Xây dựng kỹ thuậ t RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C pdf

Phương pháp nghiên cứu: Chúng tơi xây dựng kỹ thuật RT – PCR dùng mồi đặc hiệu cho vùng 5’ khơng mã hĩa của bộ gen HCV cĩ gắn biotin để phát hiện RNA HCV.. Sau đĩ, những sản phẩm PCR này

Xây dựng kỹ thuật RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C đồng thời định genotype HCV bằng lai trên vạch dị đặc hiệu của thanh inoLIPA

Hồng Hiếu Ngọc( 1 ) , Phạm Hùng Vân( 2 )

Tĩm tắt

Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C là một trong những nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan(1-8 ) Qui trình kỹ thuật RT – PCR nhằm phát hiện, xác định genotype HCV do chúng tơi xây dựng với mục đích giúp định hướng

và theo dõi điều trị viêm gan siêu vi C

Mục tiêu: Xây dựng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện HCV đồng thời xác định kiểu gen của virus viêm gan C

bằng kỹ thuật lai trên vạch dị đặc hiệu của thanh InoLipa của Bayers

Phương pháp nghiên cứu: Chúng tơi xây dựng kỹ thuật RT – PCR dùng mồi đặc hiệu cho vùng 5’ khơng mã

hĩa của bộ gen HCV cĩ gắn biotin để phát hiện RNA HCV Sau đĩ, những sản phẩm PCR này được định genotype bằng phương pháp lai trên vạch dị đặc hiệu INOLiPA do gắn sẵn chất đánh dấu biotin trước đĩ 45 mẫu huyết thanh HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) đã xác định bằng kỹ thuật RT – PCR thơng thường, lấy trong thời gian từ 3/2005 đến 7/2005, được tiến hành thử nghiệm phát hiện RNA HCV bằng qui trình kỹ thuật mới cùng với kỹ thuật RT – PCR thơng thường và kỹ thuật Nested PCR của Bayer Những sản phẩm PCR cĩ HCV (+) sẽ tiếp tục định genotype bằng phương pháp lai

Kết quả: Với mỗi qui trình PCR, chúng tơi đều thu được kết quả 45 mẫu HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) như ban

đầu Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật PCR thơng thường khơng thể tiếp tục định genotype HCV vì khơng cĩ chất đánh dấu biotin Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật do chúng tơi xây dựng đều xác định được genotype và cho kết quả genotype giống như nhau

Kết luận: Qui trình kỹ thuật RT – PCR phát hiện RNA HCV bằng mồi cĩ gắn biotin và định genotype HCV

bằng phương pháp lai trên vạch do chúng tơi xây dựng và thử nghiệm đã thành cơng, cho kết quả chính xác như đối với kỹ thuật RT – PCR thơng thường và Nested PCR

Abstracts

Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by hybrilizing PCR products on specific inoLIPA strip.

Background: Hepatitis C virus is one of reasons that causes cirrhosis and hepatic cell carcinoma The new RT

– PCR technique is set up to detect HCV and determine its genotypes with the aim of orientating and following treatment of HCV

Objectives: Setting up RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by

hybrilizing PCR products on specific Inolipa stripe

Method: The primers bound to biotin were designed specifically to 5’ noncoding region of HCV genome and

detected RNA HCV by using RT – PCR These PCR products then can be used to find HCV genotypes by hybridizing to immobilized probes on nitrocellulose stripes 45 serum samples with HCV (+) and 15 serum samples with HCV (-), which had been known by ordinary RT – PCR, will be tested by new RT – PCR technique, ordinary RT - PCR and Nested PCR Then PCR products with HCV (+) will be determined HCV genotypes

Results: From each process, we gather 45 positive samples with HCV and 15 negative samples as before.

