Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 5 pdf

Giải thích thuật ngữ - Kỹ thuật Polymerase chain reaction PCR là kỹ thuật sử dụng chuỗi các phản ứng nối tiếp nhau dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự DNA đích thông qu

CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN

V.1 PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR

Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ Thủy sản ban hành năm 2004

(nguồn: http://www.fistenet.gov.vn/standard.asp)

V.1.1 Ðối tượng và phạm vi áp dụng

- Quy trình này quy định trình tự, nội dung phương pháp phát hiện vi-rút gây hội chứng đốm trắng (sau đây gọi tắt là bệnh vi-rút đốm trắng) bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR)

- Quy trình này để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm nuôi thương phẩm của các loài tôm thuộc họ tôm He bằng kỹ thuật PCR Có thể sử dụng Quy trình này để chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng cho các loài giáp xác khác

V.1.2 Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành

- Lightner D.V (Ed.) (1996) Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for

Diseases of Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, USA

- Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F.,

Su M.S., Wang C.H & Kou G.H (1996) White spot syndrome baculovi-rút (WSBV)

detected in cultured and captured shrimps, crabs and other arthropods Dis Aquat Org., 27, 215-225

- Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H., Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh P.Y., Huang C.J., Chou H.Y., Wang C.H & Kou G.H (1996) Detection of baculovi-rút associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase

chain reaction Dis Aquat Org., 25, 133-141

- Newton C.R and Graham A (1994) PCR The Alden ss Ltd, Oxford, UK

V.1.3 Giải thích thuật ngữ

- Kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR) là kỹ thuật sử dụng chuỗi các phản ứng nối tiếp nhau dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự DNA đích thông qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính DNA, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym DNA polymerase

- DNA polymerase là enzym tổng hợp nên mạch DNA mới từ một mạch khuôn, có thể tham gia vào quá trình sao chép

- Bp (Base pair) là cặp liên kết A -T hoặc C - G trên một phân tử DNA mạch kép và là đơn vị đo chiều dài của một phân tử DNA

- Mồi (Primer) là một trình tự DNA ngắn, bắt cặp với một mạch khuôn DNA có mang một đầu 3’-OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới

- Mồi xuôi và mồi ngược: được hiểu theo chiều của phiên mã ngược

- Sự biến tính (Denaturation) là sự biến tính của DNA tách từ mạch kép sang dạng mạch đơn Tác nhân gây nên sự biến tính thường là nhiệt

- Phiến mang tôm là phần cấu tạo gồm nhiều tơ mang hợp thành mang tôm Các tơ mang gồm các tế bào có chức năng chính là hô hấp

V.1.4 Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất

- Máy ly tâm (tốc độ không nhỏ hơn 13.000 vòng/phút)

- Máy luân nhiệt

- Bộ điện di gồm nguồn và bồn điện di ngang

- Bàn đọc kết quả với tia UV , bước sóng 302 nm

trình tự DNA SalI 146 Trình tự mồi cụ thể như sau:

ƒ 146F1: 5’ ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3’ (mồi xuôi);

ƒ 146R1: 5’TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3’ (mồi ngược);

ƒ 146F2: 5’GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3’ (mồi xuôi);

ƒ 146R2: 5’ TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T 3’ (mồi ngược)

Nồng độ của mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 25 mM trong dung dịch đệm TBE Ðệm TBE có thành phần như sau: 10 mM Tris -HCl (pH = 8,0) và 1 mM EDTA

Hóa chất

Dung dịch để tách chiết DNA: sodium dodecyl sulfat - NaOH (SDS - NaOH)

ƒ NaOH 0,5 N (20 X): hoà tan 2 g NaOH trong 100 ml nước cất vô trùng

ƒ SDS 0,25 % (20 X): hòa tan 0,25 g SDS trong 100 ml nước cất vô trùng (không được hấp vô trùng)

ƒ 4.2.2.2 Dung dịch NaOH 0,025 N - SDS 0,0125 %

ƒ NaOH 0,5 N: 5 ml

ƒ SDS 0,25%: 5 ml

ƒ Nước cất vô trùng vừa đủ: 100 ml

ƒ Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 4oC

PCR master mix cho 50 ml phản ứng khuếch đại gồm:

