thực nghiệm trong nghiên cứu thành phần cây sơn quỳ lá tròn

thực nghiệm, trong nghiên cứu thành phần cây sơn quỳ lá tròn

32

3 THỰC NGHIÊM

3.1 Các phương pháp được sứ dung trong quá trình nghiên cứu

3.1.1 Phương pháp ly trích

Điều chế cao etanol thô bằng phương pháp ngâm dầm

Điều chế các loại cao như: cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform, Cao acetat etyl, cao etanol bằng phương pháp trích lỏng-lỏng

3.1.2 Phân lâp các hợp chất hữu cơ

Sắc ký cột nhanh với silica gel 60H, Merck loại dùng cho sắc ký bảng mỏng

Sắc ký cột cổ điển

Sắc ký bản mỏng loại 25 DC — Alufolien 20x20 cm, Kieselge] F254, Merck

Sắc ky diéu chế sử dụng bản mỏng loai 25 DC — Alufolien 20x20 cm,

Kieselgel F254, Merck

3.1.3 Khảo sát cấu trúc

Phổ GC-MS được đo trên máy RTX-5MS và phổ LC-MS được đo trên máy THERMO FINNIGAN với đầu dò LCQ-DECA tại trường Đại học Roskilde, Đan Mạch

Phổ hồng ngoại được đo trên máy quang phổ héng ngoai PERKIN ELMER

FT-IR 2000 tại trường Đại học Roskilde, Đan Mạch

Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR và 'ÍC-NMR và các phổ 2D- NMR được đo trên:

e Máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AC.200, tần số cộng hưởng

500 MHz cho proton, 125 MHz cho carbon (tại Viện Hóa học Hà Nội); máy VARIAN 300 MHz cho proton va 75 MHz cho carbon (tai truéng Dai hoc

33

Roskilde, Dan Mach); may INOVA-600, tan sé cong hudng 600 MHz cho proton

và 175 MH¿z cho carbon (tại trường Đại học Roskilde, Dan Mach)

3.2 Điều chế các loại cao và cô lập hợp chất

Lá cây được thu hái ở Cú Chỉ vào tháng 05 năm 2005, được định đanh bởi giáng viên Hoàng Việt, khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành

Phố Hồ Chí Minh và dược sĩ Phan Đức Bình, trường Đại học Y dược Thành Phố

Hỗ Chí Minh

Bột lá khô (1,5 kg) được trích với etanol (96%) bằng phương pháp ngâm dam ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bố dung môi của địch trích thu được cao thô etanol (110 g) Cao thô này được bòa tan trở lại vào etanol (80%) thu được dich etanol AI và tủa TL Tủa T1 được hòa vào etanol (70%) thu được địch etanol Bl

và tủa T2 Dịch etanol B được trích lỗng-lỏng với clorofrom thu được dịch B2 Gộp chung dich etanol Al véi dịch B2 thu được dịch trích etanol A2 Dịch trích

etanol A2 được trích lần lượt với eter đầu hỏa, benzen, cloroform, acetat ety1 (sử dụng phương pháp trích lông-lông) để thu được năm loại cao: cao eter đầu hóa (32,66 g), cao benzen (22,09 ø), cao cloroform (3,20 g), cao acetat ctyl (1,62 8), cao etanol (19,02 g) Kết quá điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 3.1

Tất cả các loại cao đều được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và được

khảo sát bằng phổ IR

Đựa trên những kết quả về hoại tính kháng khuẩn và kết quả phổ IR (phân 2.1 và 2.2), chúng tôi chọn cao cloroform, cao benzen để sắc ký cột Do cao eter dầu hỏa có lượng nhiều (32,06 g) nên cũng được chọn để sắc ký cột.

Đột lá cầy khô

(1,5 kg)

Trích với etanol ở nhiệt độ phòng

Thu héi dung m6i

Cao thô ELQH

(110 g)

Hòa tan trong etanol (80%)

Héa tan trong etanol (70%)

Trích với cloroform

Thu hồi dung môi

Hòa tan vào etanol S0% Dịch etanol A2

e Thu béi dung môi

* Hoa tan vào etanol (80%)

e Trich lin lượt với những dung môi

hữu cơ

e C6 quay loại dung môi hữu cơ

(32,06 g) (22,09 g) (3,00 g) (1,62 g) (19,02 g)

PE: Eter đầu hỏa; Bz: Benzen; C: Cloroform; AE: Acetat etyl

Sơ đồ 3.1: Qui trình điều chế các loại cao

3.2.1 Sắc ký côi cao cloroform của sơ đồ 3.1

Dua trên những kết quá thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kết quả phổ

FR, 2,5 (ø) cao cloroform của sơ để 3.1 được sắc ký cột silica gel thu được bẩy phân đoạn: C1 đến C7 (được trình bầy trong báng 3.1) Phân đoạn C2 và C3 của

bảng 3.1 có các vết rõ rằng nên được chọn để sắc ký tiếp tục, các phân đoạn còn lại sẽ khảo sất sau

