GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM pptx

Việc tìm hiểu các nguồn gene kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm là yêu cầu phục vụ cho sử dụng kháng sinh hợp lý.. Mục tiêu nghiê

GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN

GÂY BỆNH PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Vi khuẩn kháng kháng sinh có thể được truyền vào người thông

qua chuỗi thực phẩm Việc tìm hiểu các nguồn gene kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm là yêu cầu phục vụ cho sử dụng kháng sinh hợp lý

Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh và gene kháng

kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm

Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang Mức độ nhạy cảm kháng sinh

của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer Phát hiện nhiều gene kháng thuốc trên một số vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Kết quả nghiên cứu: Mức độ kháng kháng sinh của 156 chủng E coli và 40

chủng Salmonella spp phân lập từ thực phẩm: tỷ lệ kháng với ít nhất 1 kháng sinh (80,1% và 77,5%); tỷ lệ kháng từ 2 kháng sinh trở lên (61,5% và 60%) Tỷ lệ các gene kháng kháng sinh trên 18 chủng E coli và 11 chủng Salmonella spp có cùng

kiểu hình kháng đa kháng sinh (ampicillin- tetracycline–chloramphenicol như sau: E coli {blaTEM (88,9%), sul2 (72,2%), tetA (77,8%), clmA (61,1%), sul1 và tetB (38,9%), blaSHV (16,7%)}; Salmonella spp {blaTEM (90,9%); sul2 (72,7%); tetA, tetB, và sul1 cùng là 63,6%; clmA (45,5%), blaSHV (18,2%)} 7 chủng E coli và 6 chủng Salmonella spp đã không phát hiện được gen mã hóa cho sự kháng chloramphenicol 5 chủng E coli và 2 chủng Salmonella spp có cùng kiểu hình đa kháng (tetracycline - chloramphenicol - SMX-TMP – ampicillin) và mang cùng kiểu gen kháng (blaTEM, sul2, tetA, clmA)

sulfamethoxazole/trimethoprim-Kết luận: Mức độ kháng kháng sinh của E coli và Salmonella spp phân lập

từ thực phẩm là khá cao Trên 18 chủng E coli và 11 Salmonella spp kháng đa kháng sinh đã phát hiện thấy có tỷ lệ cao của các gen blaTEM, sul2 và tetA hơn sul1, clmA

và blaSHV Những vi khuẩn này có thể là mối nguy với sức khoẻ cộng đồng nếu chúng lây truyền qua chuỗi thực phẩm

Tran Thi Ngoc Phuong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 12 - Supplement of

No 4 - 2008: 283 - 290

Bacground: Antibiotic resistance bacteria can be transmitted to human

through food To find out about antibiotic resistance genes as well as mechanisms of

the pathogenous bacteria from food is necessary for using antibiotic

Objectives: The pathogenous bacteria isolate from food was investigated for

its susceptibility to antimicrobial agents and the presence of the antibiotic resistance

genes

* Viện Vệ sinh Y tế Công cộng Tp Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược Tp

Hồ Chí Minh

Methods: A descriptive and cross-sectional study design was applied The

isolates were examined for susceptibility to to antimicrobial agents by Kirby Bauer

method PCR assays were performed to identify the resistance genes

Results: 80.1% of E coli isolates were resistant to at least one antibiotic and

61.,5% were resistant to two or more antibiotic 77.5% of the Salmonella spp were

resistant to at least one antibiotic and 60% were resistant to two or more antibiotic

The incidence of resistance genes of 18 multiple-antibiotic-resistant E coli strains

were detected to blaTEM (88.9%), sul2(72.2%), tetA (77.8%), clmA (61.1%), sul1 (38.9%), tetB (38.9%) and blaSHV (16.7%) The incidence of resistance genes of 11 multiple-antibiotic-resistant Salmonella spp strains were detected to blaTEM (90.9%), sul2 (72.7%), tetA (63.6%), tetB (63.6%), sul1(63.6%), clmA (45.5%) and blaSHV (18.2%) The clmA gene was not found in seven E coli strains and six Salmonella spp strains Five E coli strains and two Salmonella spp strains showed both multiple-antibiotic-resistance phenotype (tetracycline-chloramphenicol-SMX-TMP-ampicillin) and genotype (blaTEM, sul2, tetA, clmA)

Conclusions: The incidence of resistance was observe in food isolates in this

study is high Among multiple-antibiotic-resistant E coli and Salmonella spp strains, the resistance gene to blaTEM, sul2 and tetA was most often observed These organisms may become a public health risk should they enter the food chain