ƒ Taq DNA Polymerase: 1,25 units

ƒ Tris-HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM

ƒ (NH4)2SO4: 20 mM

ƒ MgCl2: 1,5 mM

ƒ Tween 20: 0,01%

ƒ dATP, dCTP, d GTP và dTTP: 0,2 mM mỗi loại

Thang DNA fX174/HaeIII

Dung dịch đệm TBE (Tris - axit boric - EDTA)

ƒ EDTA (ethylene diamine tetra acetic) 0,5 M: hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước rồi chỉnh cho dung dịch có pH = 8 bằng NaOH Sau đó, thêm nước cất cho

đủ 500 ml Tiến hành hấp vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ trong phòng

Agarose 1% trong dung dịch TBE

Dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue và glycerol) 6 X gồm: bromophenol blue 0,25 %

và glycerol 40 %

Dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml)

V.1.5 Chuẩn bị mẫu

V.1.5.1 Số lượng mẫu

Ðối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae): Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 100

mg cá thể lấy nguyên con

Ðối với mẫu tôm bố mẹ: Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg lấy ở phiến mang tôm hoặc cuống mắt hoặc chân bơi

Ðối với mẫu tôm thương phẩm: Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng là 100 mg lấy ở phiến mang tôm Mẫu tôm thương phẩm được lấy trong 2 trường hợp:

a) Nếu ao có tôm bị bệnh, phải lấy mẫu khoảng 10 - 20 cá thể có dấu hiệu bệnh lý

rõ nhất

b) Nếu ao tôm đang phát triển bình thường hoặc không thấy dấu hiệu bệnh lý, phải lấy ngẫu nhiên khoảng 20 - 30 cá thể

V.1.5.2 Yêu cầu đối với mẫu để phân tích

Mẫu phải được lấy khi tôm còn sống và được bảo quản ngay trong cồn 95 % Thể tích cồn sử dụng để bảo quản phải không nhỏ hơn 3 lần so với thể tích mẫu cần phân tích Sau khi cố định, mẫu được lưu giữ ở nhiệt độ khoảng 25 - 30oC trong 1 tuần lễ Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn nữa phải thay cồn mới

V.1.6 Phương pháp tiến hành

V.1.6.1 Xử lý mẫu

ƒ Mẫu được nghiền trong bộ nghiền mẫu vô trùng với 900 ml dung dịch tách chiết DNA Dung dịch sau khi nghiền được dồn vào eppendorf 1,5 ml để làm biến tính bằng cách đun sôi cách thủy trong khoảng 5 -10 phút rồi làm lạnh nhanh bằng cách cho vào nước đá

ƒ Tiến hành ly tâm dịch nghiền trong 5 phút bằng máy ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút Sau đó, thu phần dịch nổi để thực hiện phản ứng PCR Nếu mẫu chưa được phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC trong vòng 1 tuần lễ

Thành phần 50 ml phản ứng PCR bước 1 như sau:

ƒ Ðối với mẫu thử: hút 46 ml PCR master mix cho vào ống eppendorf 0,2 ml rồi thêm vào 1 ml mồi 146F1 và 146R1 có nồng độ 25 mM và 2 ml dịch chiết DNA

Chế độ phản ứng khuếch đại: ở nhiệt độ 94oC trong 4 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ

94oC trong 1 phút; ở nhiệt độ 55oC trong 1 phút; ở nhiệt độ 72oC trong 2 phút (39 chu kỳ); ở nhiệt độ 72oC trong 2 phút (1 chu kỳ); ở nhiệt độ 4oC cho đến khi phân tích

Sản phẩm khuếch đại bước 2 được điện di ngay trên thạch agarose 1% có chứa ethidium bromide

V.1.6.3 Tiến hành điện di

Chuẩn bị gel agarose 1%

Gel agarose được pha trong dung dịch đệm TBE 1 X Sau khi đun chảy hoàn toàn thạch,

để nguội tới nhiệt độ khoảng 60oC rồi thêm vào 5 ml dung dịch ethidium bromide và 100

ml agarose Gel agarose được để vào khuôn có sẵn các lược để tạo giếng Gel điện di phải

có độ dày khoảng 3 - 4 mm Gel sau khi đã chuẩn bị phải được ngâm chìm trong dung dịch đệm TBE 1 X

Khay điện di:

Khay điện di chứa dung dịch đệm TBE 1 X

Giếng 8 là mẫu đối chứng âm

V.1.8 Quy định về đảm bảo an toàn

Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các quy định sau đây:

ƒ Thuốc nhuộm ethidium bromide là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật Do đó, khi sử dụng hóa chất này phải mang găng tay và kính bảo hộ Dung dịch sau sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ

ƒ Chỉ được bật đèn cực tím UV để quan sát kết quả sau khi đã đóng kính bảo vệ

ƒ Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc chuẩn bị mẫu

ƒ Phòng thí nghiệm phải bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả

V.2 PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV

Nguồn: Farming IntelliGene Technology Corporation (http://www.iq2000kit.com)

V.2.1 Giới thiệu

Kit IQ2000 (Farming Intelligene, Đài Loan) phát hiện và định loại YHV/GAV trên tôm

he là một hệ thống thương mại sinh học phân tử cho việc phát hiện hai loại virut này IQ2000 YHV/GAV có thể phát hiện và phân biệt prototype của hai loại vi-rút này và cho kết quả mức độ nhiễm dựa theo các mẫu đối chứng Đặc điểm sinh học tự nhiên của GAV và YHV và trình tự RNA của chúng được sử dụng để thiết kế bộ kit dựa vào kết quả nghiên cứu của CSIRO, Úc và BIOTEC, Thái Lan

Nhiều kết quả nghiên cứu gần đây ở các nước Đông Nam Á cho thấy có nhiều virut khác

có quan hệ với YHV/GAV Do chưa có thông tin đầy đủ về các virut mới này nên Kit IQ2000 YHV/GAV có thể không phát hiện được những virut có liên quan với virút YHY/GAV, hay có thể phản ứng chéo với những virut này Sự tác động và ảnh hưởng của những virut này đối với ngành công nghiệp nuôi tôm và mối quan hệ giữa chúng với YHV/GAV phát hiện đầu tiên hiện nay vẫn còn đang được nghiên cứu

V.2.2 Thành phần

Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của

YHV/GAV

Gồm có dung dịch đệm cho phản ứng, dNTPs, và mồi chuyên biệt của

YHV/GAV

Đối chứng dương YHV 1 ống, 100 µl/ống,104 copies/µl Đối chứng dương GAV 1 ống, 100 µl/ống,104 copies/µl

6X loading Dye (dung dịch nạp mẫu) 1 ống, 1500 µl/ống

DNA moclecular weight marker (thang DNA) 1 ống, 100 µl/ống

848 bp, 630 bp & 333 bp

RNA Extraction Solution (Dung dịch ly trích RNA) 1 chai, 100ml/chai, giữ ở 4 °C

V.2.4 Giới hạn phát hiện và tính nhạy

Giới hạn phát hiện và tính nhạy của kit IQ2000 YHV/GAV tùy thuộc vào nguốn mẫu chẩn đoán Dựa vào đặc điểm phân bố của virut trên tôm, mang là cơ quan tốt nhất để thu mẫu đối với tôm ấu niên và tôm trưởng thành Các nguồn mẫu thường dùng để chẩn đoán được trình bày ở bảng sau:

Bảng 5.1: Các nguồn mẫu dùng để chẩn đoánn WSSV Mẫu Số lượng kiểm tra Giới hạn phát hiện Đương lượng của

tính nhạy cảm Plasmid DNA

đến 5g/con) Nguyên mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu Mang (tôm 5g/con

đến tôm bố mẹ) 2-3 phiến mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu Mang (tôm bố mẹ) Nữa phiến mang 20 bản sao/phản ứng 2000 bản sao/mẫu

Theo bảng trên thì kết quả chẩn đoán âm tính có nghĩa là mẫu phân tích không nhiễm YHV/GAV hoặc mẫu bị nhiễm ở mức thấp hơn khả năng phát hiện của phương pháp Các kết quả trình bày ở bảng trên được thực hiện theo thao tác và hoá chất như hướng dẫn trong tài liệu này

V.2.5 Chuẩn bị mẫu và ly trích RNA

V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA

a Cho mẫu vào ống típ 1.5ml có chứa 500 µl dung dịch li trích RNA

b Nghiền mẫu trong tip bằng que nghiền, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

c Thêm 100 µl CHCl3 sau đó lắc kỹ trong 20 giây Giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, sau đó li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút

d Chuyển 200 µl phần trong phía trên sang một típ 0.5 ml mới có chứa 200 µl propanol (isopropanol)

2-e Lắc nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol

f Rửa phần viên bằng 0.5 ml ethanol 75%, sau đó ly tâm cho lắng xuống trong 5 phút ở 7500 vòng/phút đến khi xuất hiện phần viên, sau đó rút bỏ ethanol và làm khô phần viên

g Hoà tan phần viên với nước cất

V.2.5.2 Hoà tan RNA

Do các mẫu có nguồn gốc khác nhau có hàm lượng RNA khác nhau, cần điều chỉnh nồng độ RNA bằng cách hoà tan với lượng dung dịch nước cất khác nhau:

Nguồn mẫu Liều lượng

- Iqzyme DNA Polymerase 2 Ul/µl 0.5 µl

- Reverse Transcription (RT)Enzyme Mix 0.5 µl

b Phản ứng nested PCR : 15 µl/phản ứng

Chuẩn bị các chất cần thiết sau:

- Nested Pre-Mix reagent 14 µl

- Iqzyme DNA Polymerase 2UI/µl 1 µl

V.2.6.2 Điều kiện phản ứng

a Phản ứng RT-PCR 42 °C trong 30 giây

20 °C trong 30 giây cho kết thúc ở vòng cuối cùng

b PCR bước 2 94 °C trong 20 giây

- Pipet 8 µl RT-PCR cho vào típ phản ứng 0.2ml đã được đánh dấu

- Thêm 2 µl mẫu RNA cần xét nghiệm hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng trộn đều

- Sau khi trộn, mẫu đã sẵng sàng để điện di

Ghi chú : nên sử dụng 10 bản sao/µl mẫu đối chứng cho mỗi lần khuếch đại để kiểm soát

độ nhạy của phản ứng Nên dùng Yeast tRNA (kèm theo kit) để pha loãng mẫu đối chứng dương Cần phải giữ mẫu đối chứng dương ở - 20 °C khoảng 1 tuần trước khi sử dụng

V.2.7 Điện di

V.2.7.1 Chuẩn bị bản thạch (gel)

a Trước tiên, chọn dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE hay TBE Sau đó pha loãng dung dịch ở nồng độ 1X để chuẩn bị gel và làm dung dịch đệm để chạy điện di Lưu ý dung dịch dùng chạy điện di và chuẩn bị gel phải giống nhau

b Nên sử dụng 2 % agar (2 g/100 ml) Hoặc điều chỉnh theo tỉ lệ cho thích hợp Nên sử dụng chai có miệng rộng hay bình tam giác

c Đun nóng dung dịch agar cho tới khi agar tan hoàn toàn Có thể sử dụng đèn cồn, bếp ga, nồi đun hoặc lò vi ba Tránh để gel sôi quá tràn ra ngoài

d Để nguội gel khoảng 50 °C và đổ agar từ từ vào khay đựng gel Thể tích gel tùy thuôc vào kích cỡ của khay đựng gel Thường bề dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0.3 - 0,5 cm và bề dày của gel không quá 0.8 cm

e Cẩn thận di chuyển lược gel và các khoá ở hai bên khi gel đã đặc lại Gel sẽ được đem đi điện di Không nên để gel ở nhiệt độ phòng lâu hơn 4 giờ

V.2.7.2 Điện di

a Cho gel vào bồn điện di Phân tử DNA sẽ di chuyển sang cực dương vì DNA mang điện tích âm

b Thêm dung dịch điện di vào hộp cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel

c Thêm 5-10 µl dung dịch nạp mẫu vào trong từng giếng một Dung dịch nạp mẫu sẽ chìm xuống đáy giếng vì nó nặng hơn dung dịch đệm, cẩn thận để tránh làm nhiễm mẫu

d Phải dùng thang DNA cho từng gel, mỗi gel dùng 5 µl cho hai giếng hai đầu Mục đích của việc sử dụng thang DNA là nhằm để xác định trọng lượng phân

tử của sản phẩm PCR

e Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nối bồn điện di với nguồn điện và nhấn nút ON Nên kiểm tra lại dòng điện và sử dụng 100-150V (không nên dùng quá 150V) để chạy gel