Sắc ký cột silica gel trên 250 (mg) cao của phân đoạn C2 (bang 3.1) thu được chín phân đoạn: C21 đến C29 (được trình bày trong bảng 3.2) Trong 9 phân đoạn này, phân đoạn C22 có lượng nhiều (97 mg), có một vết nên được được tỉnh

chế lại bằng sắc ký điều chế và đã cô lập được hợp chất có dạng dầu mầu vàng

tạm đặt tên là TAGE-CI (54 mg) Những phân đoạn khác của bằng § có lượng quá ít và không có vết rõ ràng nên không được khảo sát

Sắc ký cat silica gel trén 380 (mg) cao cia phan đoạn C3 của bang 3.1 thu được năm phân đoạn: C31 đến C35 (được trình bày trong bảng 3.3) trong đó phân

đoạn C32 (163 mg) khá sạch và có vết rõ rằng nên được sắc ký điều chế và thu

được hai hợp chất tạm đã tên là: TAGE~-C2 (82 mg) và TAGE-C6 (10 mg) Hai

hợp chất này có dạng keo không mầu

Tiểu kết: Từ cao eloroform được điều chế theo sơ đổ 3.1, sử dụng các kỹ thuật sắc

ký cột và sắc ký điểu chế thu được ba hợp chất tạm đặt tên là: TAGE-CI, TAGE-C2 và TAGE-C6

36

Bảng 3.1: Sắc kí cột trên 2,5 (g) cao cloroform của sơ đồ 3.1

5-10 CHCI:-MeOH (99:1)

15-17 CHC1;-MeOH (98:2)

_ C3 | 18-344 | CHCI-MeOH (98:2) 400 Sắc kí tiếp tục

C5 51-68 CHC1;-MeOH (90:10) 330 Sé khdo sát sau

Có 69-87 CHCI1;:-MeOH (50:50) 300 Sẽ khảo sát sau C7 | 88-103 MeGH 685 Sẽ khảo sắt sau

Bảng 3.2: Sắc kí cột trên phan đoạn C2 của bảng 3.1

Khối lượng

(mg)

C22 | 3-4 | CHC1:-aceton (90:10) 56 Sẽ kháo sát sau

Sắc kí điều chế thu được

C23 5-8 | CHCl -aceton (90:10) 97 TAGE-CI là Vomufoliol

(54 mg) C24 9-10 | CHCl:-aceton (90:10) _

27 Không khảo sát

C25 | 11-13 | CHCls-aceton (80:20)

C26 | 14-22 | CHCls-aceton (80:20) 21 Không khảo sát

C27 | 23-29 | CHCl-aceton (50:50) 20 Không khảo sát

3 Không khảo sát

37

Bảng 3.3: Sắc kí cột phân đoạn C3 của bảng 3.1 (380 mg), hứng mỗi lọ 25ml

Không khảo sát Sắc kí điều chế thu

mg) và TAGE~C6 (10

25-30 CHCl;-aceton (50:50)

I 31-32 Aceton Không khảo sát

33 Aceton

3.2.2 Sắc ký côt cao benzen của sơ đồ 3.1

Cao benzen có khối lượng nhiều (22,09 g) và phổ IR cho thấy cao này có

thể có những hợp chất có nhóm chức ester và lacton (1700-1770 cm) Bên cạnh

đó cao này còn có hoạt tính kháng khuẩn nên nó được chọn để khảo sát Để tiết

kiệm thời gian, dung môi, và hóa chất, chúng tôi chỉ đùng một lượng ít (5,0 g) để sắc kí cột và thu được mười một phân đoạn: BI đến B11 (kết quả được trình bày trong bảng 3.4) Những phân đoạn từ B1 đến B5 bẩn, chứa nhiều chất màu xanh,

rất ít phân cực, không có vết rõ ràng nên không khảo sát Bên cạnh đó những

phân đoạn cuối từ B10 đến B11 chứa nhiều nhầy nhựa, nên cũng không khảo sát Phân đoạn B6 và B7 có vết rõ ràng và giống nhau nhưng đo phân đoạn B6 sạch sẽ hơn và khối lượng nhiều hơn nên được chọn để sắc ký cột tiếp tục

Phân đoạn B6 sau khi sắc ký cột thu được ba phân đoạn (kết quả được trình

bày trong bảng 3.5) trong đó phân đoạn B62 có khối lượng nhiều, vết rõ hơn sạch

38

sẽ hơn nên được sắc ký điều chế thêm ba lần nữa và thu được hợp chất có dạng sắp mầu trắng tạm đặt tên là TAGE-BI (33 mg)

Bang 3.4: Sac kí cột cao benzen (5,0 g) của sơ dé 3.1, hứng mỗi lọ 100 mì

Khối

(mg)

