nghiên cứu và kết quả trong nghiên cứu thành phần cây sơn quỳ lá tròn

nghiên cứu và kết quả trong nghiên cứu thành phần cây sơn quỳ lá tròn

2 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUÁ

Cây Sơn Quì Lá Tròn Ti/honia tagetflora Desv được thu hái ở Củ Chi vào tháng 05 năm 2005 Cây được định danh bởi giảng viên Hoàng Việt, khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh và dược sĩ Phan Đức Bình, trường Đại học Y dược Thành Phố Hồ Chí Minh

Cây được lựa hái những lá già, không sâu bệnh, rửa sạch, để ráo, sấy khô, xay nhuyễn thu được 1,5 kg bột lá khô Bột lá khô này được ngâm trích với etanol

ở nhiệt độ phòng, lọc và loại bổ dung môi thu được cao thô etanol Bằng kỹ thuật

trích lổng-lỏng, cao etanol thô này được điều chế thành năm loại cao: cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform, cao acetat etyl và cao etanol Qui trình điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đổ 3.1 (trình bày ở phần thực nghiệm)

2.1 Khảo sát sơ bộ về hoạt tính kháng khuẩn

Các cao trích ở sơ đổ 3.1 được đem đi thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn gây bénh nhu: Shigella sonei, Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Escherichia coli (E coli)

Kết quả được trình bày bằng đường kính vòng vô khuẩn trong bảng 2.1

(phụ lục 30-32) Kết quả cho thấy chỉ có cao benzen và cao cloroform là có hoạt tính trên 2 chủng vi khudn Samonella typhi va ching Bacillus subtilis

2.2 Khảo sát sơ bộ các loại cao bing phé IR

Ngoài việc được khảo sát bằng thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, các loại cao còn được khảo sát bằng phổ IR để xác định cao nào có khả năng chứa những

hợp chất có nhóm #-metylen-7-butyrolacton Kết quả phổ IR (phụ lục 1-5) cho

thấy cao benzen, cao cloroform và cao acetat etyl có nhiều khả năng chứa những

ĐH.*H.TỰ NHIÊN

01339 |

12

Bảng 2.1: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao trích

(tính bằng đường kính vòng vô khuẩn, mm)

Shigella | Salmonella Bacillus | Escherichia

e Shigella sonoi : vị khuẩn Gram âm, hình que; là loài vị sinh vật gây

bệnh kiết ly, chỉ gây bệnh cho người,

® Salmonelia typhi : vị khuẩn Gram âm, gây bệnh viêm ruột, thương hàn

® Escherichia coli : vị khuẩn Gram âm, gây đau bung, tiéu chay

e Bacillus subtilis : vị khuẩn Gram đương, có lợi cho tiêu hóa,

hợp chất có nhóm chức a-metylen-zbutirolacton do có các mũi hấp thu ở 1717-

1760 và 1601cmÌ,

2.3 Sắc ký cột trên một số loại cao của sơ để 3.1

Từ kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kết quả phổ IR, chúng tôi

quyết định khảo sát trên cao cloroform và cao benzen Kết quả sắc kí cội cao

cloroform và cao benzen thu được bốn hợp chất tạm đặt tên là: TAGE-CI,

TAGE-C2, TAGE~-C6, và TAGE-BI Cao eter dau héa tuy có hoạt tính kháng

khuẩn yếu nhưng có lượng nhiều nên cũng được chọn để sắc kí cột và sắc kí điều chế và đã cô lập được một hợp chất tạm đặt tên là TAGE-EB

