Một số Enzym sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử doc

3 loại dựa vào khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA: Loại I nhận biết được trình tự đặc hiệu, cắt cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotid cắt tại đó

1 ENZYM GIỚI HẠN (restriction enzyme, RE)

1.1 Tên gọi các enzym giới hạn

1.2 Các loại enzym giới hạn

1.3 Các RE loại II

2 MỘT SỐ ENZYM KHÁC THƯỜNG SỬ

DỤNG TRONG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

 Tế bào vi khuẩn bị phage phá hủy

phage (thực

khuẩn thể )

(hiện tượng giới hạn)

phage (thực

khuẩn thể )

Enzym giới hạn (Restriction enzyme, RE) :

 có khả năng cắt DNA phage ở những vị trí nhất định

thành những đoạn ngắn.

 thuộc nhóm enzym endonuclease , cắt các liên kết phosphodieste trong phân tử DNA.

GGG GGG

 EcoR I cắt DNA lệch giữa 6 cặp nucleotid

G AATTC CTTAA G

Đặc tính của RE :

 cắt DNA không đặc hiệu loài : RE tách chiết

từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn.

 Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay

ngắn, tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA

 Điều kiện hoạt động :

- nhiệt độ

- dung dịch đệm thích hợp

 Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào prokaryote

Chưa có hệ thống nào tương đương

được phát hiện ở eukaryote.

1.1.Tên gọi các enzym giới hạn

3 loại (dựa vào khả năng nhận biết và cắt một

trình tự xác định trên phân tử DNA):

Loại I

nhận biết được trình tự đặc hiệu, cắt cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotid cắt tại đó

và phóng thích độ vài chục nucleotid.

Loại II nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó

Loại III nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotid về phía trước.

1.3.1 Trình tự nhận biết

 Mỗi enzym giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA có trình tự từ 4 – 6 cặp nucleotid

 Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận biết được gọi là isoschisomers

 Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotid của trình tự

có thể được thay thế bởi nucleotid khác.

1.3.2 Các kiểu cắt của các enzym RE loại II

 Cắt tạo đầu bằng (blunt ends)

không có khả năng tự kết hợp lại

Để nối phải dùng enzym T4 DNA ligase

 Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends):

Các đầu so le có thể tự nối lại không cần DNA ligase, được sử dụng rất nhiều trong công nghệ tái tổ hợp

1.3.3 Một số điều kiện cần lưu ý khi tạo một phản ứng thủy giải bởi RE

 Chú ý đến điều kiện nhiệt độ, pH và

dung dịch đệm thích hợp

 Bảo quản ở -20oC RE sẽ giữ được hoạt tính

 Thể tích RE = 1/10 thể tích phản ứng

1.3.4 Ứng dụng

 Nghiên cứu bộ gen của eukaryote

 Phương pháp tạo dòng (cloning)

 Lập bản đồ giới hạn (restriction map)

 Phân tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau nhờ kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn).

Polymerase: enzym xúc tác sự tổng hợp DNA và sự tổng hợp

RNA

2.1.1 Các DNA polymerase

 Xúc tác sự tổng hợp DNA, theo chiều 5’ – 3’

 Cơ chất: phần lớn là DNA để làm khuôn (DNA

polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq Polymerase)

 Đặc biệt Transcriptase ngược (Reverse transcriptase) : khuôn là RNA để tổng hợp DNA

 Terminal transferase: không tổng hợp một đoạn DNA mới từ khuôn mà chỉ thêm các nucleotid vào đầu của một phân tử DNA có sẵn,

 Các DNA polymerase khi hoạt động cần có mồi

(primer)

DNA polymerase I (DNA pol I)

 Hoạt tính :

- hoạt tính polymerase: tổng hợp

-hoạt tính exonuclease: thủy phân các liên kết phosphodieste giữa các nucleotid từ đầu phân tử DNA, phóng thích từng nucleotid theo cả chiều 5’

 3’ và 3’  5’

 Vai trò:

- xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn DNA mới

- sửa chữa sai sót trong quá trình nhân đôi DNA.

 Ứng dụng :

- Xác định trình tự DNA bằng phương

pháp dideoxynucleotid

- Tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao

- Thiết kế các vectơ từ DNA mạch đơn

- Trong thực tế, sử dụng đoạn Klenow (Klenow fragment) có hoạt tính

polymerase và exonuclease 3’  5’,

không có hoạt tính exonuclease 5’  3’

T4 DNA polymerase

 có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli

 Hoạt tính:

- giống hệt như hoạt tính của đoạn Klenow

- nhưng do hoạt tính exonuclease 3’- 5’ mạnh hơn nên được sử dụng nhiều hơn khi cần tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao.