24-27 CHạCh; : MeOH (99:1) có vết rõ

B3 28-30 CH;C]; : MeOH (99:1) 628 Khảo sát sau

Bá 31-35 CHLChL : MeOH (99:1) 290 Cao màu xanh, không

BS 26-47 CH;CI;:MeOH (99:1) 47g | Cao mầu xanh, không

48-51 CH,CiL : MeOH (98:2) có vết rõ

52-59 CH¿C]; : MeOH (98:2) Có vết rõ, sắc kí cột

tiếp tục và sử dụng sắc

_mg)}

| B7 61-65 CHLCL : MeGH (96:4) 309 Sẽ khảo sát sau

B5 66-69 CELCL : MeOH (94:6) 194 Không khảo sát

B9 70-78 CHLCL : MeOH 4:6) 342 Sẽ khảo sát sau

79-85 CH›;C]; : MeOH (94:6)

95-98 CHOCL : MeOH (85:15) không khảo sất

99 CHạCh; : MeOH (50:29)

Bij | 100-105 | CH,Ch : MeOH (80:20) | ¿7y Nhiều nhấy nhựa,

39

Bảng 3.5: Sắc kí cột phân đoạn B6 (380 mg) của bảng 3.4, hứng mỗi lo 20 mi

| 1-8 ¡ CH;Cl¡Aceton (96:4)

9 CH;C];:Aceton (92:8) |

10-24 | CH)Ch:Aceton (92:8) | “Ske kí điều chế thu

B62 | 25-40 | CH;ClL:Aceton (88:12) 110 được hợp chat

ị | 41-84 | CHyCh:Aceton (75:25) ! TAGE-BI G3 mg) sẽ `

| 55-61 CH)Ch:Aceton (50:50) ˆ Nhiéu nbay nhựa

TAGE-Bi Không

ao Sat

3.2.3 Sắc ký cốt cao eter đầu hỏa của sơ đồ 3.1

Cao eter dau héa (trong sơ để 3.1) có lượng cao nhiều nên được chọn để khảo sát và cô lập chất, Tiến hành sắc kí cột cao eter đầu hỏa (31 g), hứng mỗi lọ

100 mi thu được chín phân đoạn: B1 đến E9 ( kết quả được trình bày trong bang

3.6) Những phân đoạn từ E1 đến E2 có đạng dầu rất ít phân cực nên không được khảo sát Kết quả sắc ký bản móng phân đoạn E4 cho thấy có mội vết mầu tím rõ

(sử đụng hệ dụng ly: eter đầu hỏa:cloroform (5:5), hiện hình bằng cách phun xịt với H;ạSO, đậm đặc, sau đó nung nóng), do đó phân đoạn này được sắc ký điều

chế nhiễu lần và thu được hợp chất dạng rắn mầu trắng tạm đặt tên là TAGE-EB

(29 mg)

40

Bang 3.6: Sắc kí cột trên cao eter dâu hồa của sơ dé 3.1

Khối lượng

(mg)

vết

169-184 PE-Bz (99:1) —_

335-336 PE-Bz (90:10)

337-338 PE-Bz (75:25)

E6 | 339-453 PE-Bz (75:25) 6013 Sẽ khảo sát sau

E8 | 573-648 PE-Bz (50:50) 1508 Sẽ khảo sát sau

Eo _ 745-753 Bz-CHCI, (95:5) Sẽ khảo sÁt sau

754-762 | Bz-CHÔI: (90:10) 8277 Sẽ khảo sát sau

PE: eter dâu hóa; Bz: benzen

3.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được thực thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý Động vật, khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành Phố Hệ Chí Minh

4I

Vật liệu - môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy LB là môi trường cung cấp đây đủ chất định dưỡng cho vi khuẩn phát triển với thành phần như sau:

Thành phẫn môi trường:

Cao Nấm Men :5¢2

Thêm nước cất cho đủ iit

Dung môi hòa tan cao trích: DMSO

Nguyên tác

Ap dung phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch, cố định cao trích

đã được hòa tan bằng DMSO lên trên những đĩa giấy đặt trên môi trường có chứa

vi khuẩn, sau khi ú để vi khuẩn phát triển, đo đường kính vòng ức chế, tính bằng

ram

Thive hank

Đặt những đĩa giấy vô khuẩn có đường kính 6 mm lên môi trường có vi

khuẩn, cách đều nhau và cách bờ tối thiểu 20 mưn Hút 5Ó HÌ nhựa đầu đã pha loãng ở những nồng độ khác nhau, bắt đầu từ nồng độ thấp nhất, tấm lên đĩa giấy

⁄ TA 22 ` a a

Để yên môi trường ít nhất 1 giờ, sau đó ú vào tủ ẩm 37C

Đọc kết quả

Sau 24 giờ, đọc kết quả dựa trên sự biện diện của vòng ức chế vi khuẩn, đo bằng mm.