2.4 Khảo sát cấu trúc môi số hợp chất cô lâp được

2.4.1 Khảo sát cấu trúc hợp chất TAGE-CI

Hợp chất này có dạng đầu, mầu vàng nhạt, Hợp chất được cô lập từ phân

đoạn C23 của bang 3.2

hưởng với C=O), 2 C-O Phổ đồ '“C-NMR được trình bày trong bằng 2.2

Biện luận cấu trúc

Từ phổ 'H và °C, dém sé proton va carbon cho biết hợp chất có công thức phân tử là C¡;H„sO¿ Hợp chất này có độ bất bão hòa Q=4, phd để cho thấy hợp

chất có một nhóm C=O và hai nối đôi C=C nên hợp chất này phải có một vòng Phân tích phổ proton cho thấy hợp chất có:

e Hai proton oleũn ở 5,88 ppm (1H; đỏ; 5,1 và 15,6 Hz; H-8) va proton ở 5,79 ppm (1H: dd; 0,6 va 15,6 Hz; H-7) ghép trans với nhau với hằng số ghép là 15,6 Hz Proton 6 5,88 ppm lai ghép spin với proton trên carbon có nhóm OH 6 4,41 ppm (1H; dq: 5,7 va 6,6 Hz; H-9) Proton H-9 lại bị chế 4 bởi ba proton của nhóm metyl ở 1,29 ppm (3H; d; 6,3 Hz, H-10) Số liệu phổ nêu trên cho thấy hợp

chất có mảnh phân tử sau:

OH { 9

== CH,

/`

e Hai tin hiéu é 1,07 ppm (3H; s; H-11/12) và 1,00 GH; s; H-12/11) chứng

tổ có hai nhóm mety! gắn trên carbon tứ cấp, Thêm nữa là có hai tín hiệu của

proton không tương đương kế với carbon carbonyl ở 2,47 ppm (1H; d; 17,1 Hz, H- 3a/3b) và 2,26 (1H; đ; 17,1 Hz; H-3b/3a) chứng tổ trong phân tử có một nhóm

CH; gắn vào carbon tứ cấp và hai proton này ghép spin lẫn nhau Ngoài ra phổ

ĐC còn cho thấy hợp chất này có một nhóm carbony] bất bão hòa Từ những điều

này cho thấy phân tử thêm một mánh nữa như sau:

Từ những mảnh phân tử trên chúng tôi để nghị cấu trúc của hợp chất

TAGE~C1 như trong hình 2.1

Hợp chất này có cấu trúc giống với hợp chất Vomifoliol nén ching (6i d4

so sánh đữ liệu phổ của hợp chất TAGE-CI với hợp chất Vomifohol (trình bầy trong bắng 2.2) Kết quả so sánh cho thấy đữ liệu phổ của hai hợp chất này giống nhau Vậy hợp chất TAGE-CI là Vomifoliol với tên khoa học là 3,5,5-Trinetyl-4-

(3-hydroxybuta-Í-enylcyclobhexa-2-en- Í -on-á-ol,

2.4.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất TAGE~C2

Hợp chất TAGE-C2 có dạng keo không màu, thu được từ phân đoạn C32

của bảng 3.3 Phổ !H (phụ lục 9), C (phụ lục 10), DEPT (phụ lục 11.! và 11.2),

HSỌQC (phụ lục 13), HMBC (phụ lục 14), và ROBESY (phụ luc 15.1 va 15.2) được trình bay trong bang 2.3

Biện luận cấu trúc

Phổ MS (phụ lục 8.1-8.3) cho thấy có các mũi với m2 = 344 (MỸ; 244 (M*

- CgHạO¿); và 83 (CzH;O: mũi cơ bản) đo đó hợp chất sẽ có gốc ester C;H;O¿, Bên cạnh đó, phổ !!C.NMR và DEPT cho thấy hợp chất có 20 carbon (được trình bay

trong bảng 2.3) trong đó có ba carbon nhất cấp, bốn carbon nhị cấp, bảy carbon tam cấp, và năm carbon tứ cấp Do đó hợp chất này sẽ có khối lượng phân tử là

344 tương Ứng với công thức phân tử là C;oH;„O; và không thể có nhóm hydroxy nghĩa là hợp chất chỉ có nhóm chức cster và efer