Taq DNA polymerase

 trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus là một enzym chịu nhiệt nên thường được sử dụng trong phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

 PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu nhờ enzym DNA polymerase trên máy luân nhiệt (thermal cycler).

Transcriptase ngược (Reverse transcriptase)

 do các retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào ký chủ.

 Trên thị trường, transcriptase ngược có nguồn gốc từ AMV

(Avian Myeloblastosis Virus) và MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus).

Terminal transferase

 ly trích từ tuyến ức của bê

 xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotid vào đầu 3’-

OH tự do của phân tử DNA

 Gắn ngẫu nhiên nên thành phần nucleotid của chuỗi polynucleotid mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotid có trong phản ứng

2.1.2 Các RNA polymerase

 sử dụng nhiều nhất: SP6 RNA polymerase, T3 và T7 RNA polymerase.

 SP6 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm

nhiễm Salmonella typhimurium.

 T3 và T7 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm

nhiễm E coli.

 Xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân tử DNA mạch đôi theo chiều 5’  3’

 Không cần mồi nhưng khuôn DNA phải có mang một

promoter đặc trưng của phage

 Dùng để tạo một lượng lớn RNA từ một trình tự DNA được nối ngay sau một promoter thích hợp

trưng cho phage SP6, T3, T7.

 Nghiên cứu bản sao chép RNA của một DNA

đã được dòng hóa

 Nhờ các RNA polymerase, người ta có thể tổng hợp một số lượng lớn RNA từ một DNA được dòng hóa, dùng trong các nghiên cứu về cấu

trúc, điều hòa, và các mối tương tác của RNA.

xúc tác sự tạo liên kết nối 2 đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase)

E.coli DNA ligase

T4 DNA ligase

 Nguồn gốc: từ phage T4 xâm nhiễm E.coli

 có khả năng nối 2 trình tự DNA đầu bằng, được ưa chuộng nhất trong kỹ thuật tạo dòng.

T4 RNA ligase

 Trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli

 có khả năng nối 2 trình tự RNA bằng các liên kết phosphodieste.

Là enzym cắt DNA (DNase) và enzym cắt RNA (RNase) Các RE: cũng là những nuclease nhưng mang tính

chuyên biệt trình

tự cao hơn.

DNase I

 Enzym được tách chiết từ tụy bò

 Xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết nằm ngay sau một base pyrimidin (G, C)

 Ứng dụng:

 Loại bỏ DNA tạp nhiễm trong các nghiên

cứu DNA và nghiên cứu protein.

 Tạo các chỗ đứt (nick) trên DNA trong các

kỹ thuật đánh dấu mẫu dò kiểu nick

translation.

 Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc chất DNase nồng độ thấp có thể phân hủy các gen đang hay đã từng hoạt động, đặc biệt là các vị trí siêu nhạy cảm nằm trong các phần được chuyển mã mạnh nhất của nhiễm sắc thể.

Nuclease S1

 được ly trích từ nấm Aspergillus oryzae , có khả

năng phân cắt DNA mạch đơn, không có khả

năng phân cắt phân tử lai DNA – RNA

Exonuclease III

 được tách chiết từ E coli

 xúc tác phản ứng thủy phân tuần tự các

nucleotid từ đầu 3’OH tự do của một DNA, theo chiều 3’  5’, tạo nên một vùng mạch đơn dài trên một phân tử DNA mạch đôi

 Enzym còn có các hoạt tính 3’ phosphatase, RNase H

 Ứng dụng:

 Tạo các cấu trúc mạch đơn ở một số vùng

trên phân tử DNA dùng làm cơ chất cho đoạn Klenow của DNA polymerase I (để sản xuất

mẫu dò đặc trưng cho từng mạch)

 Tạo ra những đột biến “mất đoạn” tại những vùng đặc biệt trên DNA khi phối hợp với

nuclease S1.

 Một exonuclease có hoạt tính tương tự là

nuclease BAL31 , có hoạt tính exonuclease 5’

 3’ và 3’  5’, có khả năng tạo các DNA mạch

đôi đầu bằng mà không cần sự hiện diện của nuclease S1.

RNase A

cao, hiện diện ở mọi nơi và cực kỳ bền vững (không mất hoạt tính khi bị xử lý ở

đặc hiệu liên kết phosphodieste nằm ngay sau một base pyrimidin (C và U) của RNA

hay protein.

RNA trong phân tử lai DNA – RNA.

RNase H

 có tác dụng loại bỏ RNA trong các phân

tử lai DNA – RNA

 thường được dùng để loại bỏ RNA sau

các phản ứng chuyển mã ngược để tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai của cDNA tạo nên một phân tử DNA mạch đôi.

 Một số enzym RNase khác: