NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM TỪ STREPTOMYCES 16.34 ppt

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM TỪ STREPTOMYCES 16.34 TÓM TẮT Mục tiêu: sàng lọc dạng chủng đầu dòng, cải thiện khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và khảo sát các thành p

Trang 1

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM

TỪ STREPTOMYCES 16.34

TÓM TẮT

Mục tiêu: sàng lọc dạng chủng đầu dòng, cải thiện khả năng sinh tổng hợp

kháng sinh và khảo sát các thành phần kháng sinh của chủng Streptomyces 16.34 phân lập được từ cơ chất ở Việt Nam

Phương pháp: sử dụng ISP (International Streptomyces Project) để phân loại Streptomyces 16.34 Khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 được khảo sát bằng phương pháp lên men chìm trên máy lắc

và phương pháp khuếch tán trên khối thạch, giếng thạch và khoanh giấy lọc Phương pháp chiết đơn với các dung môi thích hợp được dùng để chiết xuất kháng sinh, sau đó dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng để khảo sát thành phần kháng sinh

Kết quả: Sàng lọc ngẫu nhiên và sàng lọc sau đột biến cho biến chủng

kháng sinh tăng mạnh Môi trường MT4 dịch thể rất hiệu quả trong kỹ thuật lên men chìm Kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces 16.34 có ít nhất 3 thành phần

Trang 2

khác nhau, có thể được chiết xuất bằng butyl acetat hoặc n-butanol và diệt được 8/10 vi khuẩn cũng như 6/7 chủng vi nấm được thử

Kết luận: chưa xác định chính xác tên khoa học của chủng Streptomyces

16.34, phân lập từ cơ chất Việt nam, dựa trên tiêu chuẩn phân loại ISP nhưng kháng sinh chiết xuất từ xạ khuẩn đã thể hiện vai trò kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả, điều này mang đến hy vọng có thể phát hiện một kháng sinh chống nấm mạnh

ABSTRACT

Objective: to select the isolates, to improve its ability of antibiotic

biosynthesis and to examine the components of antifungal products from Streptomyces 16.34 which has been isolated from substrate in Viet Nam

Methods: Streptomyces 16.34 was classified by using ISP (International

Streptomyces Project) The antibiotic biosynthesis ability of Streptomyces 16.34 was determined by the submerged fermentative method and the agar diffusion method (an agar cut diffusion; well diffusion and disk diffusion) The antifungal agent was extracted by appropriate sovents and then its components were determined by thin layer chromatography

Results: Random selection and selection after mutation product the

mutated isolates having powerfully better antibiotic activity The MT4 broth was

Trang 3

very useful for the submerged culture fermentation The antifungal agent, including at least 3 components, could be extracted from Streptomyces 16.34 by butyl acetate or n-butanol The agent has the activity against 8/10 test bacteria and against 6 over 7 tested fungi

Conclusions: classification according to ISP have not yet determined the

scientific name of Streptomyces 16.34, which was isolated from substrate in Việt Nam However, the antibiotic extracted from Streptomyces 16.34 has shown effectively the antibiotics ability and the antifungal ability It is expected that a strong antibiotic can be developed furthermore

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước đang phát triển lại có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, do

đó, bệnh nhiễm trùng luôn là mối đe dọa nguy hiểm đến sức khoẻ con người Nhưng chính điều kiện khí hậu đó đã tạo ra một quần thể vi sinh vật phong phú,

trong đó phải kể đến chi xạ khuẩn Streptomyces - thuộc lớp phụ (bộ) Actynomycetales - có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng có cấu trúc và

đặc điểm kháng sinh khác nhau, một số loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm(1) Gần đây việc phân lập các chủng Streptomyces đã được tiến hành

trong một số Viện nghiên cứu và Trường Đại học ở nước ta Bài báo này công bố

một số kết quả của đề tài “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm từ

Streptomyces 16.34” về các khía cạnh sau:

Trang 4

- Nghiên cứu sàng lọc dạng chủng đầu dòng và cải thiện khả năng sinh tổng

hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 16.34 phân lập được từ cơ chất Việt Nam

- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh: thành phần môi trường lên men, các điều kiện ngoại cảnh, v.v để cải thiện khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng

- Nghiên cứu chiết xuất kháng sinh, cũng như nghiên cứu các thành phần của kháng sinh

PHƯƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN LIỆU

Chủng xạ khuẩn

Chủng Streptomyces 16.34 do phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, Bộ môn