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong hơn hai thập kỷ qua, sự nổi lên và lan truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh đã và đang trở nên là mối nguy lớn với sức khoẻ cộng đồng trên toàn thế giới Do việc sử dụng kháng sinh tràn lan cho động vật (điều trị và phòng ngừa), dùng liều thấp để kích thích tăng trưởng đã tạo một sức ép chọn lọc làm vi khuẩn kháng kháng sinh Mặt khác, do toàn cầu hóa về cung cấp thực phẩm đã làm lan truyền các

vi sinh vật kháng kháng sinh và chúng được lây truyền vào người thông qua chuỗi thực phẩm

Những nhân tố di truyền di động (mobile genetic elements) như plasmid, transposon, và integron có thể lan truyền các gen kháng kháng sinh theo chiều dọc hoặc chiều ngang giữa các vi khuẩn Ðồng thời, các nhân tố này còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển và lan truyền của đề kháng đa kháng kháng sinh ở vi khuẩn Mặt khác, những phân tích phân tử của gen kháng kháng sinh đã cho biết vi khuẩn kháng kháng sinh nhiễm trong thực phẩm không tách biệt khỏi vi khuẩn của người và sự tiếp hợp giữa các vi khuẩn đã làm lan truyền gen kháng kháng sinh(2,11)

Tỷ lệ nhiễm cao của các vi khuẩn gây bệnh trong thịt tươi, sữa và các thực phẩm khác cùng với sự lạm dụng sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp đã làm vấn đề kháng kháng sinh càng trở nên trầm trọng Vấn đề kháng kháng sinh sẽ không được giải quyết nếu có sự lan truyền của các gen kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn ở người thông qua chuỗi thực phẩm

Trong suốt những năm gần đây, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen kháng kháng sinh ở các vi sinh gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm hoặc động vật Còn những nghiên cứu tìm hiểu tính kháng kháng sinh của các vi sinh gây bệnh phân lập từ thực phẩm thì hiếm Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn từ thực phẩm nhưng chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về gen kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn từ thực phẩm.Vì thế, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu: “Khảo sát gen kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm”

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập được

từ thực phẩm

Xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn kháng kháng sinh đã phân lập

Phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng của các vi khuẩn kháng kháng sinh

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang Thời gian nghiên cứu từ 2/2007-12/2007

Ðối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm (pho mai, kem ăn, giò

lụa, nem chua, chả giò, lạp xưởng, rau quả, trứng, thịt và thủy sản tươi ): 156 chủng

E coli và 40 chủng Salmonella spp

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp Kirby-Bauer dùng kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm(1,6)

Phương pháp xử lý và phân tích số liệu bằng phần mềm Epi-Info 6.04

Phương pháp PCR để phát hiện các gen kháng kháng sinh: Từ các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm có kiểu hình kháng kháng sinh đã được xác định, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để xác định các gen kháng kháng sinh Việc khuếch đại các gen kháng kháng sinh mục tiêu dựa trên việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng cho từng gen kháng kháng sinh (bảng 1)

Bảng 1: Trình tự mồi dùng trong khuếch đại các gen kháng thuốc

kháng kháng sinh

Tên mồi

Gen mục tiêu

Kích thước sản phẩm (bp)

TEM blaTEM 1,150 Ampicillin

Tetracyclin

Kiểu hình

kháng kháng sinh

Tên mồi

Gen mục tiêu

Kích thước sản phẩm (bp)

Mức độ kháng kháng sinh của E coli

Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 156 chủng E coli phân lập từ thực phẩm như

sau: tetracycline (59,6%), chloramphenicol (50%), SMX/TMP (45,5%), ampicillin (40,4%), nalidixic acid (20,5%), ciprofloxacin (10,9%), gentamicin (9,6%), amoxicillin/clavunic acid (7,7%), cefuroxime axetil (1,9%), amikacin (0,6%),

cefepime (0,6%), ceftriaxone (0,6%) và 100% các chủng E coli cảm nhạy với imipenem, và ticarcillin Như vậy, 156 chủng E coli phân lập từ thực phẩm có tỉ lệ

kháng cao với tetracycline, chloramphenicol, SMX/TMP và ampicillin Kết quả này cũng giống với một số nghiên cứu khác trên thế giới(10,11,1)

Bảng 2: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng với 16 kháng sinh của E coli

Tỉ lệ (%)

Kháng

Nhạy cảm

Kháng ít

nhất 01 kháng

sinh

80,1 (125)

19,9 (31)

Kháng

2-7 kháng sinh

61,5 (96)

38,5 (60)

Kháng

(Am-Te-Cl-

SMX/TMP)

19,2 (30)

81,8 (126)

Ở bảng 2 đã cho thấy: Tỉ lệ nhạy cảm với 16 loại kháng sinh của 156 chủng E

coli phân lập từ thực phẩm là 19,9%, kháng ít nhất 1 kháng sinh là 80,1% và kháng đa

kháng sinh (kháng 2-7 kháng sinh) là 61,5% Ở nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ kháng