Positive HCV PCR products from ordinary RT – PCR can not be followed to find out HCV genotypes Positive HCV PCR products from the last two processes can be used to determine HCV genotypes and results from them are the same

Conclusion: The new RT – PCR technique set up to detect HCV and determine its genotypes is success The

results from it are similar to from ordinary RT – PCR and Nested PCR

Đặt vấn đề

Hiện nay, viêm gan siêu vi C là một bệnh lý

được nhiều nhà lâm sàng, dịch tễ học cũng

như nghiên cứu y học đặc biệt quan tâm

Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy có sự

tương quan rõ rệt giữa bệnh gan mãn tính, xơ

gan và ung thư tế bào gan với nhiễm HCV (1-8)

– thậm chí có liên quan đến từng type HCV

riêng biệt (9,10) Ngoài ra, để có được chỉ định

điều trị đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu

quả điều trị thì việc xác định kiểu gen HCV trong máu cũng rất quan trọng Việc ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện những tác nhân

vi sinh vật đã và đang được sử dụng ở Việt Nam Bên cạnh nhiều giá trị lợi ích hơn so với các xét nghiệm huyết thanh chẩn đoán, vấn đề giá cả của kỹ thuật này lại là một yếu tố cần được quan tâm cân nhắc Vì thế, chúng tôi tiến hành xây dựng một qui trình kỹ thuật RT – PCR nhằm phát hiện và xác định genotype

HCV với mong muốn tìm hiểu độ tin cậy và sự

chính xác của kỹ thuật này trên những mẫu

bệnh phẩm so với những qui trình khác hiện

đang được sử dụng Chúng tôi cũng đánh giá

các lợi ích về mặt kinh tế của kỹ thuật này để

có hướng đưa ra áp dụng trên thực tế hiện nay

tại các phòng thí nghiệm có trang bị PCR

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mẫu máu bệnh phẩm từ bệnh nhân đã được

chẩn đoán nhiễm HCV sẽ được tách chiết

huyết thanh Mẫu huyết thanh không nhiễm

HCV – là những mẫu lưu trữ ở -70oC tại công

ty Nam Khoa Các mẫu này đã được xác định

RNA – HCV (-) qua kỹ thuật RT – PCR phát

hiện HCV thực hiện tại công ty Nam Khoa

Tiến hành ly trích RNA từ những mẫu huyết

thanh bệnh nhân HCV (+) và HCV (-) dựa

trên nguyên tắc dùng Guanidine 14M và urea

với phenol và các chất tẩy khác để làm các

chất gây biến tính protein nhờ đó ly trích được

RNA toàn phần ra khỏi DNA và protein Thực

hiện RT tổng hợp cDNA từ những mẫu RNA

được ly trích với nguyên tắc phiên mã ngược

toàn bộ RNA thành cDNA bằng mồi ngẫu

nhiên Giai đoạn này dùng kit tổng hợp cDNA

của công ty Nam Khoa với chu kỳ nhiệt như

sau: 25oC trong 5 phút; 42oC trong 30 phút;

85oC trong 5 phút; Thực hiện PCR: Chúng tôi

thực hiện 3 qui trình đồng thời (1) Qui trình

PCR và mồi bình thường: Là qui trình PCR

sử dụng bộ kit RT – PCR phát hiện HCV của

công ty Nam Khoa sản xuất Qui trình này sử

dụng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn dài

#244 bp trong vùng 5’ không mã hóa của bộ

gen HCV Sau đó, sản phẩm sẽ được điện di

và đọc kết quả dưới ánh sáng tia cực tím (2)

Qui trình Nested PCR với mồi OP và NP

của Bayer: Qui trình này dựa trên nguyên tắc

dùng mồi OP khuếch đại một đoạn dài 300 bp

Sau đó dùng sản phẩm PCR khuếch đại bằng

mồi OP này làm khuôn để chạy qui trình

nested PCR với mồi NP để cho sản phẩm

khuếch đại dài #240 bp, cuối cùng, sản phẩm

được phát hiện qua chạy điện di trên thạch

agarose Sản phẩm nested PCR có một đầu

gắn biotin do mồi NP có gắn biotin Nhờ vậy,

sản phẩm PCR này sẽ dùng để xác định

genotype bằng phương pháp lai trên vạch dò

đặc hiệu HCV – INOLiPA Cả hai lần chạy

chương trình PCR bằng máy iCycler của BioRad đều theo chu kỳ nhiệt như sau: 94oC trong 1 phút; 94oC trong 15 giây; 55oC trong 30 giây; 72oC trong 30 giây; Lập lại 40 chu kỳ;