Vi sinh và Sinh học, trường đại học Dược Hà Nội cung cấp

Giống vi sinh vật kiểm định

Giống VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh và Sinh học cung cấp, bao gồm 5

vi khuẩn Gr (+), 5 vi khuẩn Gr (–) và 7 chủng vi nấm kiểm định

Các môi trường đã sử dụng

- Nuôi cấy xạ khuẩn đã sử dụng các môi trường MT1- MT7 và các biến thể dịch thể (bỏ thạch) từ đấy để lên men sinh tổng hợp kháng sinh (1)

Trang 5

- Phân loại Streptomyces: sử dụng các môi trường ISP1-ISP9 (4)

- Nuôi cấy vi nấm để thử nghiệm trên môi trường Sabouraud

- Nuôi cấy vi khuẩn kiểm định trên môi trường canh thang và thạch thường

Các phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên thạch nghiêng và trong hộp Petri được

sử dụng để nuôi cấy xạ khuẩn, vi khuẩn và vi nấm

- Phân loại Streptomyces 16.34 sử dụng phương pháp phân loại theo ISP

(International Streptomyces Project)(4)

- Phương pháp lên men chìm trên máy lắc được sử dụng để nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh

- Xác định khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces áp dụng

phương pháp khuếch tán sử dụng khối thạch, giếng thạch, và khoanh giấy lọc(1)

- -Chiết xuất kháng sinh sử dụng phương pháp chiết đơn bằng các dung môi thích hợp

- Nghiên cứu thành phần kháng sinh sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng

KẾT QUẢ

Trang 6

Kết quả phân loại ISP theo khoá phân loại ISP

Đã xác định được các đặc trưng phân loại theo khoá phân loại ISP của

Streptomyces 16.34 với các đặc trưng phân loại như sau: Màu sắc của khuẩn ty khí

sinh: xám trắng (WGy), màu sắc của khuẩn ty cơ chất: có (1), sắc tố melanoit: không có (0), hình dạng chuỗi bào tử: móc câu xoắn đơn (RA), bề mặt bào tử: nhẵn (Sm), tiêu thụ D-glucoza: có (+), tiêu thụ inisitol: có (+), tiêu thụ D-xyloza:

có (+), tiêu thụ D-malnitol: có (+), tiêu thụ D-fructoza: có (+), tiêu thụ arabinoza: không (-), tiêu thụ Rafinoza: có (+), tiêu thụ Rhamnoza: có (+), tiêu thụ sacaroza: có (+) Viết ký hiệu tóm tắt như sau: WGy 0 1 RA Sm + + + + + - + + + Tuy nhiên so sánh với danh mục các chủng đã được công bố của ISP không có công bố nào trùng với các kết quả của chúng tôi, do đó chưa xác định được tên

L-khoa học của Streptomyces 16.34 theo ISP

Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 mới phân lập được

Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 trên môi trường MT3 đã cho thấy Streptomyces 16.34 sinh tổng hợp kháng sinh chống lại 8/10 chủng vi khuẩn đã được thử Tiếp tục nuôi cấy Streptomyces 16.34 trên 7

môi trường MT1-MT7 và sau 6 ngày ủ thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh được đánh giá đối với 10 vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp khối thạch Kết quả được giới thiệu ở bảng 1

Trang 7

Bảng 1 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 trên 7

môi trường khác nhau

Đường kính vòng vô khuẩn (mm), s S

M T2

M T3

M T4

M T5

M T6

M T7

cereus

17,62

1,

18

18,43

0,

43

16,04

1,

11

13,94

2,

27

12,61

2,

77

14,63

1,

86

10,21

0,

89

19,26

1,

07

14,41

1,

06

17,47

0,

92

11,72

1,

59

12,56

16,17

14,35

15,93

12,53

13,69

9,

76

Trang 8

M T2

M T3

M T4

M T5

M T6

M T7

0,

62

20,63

0,

21

19,05

4,

80

19,48

0,

75

13,82

0,

87

18,17

1,

12

12,67

1,

09

13,65

0,

68

15,13

1,

06

16,05

1,

78

12,73

1,

43

15,78

0,

60

11,97

Trang 9

M T2

M T3

M T4

M T5

M T6

M T7

1,

20

15,26

1,

02

14,93

0,

46

15,05

2,

25

12,29

2,

35

15,50

Trang 10

M T2

M T3

M T4

M T5

M T6

M T7

Bacillus pumilus ATCC 10241 và Proteus mirabilis BV 108 được sử dụng làm vi

khuẩn kiểm định cho các nghiên cứu về sau

Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên Streptomyces 16.34 được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Trang 11