đa kháng sinh của E coli cao hơn có với kết quả của nhóm Nguyễn Thị Kê

(32,6%)(5) Trong số các chủng E coli kháng đa kháng sinh thì kiểu hình đa kháng với

cả 4 kháng sinh (tetracycline - chloramphenicol - SMX./TMP - ampicillin) là phổ biến nhất có 30 chủng (19,2%) Kiểu hình kháng này giống với kiểu hình kháng của

E coli phân lập từ thịt của nhóm nghiên cứu Tô Liên Thu và nhóm Saenz(5,8)

Mức độ kháng kháng sinh của Salmonella spp

Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 40 chủng Salmonella spp phân lập từ thực

phẩm như sau: chloramphenicol (67,5%), tetracyclin (65,0%), trimethoprim (37,5%), ampicillin (37,5%), nalidixic acid (27,5%), ciprofloxacin

sulfamethoxazole-(12,5%), gentamicin (5%) và 100% các chủng Salmonella spp nhạy cảm với

amikacin, cefeperazone, cefepime, cefuroxime axetil, ceftriaxone, ceftazidime,

imipenem, ticarcillin Như vậy, 40 chủng Salmonella spp phân lập từ thực phẩm có tỉ

lệ kháng cao với tetracycline, chloramphenicol, SMX/TMP và ampicillin Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Miko, nhóm Antunes và nhóm Duffy thì thấy gần tương đồng nhau về kiểu hình kháng kháng sinh nhưng khác nhau về tỉ lệ kháng (%)

Tỉ lệ Salmonella spp kháng kháng sinh trong nghiên cứu của chúng tôi có thấp hơn

so với nghiên cứu của Miko {(Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm kháng với

ampicillin (73%), sulfamethoxazole (92%), chloramphenicol (48%), trimethoprim

(23%)} và nhóm Duffy {(Salmonella phân lập từ thịt ở Ireland có 92% kháng

tetracycline, 83% kháng sulfamethoxazole)} nhưng tỉ lệ có cao hơn so nhóm Antunes

{(Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm ở Bồ Ðào Nha kháng với ampicillin

(17%), sulfamethoxazole (17%), tetracycline (19%)}(1,5,1)

Bảng 3: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng với 16 kháng sinh của Salmonella spp

Tỉ lệ kháng (%)

Kháng

(Am-Te-Cl-

SMX/TMP)

27,5 (11)

72,5 (29)

Qua bảng 3 cho thấy: 22,5% các chủng Salmonella spp nhạy cảm với tất cả

các kháng sinh thử nhưng có 77,5% (31 chủng) kháng ít nhất 1 kháng sinh và 60% (24 chủng) là kháng đa kháng sinh (kháng 2-6 kháng sinh) So sánh với kết quả của

một số nhóm nghiên cứu thì thấy tỉ lệ kháng đa kháng sinh của 40 chủng Salmonella

spp ở trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn hẳn (tỉ lệ kháng đa kháng sinh ở nhóm Antunes, nhóm Miko và nhóm White lần lượt là 21%; 39,4% và 53%)(1,5,1) Trong số

các chủng Salmonella spp kháng đa kháng sinh thì kiểu hình kháng với cả 4 kháng

sinh (tetracycline - chloramphenicol - SMX./TMP - ampicillin) là phổ biến nhất có 11 chủng Kiểu hình đa kháng này cũng giống với nghiên cứu của nhóm Miko(5)

Khảo sát gen kháng kháng sinh của Salmonella spp và E coli

Chúng tôi chỉ chọn 18 chủng E coli và 11 chủng Salmonella spp có cùng kiểu

hình kháng đa kháng sinh với tetracycline - chloramphenicol - SMX/TMP – ampicillin để tiến hành khảo sát các gen kháng kháng sinh nhằm tìm hiểu rõ hơn về

cơ chế kháng kháng sinh của các chủng này Sử dụng kỹ thuật PCR với 7 cặp mồi đặc hiệu để xác định sự hiện diện 7 gen kháng kháng sinh (blaTEM và blaSHV mã hóa cho -lactamase cho phép vi khuẩn kháng ampiciilin, tetA và tetB mã hóa cho kháng tetracyclin, sul1 và sul2 mã hóa cho kháng sulfamethoxazol, clmA mã hóa cho kháng chloramphenicol) trên chủng E coli và Salmonella spp kháng đa kháng sinh như đã

