với loài P heterotremus của Trung Quốc PhetCN1 Như vậy, loài sán lá phổi trưởng thành

trên người, chó, mèo và ấu trùng của nó trên cua ở Việt Nam là Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964

Kết quả xác định loài sán lá ruột lớn Fasciolopsis

Các mẫu sán lá ruột trưởng thành được thu thập ở người tại Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An (miền Bắc), Thừa Thiên-Huế (miền Trung) và Cần Thơ, An Giang (miền Nam) và với mẫu sán lá ruột trưởng thành thu thập từ lợn tại Hà Nội đã được xác định bằng sinh học phân tử với toàn bộ gen 18S ribosome (18S rARN) và vùng phụ cận bao gồm 1950 cặp nucleotid được thu nhận bằng phản ứng PCR và giải trình trình tự để so sánh đối chiếu với dữ liệu hiện có trong Ngân hàng gen (GenBank)

Bảng 5: Danh mục các mẫu sán lá ruột nghiên cứu thu thập trên người

Loài (hình thái)

Ký hiệu mẫu

Nguồn gốc

Trang thái mẫu

Nhận xét: Qua so sánh đối chiếu, sán lá ruột phân lập trên người và lợn ở Việt Nam trong nghiên cứu này đã có hệ số tương đồng về thành phần nucleotid gần như tuyệt đối (1948/1950 nucleotid = 99,99%) của gen 18S rARN Fasciolopsis buski trong Ngân hàng gen (số hiệu: L06668) Như vậy, với 1950 nucleotid thuộc chuỗi gen 18S ribosome của các mẫu sán lá ruột thu thập trên người Việt Nam so sánh với chuỗi lưu trữ trong Ngân hàng gen cho phép xác định sán lá ruột lớn gây bệnh ở người Việt Nam là Fasciolopsis buski và đã được nhập Ngân hàng gen số AY311386, AY618841, AY618842 và AY618843

Kết quả xác định loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis

Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành và metacercaria thu thập trên người tại Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng đã được xác định loài bằng sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền ITS-2 và 18S ribosome, so sánh với mẫu Thái Lan (nhận từ Jitra Waikagul, Đại học Mahidol) Kết quả Haplorchis pumilio Việt Nam có mức độ tương đồng 99-100% nucleotid với H pumilio Thái Lan và 94-99% với một số chuỗi có trong Ngân hàng gen Cũng tương tự, trong số bệnh phẩm thu được ở các địa phương tren, chúng tôi xác định có Haplorchis taichui có tỷ lệ tương đồng 98-99% với H taichui (Thái Lan) Như vậy, trong quần thể heterophid ký sinh ở ruột người và cá ở Việt Nam đã có 2 loài là H pumilio và H taichui đã được xác định bằng sinh học phân tử Độ dài gen ITS-2 của H taichui lớn hơn gen ITS-2 của H pumilio là 154 nucleotid, như nhận xét khi phân tích gen này của Kim Văn Vạn và cs (2007)