B pumilus Pro mirabilis

Trang 12

Trang 13

Trang 14

Trang 15

Trang 16

Kết quả đột biến

Tiến hành đột biến các bào tử của dạng chủng 16.34-25 bằng ánh sáng tử ngoại với các tham số: Bước sóng 254 nm, khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút Kết quả sàng lọc sau đột biến được giới thiệu ở bảng 3

m)

Trang 17

Biế

n chủng

D(m m)

Trang 18

Biế

n chủng

D(m m)

Trang 19

Biế

n chủng

D(m m)

Trang 20

Biế

n chủng

D(m m)

Trang 21

Biế

n chủng

D(m m)

Trang 22

Biế

n chủng

D(m m)

Kết quả lên men chìm

Đã tiến hành lên men chìm trong các môi trương dịch thể MT1, MT3 và MT4 Kết quả được giới thiệu ở bảng 4

Bảng 4 Kết quả lên men chìm

Đường kính vòng vô khuẩn (mm) ST

T

Môi trường

B pumillus Pr mirabilis

Gh

i chú

Trang 23

Môi trường MT4 dịch thể cho kết quả tốt nhất

Khảo sát tác dụng của pH lên độ bền của kháng sinh, kết quả (kết quả không được giới thiệu) cho thấy ở pH trung tính kháng sinh là bền nhất

Kết quả chiết xuất kháng sinh

Dịch lọc dịch lên men được chiết bằng các dung môi khác nhau trên các pH khác nhau để chọn dung môi tốt nhất Kết quả được giới thiệu trong bảng 5

Bảng 5 Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ

Trang 24

Kết quả (D - đường kính vòng vô

khuẩn, s) Dung

Bacillus pumillus

Trang 25

Trang 26

Trang 27

Trang 28

Trang 29

Khảo sát tác dụng của nhiệt độ lên kháng sinh cho thấy kháng sinh không

bị mất hoạt tính khi đun cách thuỷ 30 phút và đun sôi 10 phút

Kết quả sắc ký lớp mỏng

Đã tiến hành sắc ký lớp mỏng dịch chiết kháng sinh từ môi trường nuôi cấy

bề mặt trong 3 hệ dung môi chạy có thành phần sau:

Hệ H1: Cloroform: Metanol: NH4OH 25%: 2: 2: 1,

Hệ H2: n-Butanol: Etanol: Dimethylformamid: 3: 1: 1,

Hệ H3: Butylacetat: Aceton: Trietylamin: 1: 2: 1

Các kết quả được giới thiệu trong bảng 6

Trang 30

Kết quả thử kháng sinh chống nấm

Tác dụng chống nấm của kháng sinh do Streptomyces 16.34 tạo ra được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán sử dụng khối thạch đối với Candida albicans, Saccharomyces cerivisiae, Aspergillus niger, Mốc đen sp.1, Mốc đen sp.3, Mốc xanh sp.1, và Mốc xanh sp.2 Kết quả được giới thiệu trong bảng 7

Bảng 7 Kết quả thử tác dụng chống nấm

Trang 31

C albicans S cerivisiae A niger

Trang 32

KẾT LUẬN

Streptomyces 16.34 là xạ khuẩn được phân lập từ cơ chất Việt Nam có tác

dụng kháng sinh rõ rệt đối với 8/10 vi khuẩn thử Tuy nhiên phân loại theo ISP

cho tôi thấy rằng chưa xác định được tên khoa học của Streptomyces này Sàng lọc

ngẫu nhiên và sàng lọc sau đột biến cho biến chủng kháng sinh tăng mạnh Lên men chìm môi trường MT4 dịch thể cho kết quả tốt nhất Sử dụng một số dung môi hữu cơ để chiết kháng sinh thì butyl acetat và n-butanol cho kết quả tốt nhất Sắc ký lớp mỏng cho thấy ít nhất có 3 thành phần kháng sinh Kháng sinh có tác dụng kháng nấm tốt, diệt được 6/7 vi nấm được thử

Tiêu đề	Nghiên Cứu Sinh Tổng Hợp Kháng Sinh Chống Nấm Từ Streptomyces 16.34
Trường học	Trường Đại học Nha Trang
Chuyên ngành	Sinh học Công nghệ và Vi sinh
Thể loại	đề tài khoa học
Năm xuất bản	2023
Thành phố	Nha Trang

Định dạng
Số trang	32
Dung lượng	204,31 KB