lựa chọn ở trên

Kết quả PCR phát hiện gen kháng kháng sinh ở một số chủng E coli

Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh trên một số

chủng E coli có kiểu hình kháng (tetracycline - chloramphenicol – SMX/TMP -

ampicillin của được thể hiện ở hình 1

Giếng MK: thang chuẩn 100bp; từ giếng 1 đến giếng 7 là kết quả của chủng E coli (T149){Giếng 1: blaTEM(1150bp), giếng 2: blaSHV (-), giếng3: sul 2 (722bp); giếng 4: sul 1 (-); giếng 5: tetA (937bp); giếng 6: tetB (416bp); giếng 7: clmA (455bp)}; từ giếng 8 đến giếng 11 là kết quả của chủng E coli (T23) với giếng 8: blaTEM (1150bp), giếng 9: sul2 (722bp), giếng 10: tetA (937bp); giếng11: clmA (455bp)

Hình 1 đã cho thấy chủng E coli mã số T149 phát hiện được các gen kháng kháng sinh là blaTEM, sul 2, tetA, tetB và clmA Với chủng E coli mã số T23 thì phát hiện các gen kháng như blaTEM, Sul 2, tet A và clmA Như vậy, bằng kỹ thuật PCR chúng tôi đã phát hiện được các gen kháng kháng sinh trên các chủng E coli

kháng đa kháng sinh với ampicillin, SMX/TMP, tetracyclin, chloramphenicol

~1150bp

~937bp

Tỉ lệ phát hiện gen kháng kháng sinh trên các chủng E coli kháng đa kháng sinh

Tỉ lệ phát hiện 7 gen kháng sinh (blaTEM, blaSHV, tetA, tetB, sul1, sul2 và

clmA) trên 18 chủng E coli kháng đa kháng sinh phân lập từ thực phẩm được thể

Kiểu gen kháng

Số chủng có mang gen kháng (tỷ lệ%)

blaTEM

16 (88,9%) ampicillin 18

blaSHV

3 (16,7%)

sul1

7 (38,9%)

sul2

13 (72,2%)

tetA

14 (77,8%) tetracyclin 18

tetB

7 (38,9%)

Chloram-phenicol

11 (61,1%)

Bảng 4 cho thấy, từ 18 chủng E coli kháng đa kháng sinh đã phát hiện thấy có

tỷ lệ cao của các gen blaTEM (88,9%), sul2 (72,2%), tetA (77,8%), clmA (61,1%) còn các gen được phát hiện tỷ lệ ít hơn là sul1 và tetB (38,9%), blaSHV(16,7%)

Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Cao Thị Bảo Vân (nghiên cứu

trên các chủng E coli phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh) thì thấy: có sự giống nhau về kiểu gen kháng (blaTEM và blaSHV) cho kiểu hình kháng

ampicillin của các chủng E coli và tỷ lệ phát hiện blaTEM (76,3%) cao hơn so với

blaSHV (38,1%) (1) Như vậy, rõ ràng có sự tương đồng về kiểu gen kháng (blaTEM

và blaSHV) cho kiểu hình kháng ampicillin giữa các chủng E coli phân lập từ thực phẩm và bệnh phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh Vì thế, rất có thể E coli kháng ampicillin phân lập từ bệnh phẩm là có nguồn gốc lây truyền từ E coli có trong thực

phẩm Mặt khác, so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Saenz thì thấy: có sự giống nhau kiểu gen kháng cho kiểu hình đa kháng (ampicillin-SMX/TMP-

tetracyclin-chloramphenicol) của các chủng E coli Ðó là với kiểu hình kháng với ampicillin thì blaTEM được phát hiện (nhóm Saenz thì không phát hiện thấy

blaSHV); các chủng kháng với tetracyclin thì đều phát hiện thấy tetA, tetB trong đó tet A phát hiện thấy nhiều hơn tetB; phát hiện thấy clmA ở các chủng kháng với

chloramphenicol; các chủng kháng với sulphamethoxazol thì phát hiện thấy sul1 và sul 2 và có tới 8/17 chủng cùng mang gen Sul1 và Sul 2(9) Như vậy, tuy có cách xa nhau về địa lý nhưng kết quả nghiên cứu của chúng tôi và nhóm Saenz có nhiều điểm

tương đồng về kiểu hình và kiểu gen kháng của các chủng E coli kháng đa kháng

sinh

Khi phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng kháng sinh trên 18

chủng E coli kháng đa kháng sinh (Am SMX-TMP Te Cl) chúng tôi thấy rằng: E

coli phân lập từ thực phẩm có thể mang nhiều gen kháng kháng sinh tương ứng cho

kiểu hình kháng kháng sinh 7 chủng E coli có mang 2 gen mã hóa cho kháng 1 loại kháng sinh như: blaTEM và blaSHV có trong 1 chủng, sul1 và sul2 có trong 3 chủng,