72oC trong 5 phút (3) Qui trình PCR với mồi

gắn biotin: Đây là qui trình PCR do chúng tôi

nghiên cứu trong đó chúng tôi dùng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn dài #244 bp tại đầu 5’ không mã hóa của bộ gen HCV Một trong hai đầu được chúng tôi gắn chất đánh dấu biotin Sản phẩm được chạy PCR để khuếch đại, sau đó, có thể dùng để xác định được genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu của HCV – INOLiPA Chạy chương trình PCR bằng máy iCycler của hãng BioRad như sau: 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút; 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; 40 chu kỳ

94oC trong 30 giây; 60oC trong 30 giây; 72oC trong 1 phút; 1 chu kỳ72oC trong 10 phút; Tổng thời gian thực hiện phản ứng là 2 giờ 10

phút Phát hiện genotype HCV: Phát hiện

genotype HCV bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu cho genotype của thanh

HCV - INOLiPA Nguyên tắc kỹ thuật là: sản

phẩm khuếch đại được biến tính thành những chuỗi DNA đơn Đầu 5’ của sản phẩm khuếch đại HCV có gắn với biotin được lai với những đoạn mồi ngắn Đoạn mồi ngắn này một đầu được gắn cố định trên giấy nitrocellulose, đầu còn lại tự do, có trình tự nucleotid bổ sung với trình tự nucleotid của đầu 5’ không dịch mã đặc hiệu cho từng genotype HCV Biotin của đầu 5’sẽ gắn với phức hợp streptavidine – alkalin phosphatase Cuối cùng, sản phẩm lai được phát hiện bằng sự xuất hiện màu do phức hợp streptavidine – alkalin phosphatse tương tác với chất nền BCIP/NBT chromogen

Kết quả

Với những mẫu huyết thanh HCV (+) và (-) ban đầu, chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời 3 qui trình PCR nói trên trong đó phương pháp PCR có mồi gắn biotin là của nhóm nghiên cứu: Với 45 mẫu HCV (+) ban đầu, sau khi chạy RT – PCR bằng ba phương pháp, kết quả đều (+) Với 15 mẫu HCV (-) ban đầu, sau khi chạy RT – PCR bằng ba phương pháp, kết quả đều (-) 45 mẫu HCV [+] này đều được tiến hành xác định kiểu gen bằng phương pháp lai trên vạch với bộ thuốc thử do hãng

BioRad cung cấp và kết quả được đọc theo

thang chuẩn của hãng này

Các kết quả genotype được ghi lại như sau:

Kiểu gen 1b chiếm tỉ lệ cao nhất 22 trường

hợp (52,38%) Tỉ lệ nhiễm type 1 thấp nhất 1

trường hợp (2,4%) Có 7 trường hợp đồng

nhiễm 2 type (1 trường hợp nhiễm 1a/1b, 6

trường hợp nhiễm 2a/2c) và 1 trường hợp đồng

nhiễm 3 type (2a/2c/1b)