Những đỡ liệu phố NMR như: 'H, COSY 'H-ÌH (phu luc 12), HSQC cho

thấy hợp chất có 24 proton (được trình bay trong bằng 2.3) trong đó:

e_ Cặp mũi đôi ở 6,33 ppm (1H; d; 3,5; H-13a) và 5,64 ppm (LH; d; 3.0; H- 13b) là cặp mũi đặc trưng của hai proton thuộc nhóm œ-metylen-y-butyrolacton Phổ COSY !H-H cho thấy hai proton này ghép spin với prolon ở 2,98 ppm (1H; m; H-7) ngoài ra proton H-7 còn ghép spm với proton ở 5,06 ppm (2H; bị; H-6)

|

H ia

® Proton olefin 6 6,13 ppm (1H; qq; 1,5 va 7,5 Hz; H-3') ghép spin với hai nhóm mety! ở 1,98 ppm (3H; qd; 1,0 va 7,5 He, H-4’) va 1,86 ppm (3H, s, H-3’) Bên cạnh đó, phổ HMBC cho thấy những proton H-4` và 5` có tín hiệu giao với

carbon carbonyl ở 166,38 ppm (C-1') và phổ MS cho những tín biệu có z2 lần lượt là 344, 244, 83 do đó trong phân tử phải có nhóm ester C;zH:Ởa Do hai nhóm metyl nay ghép spin với nhau (7 = 1,5 Hz) nên hai nhóm metyl này có thể ở cùng phía với nhau

này liên kết với carbon tứ cấp

ø® Proton olefin & 5,16 ppm (1H; d; 10,0; H-1) ghép spin vdi proton gắn trên carbon C~O ở 4,86 ppm (1H; dq; 10,0 và 6,0 Hz; H-2), thêm nữa proton H-2 này lại ghép spin với hai proton ở 2,72 ppm (1H; dd; 6,0 va 11,0 Hz, H-3) và ớ 2,14 ppm (1H; đỏ; 11,0 Hz; H-3) có ghép spin với nhau với ở = 11,0 Hz

H

xo

?H

Cc 5H

3H Cc

e Hai proton metylen lién kết với carbon C-O 6 4,27 ppm (1H; d; 13,0 Hz; H-14) va 3,78 ppm (1H; d; 13,0 Hz; H-14) ghép spin với nhau và không ghép spin với những proton khác

18

Phé HMBC cho thay proton H-8 6 tin hiệu giao với C-9, C-7, C-6, C-10,

€-11, và C-I', từ đó có được sự hên kết của những mảnh phân tử thành một mảnh

lớn hơn như sau:

Phổ HMBC còn cho tín hiệu giao giữa những proton H-3 với những carbon C-15, C-2, C-5, và C-4 cùng với những tín hiệu giao của H-1 với C-9 va C-14, Ty

đó cho thấy hợp chất TAGE-C2 là một sesquiterpen lacton với khung sườn là

germacranold như sau

Hóa lập thể của hợp chất TAGE-C2 (hình 2.2) được xác định chủ yếu dựa trên phổ !H và phổ ROESY (phụ lục 15.1 va 15.2)

Bảng 2.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TAGE-C2

e Phổ ROESY cho tín hiệu giao giifa proton H-7 va H-9b nén hai proton này phải cùng hướng với nhau Bên cạnh đó proton H-9b ghép spin vdi proton H-8 với hằng số ghép 77 = 1,5 Hz nén góc nhị điện giữa proton H-8 và H-9b khoảng 6Š” nghĩa là proton H-8 phải hướng ra ngoai vòng,

*® Proton H-8 và proton H-13b có tín hiệu giao trong phố ROESY nên hai proton này phải cùng phía và gần với nhau

® Proton H-1 ghép spin với H-2 với hằng số ghép J = 10,0 Hz nên góc nhị điện tạo bởi hai proton này vào khoảng 47! nên H-2 phải hướng ra phía sau phía bên trái

e Proton H-2 và proton H-14a có tín hiệu giao trên phổ ROESY nên hai proton này phải cùng hướng với nhau nghĩa là H-14a hướng ra phía sau

® Proton H-3a ghép spin với prolon H-2 với J =6,0 Hz nên proton H-3a phải hướng ra ngoài vòng giống như H-2 và góc nhị diện giữa hai proton này khoảng 37 Điều này được khẳng định thêm bởi tín hiệu giao giữa proion H-2a với proton H-1 và với proton H-15 xuất hiện trong phể ROESY

e Tín hiệu giao giữa proton H-3b với proton H-6 trong phổ ROESY cho

thấy proton H-6 phải nằm ở phía trên của vòng và do đó cùng hướng với proton

H-7

e Phổ ROESY cho tín hiệu giao giữa proton H-15 với H-5' do đó 2 nhóm metyl này phải cùng phía với nhau

e Phổ ROESY không có tín hiệu giữa proton H-3' và H-5' đồng thời lại

xuất biện tín hiệu giao giữa proton H-4' và H-5' nên bai nhóm metyl gắn trên nối

đôi của C-2ˆ và C-3” phải ở vị tri cís với nhau

Vậy hợp chất TAGE~C2 được để nghị là (2'E, 42, 10Z)-8a-(2’-Metylbuta- 2-enoyloxy)-2,14-epoxygermacra-4, 10(1), 11(13)-trien-6,12-olid vdi cấu trúc được trình bày như trong hình 2.3

21

( 2'E, 42, 102Z)-8a-(2'-Metylbuta-2’-enoyloxy)- -2,14-epoxygermacra-4, 10(1), 11(13)-trien-6,12-olid

(TAGE.C2 )

Hình 2.3: Cấu trúc của hợp chất TAGE~C2

2.4.3 Khảo sát cấu trúc hợp chất TAGE-Có

Hợp chất TAGE-C6 thu được từ phân đoạn C32 của bảng 3.3 Hợp chất này

có đạng keo không màu

Phổ !H (phụ lục 16.1-16.6) được trình bầy trong bang 2.4

Phổ PC-NMR (phu luc 17.1-17.3) cla hop chat TAGE-C6, & ppm: 207,09;

177,26; 175,57; 166,68; 141,52; 137,95; 136,47; 129,30; 126,65; 75,40; 67,70; 61,21; 53,00; 48,97; 48,30; 43,24; 41,74; 38,65; 30,69; 20,64; 18,17; 18,03; 16,01 Trong số những tín hiệu này tín hiệu ở 207,09 và 30,69 ppm là của dung môi aceton còn sót lại trong mẫu chất,

Biện hiận cấu trúc

Phố ‘H-NMR cho thấy hợp chất có 26 proton Hợp chất này cũng có nhóm

angeloyloxy như hợp chất TAGE-C2 với các tín hiệu như: 6,17 ppm (1H; qq; 7,2; 1,8; H-3'), 2,02 ppm (3H; dq; 7,2; 1,8; H-4’) va 1,92 ppm (3H; dq; 1,5; 1,5; H-5)

So sánh phổ !H và C-NMR ca hop chat nay vdi hop chat TAGE-C2

cho thay:

® Phé ‘H-NMR ciia hop chat TAGE-C6 kha gidng v6i phé ‘H-NMR cia hợp chất TAGE~C2, nó không có những tín hiệu cua hai proton metylen olefin 6

Hình 2.4: Cấu trúc của hợp chất TAGE-C6 va TAGE-C2

Bảng 2.4: So sánh phổ NMR của hợp chất TAGE—C6 với hợp chat TAGE-C2

3 6,17 (1H: qq; 7,2; 1,8) 141,52 | 6,13 (IH: qq; 1,5; 7.5) | 140,21 (a)

4 7,02 (3H; dq; 7,2: 1,8) 1601 | 1,97 (3H; qd: 1,0; 7,5) | 15,92 (q)_

5 1,92 (3H: dq; 1,5; 1,5) 20,64 1,86 (3H; s) 20,48 (a)