Kết luận

Với những kết quả thử nghiệm do phương

pháp 1 mang lại, chúng tôi không thể tiếp tục

thực hiện xác định genotype HCV bằng kỹ

thuật lai trên vạch vì trong thành phần của sản

phẩm không có biotin – một chất dùng để phát

hiện sản phẩm bằng cách hiện màu Thử

nghiệm định genotype từ phương pháp Nested

PCR của Bayer và phương pháp PCR có mồi

gắn biotin của chúng tôi cho kết quả như nhau

vì sản phẩm PCR thu được từ hai phương pháp

đều có gắn biotin ở đầu 5’ Do đó đều có thể

được phát hiện bằng chất hiện màu Kết quả

phát hiện RNA HCV và định genotype giữa

phương pháp Nested PCR và phương pháp của

chúng tôi đã được trình bày ở phần trên càng

xác định độ tin cậy của qui trình PCR có mồi

gắn biotin mới được xây dựng so với hai qui

trình còn lại Như vậy, qui trình kỹ thuật của

chúng tôi vừa có khả năng phát hiện RNA

HCV vừa tạo ra được những sản phẩm PCR có

thể tiến hành định genotype HCV bằng

phương pháp lai trên vạch Với cùng kết quả

như trên, qui trình kỹ thuật do chúng tôi thiết

kế chỉ cần sử dụng 1 cặp mồi để phát hiện

RNA – HCV so với Bayer phải sử dụng 2 cặp

mồi Ngoài ra, trong thành phần genotype

HCV PCR mix của chúng tôi có dUTP và UNG để chống ngoại nhiễm còn trong bộ PCR master mix của Bayer thì không Như vậy, trong mục tiêu này, điểm lớn nhất mà chúng tôi đạt được là không hề bị ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại nên kết quả xác định genotype luôn rõ ràng, không có các vạch màu tạp nhiễm khiến việc đọc kết quả khó khăn Để thực hiện định genotype HCV dựa trên qui trình kỹ thuật HCV – INOLiPA của Bayer, kinh phí sẽ là 300.000 VNĐ cho phát hiện HCV – RNA, 300.000 VNĐ cho PCR trước khi định type với mồi OP và NP, 1.300.000 VNĐ cho lai trên vạch dò đặc hiệu

Do đó tổng giá thành là 1.900.000 VNĐ Để định genotype HCV với qui trình của chúng tôi thì giá thành sẽ là 300.000 VNĐ PCR phát hiện và định genotype, 1.300.000 VNĐ cho lai trên vạch dò đặc hiệu Tổng giá thành sẽ là 1.600.000, tiết kiệm được 300.000 VNĐ so với cách làm của Bayers

Tài liệu tham khảo.

1 DAVID L.THOMAS, STANLEY M.LEMON

Hepatitis Mandell, Douglas, and Bennett’s

Principles & Practice of Infectious diseases Gerald L.Mandell, John E.Bennett Raphael Dolin 2000;143:1736 – 1760

2 DI BISCEGLIE AM, GOODMAN ZD, ISHAK

KG et al Long-terms clinical and

histopathological follow-up of chronic posttransfusion hepatitis Hepatology.

1991;14:969 - 974

3 HOPF U, MOLLER B, KUTHER D, et al.

Long-term follow-up of posttransfusion and sporadic chronic hepatitis non-A non-B and frequency of circulating antibodies to hepatitis

C virus (HCV) J Hepatol 1990;10:69 - 76.

Hình 1: Kết quả HCV [+] trên thạch điện di,

với 3 phương pháp; A: phương pháp PCR với

mồi bình thường, B: Phương pháp PCR với mồi

OP và NP, C: Phương pháp PCR mồi gắn biotin

2,4%

11,9%

52,38%

2,4%

14,29% 14,29%

2,4%

0 5 10 15 20 25

Kiểu gen

Biểu đồ 1: Tỉ lệ phân bố kiểu

gen

4 KORETZ RL, ABBEY H, COLEMAN E, et al.

Non-A non-B post-transfusion hepatitis.

Looking back in the second decade Ann intern

Med 1993:119:110 - 115

5 MATTSSON L SONNERBORG A,

WEILAND O Outcome of acute symptomatic

non-A, non-B hepatitis: A 13-year follow-up

study of hepatitis C virus markers.

Liver.1993;13:274 - 278

6 SEEFF LB Natural history of hepatitis C.

Hepatology l997;26:21S – 28S

7 TONG MJ, EL-FARRA NS, REIKES AR, et

al Clinical outcomes after transfusion

associated hepatitis C N Engl J Med.

1995;332:1463 – 1466

8 TREMOLADA F, CASARIN C, ALBERTI A,

et al Long-term follow-up of non-A non-B (type

C) post-transfuston hepatitis J Hepatol.

1992;16:273 - 281

9 BRUNO S SILINI E, CROSIGNANI A., et al Hepatitis C virus genotypes and risk of

hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A

prospective study Hepatology 1997;25:734 –

758

10 MAHANEY K, TEDESCHI V., MAERTENS

G., et al Genotypic analysis of hepatitis C

virus in American patients Hepatology.

1994;20 :1405.