23

trên carbon C-13 ở 6,33 (1H; d; 3,5) và 5,64 (1H; đ; 3,0) như trong phể 'H-NMR của hợp chất TAGE-C2 mà thay vào đó là những tín hiệu của những proton ở 2,42 (3H; m) va 3,48 (LH: dd; 7,8; 1,8)

e Phé "C-NMR cia hop chdt TAGE-C6 cling kha gidng vdi hop chat

TAGE~.C2 tuy nhiên ở vùng từ trường thấp, hợp chất TAGE-C6 có ít hơn hợp chất

TAGE-C2 hai carbon oleñn, đồng thời ở vùng từ trường cao lại có thêm hai carbon sp’

Từ những điều trên cho thấy hợp chất TAGE-C6 là hợp chất TAGE-C2

đã bị hydrogen hóa nối đôi ở vị trí ¡1(13) Do chưa có phổ DEPT 135 va 90, hợp

chất TAGE-C6 được tạm thời để nghị là &-(2’-Metylbut-2-enoyloxy)-2,14-

epoxygermacra-4,10(1)-đien-6,12-olid với cấu trúc như sau:

§-(2'-Metylbuta-2'-enoyloxy)-2,14- -epoxygermacra-4, 10(1)-dien-6,12-olid

( TAGE-C6 }

2.4.4 Khảo sát cấu trúc hợp chất TẠGE-BI

Hợp chất TAGE-BI có dạng sáp màu trắng, thu được từ phân đoạn B62 của

bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR được trình bay trong bang 2.5

Biện luận cấu trúc

Phổ °C va DEPT (phu luc 20 va 21) cho thấy hợp chất TAGE-BI có 20

carbon trong đó có bốn nhóm carbon nhất cấp, ba carbon nhị cấp, bảy carbon tam cấp, ba carbon tứ cấp Bên cạnh đó phổ LC-MS (phụ lục 18.1 và 18.2) cho mũi có

24

m/z = 362,9 do d6 hợp chất này phải có CTPT: C;oH;¿Os và phải có ít nhất một

nhóm OH

Phổ 'H-NMR (phụ lục 19) cho thấy hợp chất có 25 proton trong đó có

© Mũi đa ở 6,11 ppm (1H; qq; 7,0; 1,5 Hz; H-3') ghép spin với những proton của hai nhóm metyl ở 1,97 ppm (3H; dq; 7,0; 1,5 Hz; H-4’) va 1,85 ppm (3H; q; 1,0 Hz; H-5’) Bên cạnh đó, proton cia hai nhóm metyl ghép spin vdi nhau (J =1,5 Hz) va phổ HMBC (phụ lục 24) cho tín hiệu giao giữa proton H-3' với carbon carbonyl C-1’ (166,45 ppm; s) Do đó hợp chất này sẽ có nhóm angeloyloxy

hai proton của nhóm œ-metylen-y-butyrolacton Phổ COSY "H-'H (phụ lục 22) cho

thấy hai proton này ghép spin với proton ở 2,88 ppm (1H; m; H-7) Bên cạnh đó kết hợp phổ COSY !H-H với phổ HSQC cho thấy proton H-7 này còn ghép spin với hai proton gắn trên hai carbon C-O ở 6,66 ppm (1H; dd; 11,0 và 2,0 Hz; H-8)

và ở 5,21 ppm (1H; m; H-6) Mặt khác, phổ HMBC cho thấy những tín hiệu giao giữa hai proton H-13 với những carbon C-6, C-7, C-8, C-11, và carbon carbonyl C-

12 do đó hợp chất TAGE-B1 sẽ phải có mảnh phân tử

e Proton H-8 ghép spin vdi proton olefin 6 5,33 ppm (1H; dd; 11,0; 1,5 Hz; H-9) Proton H-9 nay cdn ghép spin với những proton của nhóm metyl ở 1,81 ppm (3H; d; 1,5 Hz; H-14) Do đó mảnh phân tử A được mở rộng thành