f Dung dịch nạp mẫu có chứa hai loại phẩm màu Bromphenol blue có màu xanh đậm, xylene cyanol có màu xanh nhạt Nên ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel Sau đó di chuyển khay điện di ra khỏi bồn điện di để chuẩn bị nhuộm ethidium bromide (EtBr)

g Nếu chạy nhiều gel trong cùng 1 ngày, có thể tái sử dụng dung dịch điện di Nếu không, để tránh hiện tượng lây nhiễm không nên tái sử dụng dung dịch điện di và nên rữa hộp điện di bằng nước sạch nhiều lần ngay khi kết thúc quá trình điện di

V.2.7.3 Thuốc nhuộm gel và đọc kết quả

a EtBr thường được chuẩn bị từ nguyên liệu tinh 10 mg/ml Hoá chất này nên trữ trong chai nâu vì chúng dễ bị hỏng Chú ý EtBr là tác nhân gây ung thư, nên mặc trang phục bảo vệ và đeo găng tay khi sử dụng hóa chất này

b Pha loãng 10 mg/ml nguyên liệu gốc 20,000 lần (ví dụ: cho 5 µl dung dịch EtBr 10 mg/ml vào 100 ml nước cất)

c Đổ dung dịch EtBr trên khay nhựa với gel đã điện di Thuốc nhuộm phải bao phủ gel

d Nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Sau đó, đặt gel vào một khai nhựa khác có nước cất trong 10 phút để rữa phần thuốc nhuộm thừa

e Đặt gel trên bàn UV để đọc kết quả

V.2.8 Đọc kết quả

1 Mẫu dương tính và mẫu đối chứng dương hiện ra những vạch trên gel

Hình 7.2 Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

- Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng

- Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng

- Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng

- Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng

- Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng

- Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng

- Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng

- Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ

- Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng

- Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ

- Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV

- Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp

2 Những mẫu YHV/GAV âm tính hiện vạch 680 bp là RNA thông tin của tôm

3 Phương thức chẩn đoán

a Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 277 bp và vạch 777 bp thì mẫu nhiễm YHV nặng

b Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nhẹ

c Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng với vạch 406 bp và vạch 777 bp thì mẫu nhiễm GAV nặng

d Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ

e Nếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 680 bp thì mẫu âm tính YHV/GAV

4 Mỗi xét nghiệm PCR cần có mẫu đối chứng âm và dương Nếu mẫu đối chứng dương

có 103 bản sao mà kết quả không hiện lên vạch 277 bp hoặc 406 thì có nghiã là phản ứng PCR đó sai hoặc RT sai hoặc cả hai cùng sai Nếu mẫu đối chứng âm cho kết quả vạch 277 bp Hoặc 406 bp thì mẫu đó bị tạp nhiễm

V.2.9 Khắc phục sự cố kỹ thuật

Bảng 5.2: Các sự cố kỹ thuật thường gặp, nguyên nhân và cách khắc phục

Sự cố hay triệu chứng Nguyên nhân Cách khắc phục

Vạch hiện lên không rõ

hoặc không hiện sau

điện di

1 Dung dịch EtBr mất phẩm chất

2 Chưa bật đèn UV

3 Nền agar quá cứng

4 Nền agar qua dày

1 Thay dung dịch BtEr khác hoặc nhuộm lâu hơn

2 Kiểm tra máy UV

3 Ngâm gel trong nước sạch 4 °C khoảng 30 phút

4 Điều chỉnh gel nếu gel dày hơn 0.8

cm và chạy điện di lại Đối chứng dương hiện

các vạch bình thường

nhưng thang DNA

không hiện vạch nào

Thang DNA mất phẩm chất hoặc quá nhẹ Thay thang DNA hoặc tăng thêm lượng thang DNA nạp vào

Thang DNA hiện vạch

bình thường nhưng đối

2 Cho thêm Iqzyme vào

3 Thay đối chứng dương mới Đối chứng dương 103

hiện vạch nhưng đối

chứng dương nhiễm

nhẹ không hiện vạch

1 Đối chứng dương mất phẩm chất

2 Đối chứng dương 104 mất phẩm chất

3 Iqzyme hoạt động kém

1 Thay đối chứng dương mới

2 Thay đối chứng dương 104

3 Xem lại hạn sử dụng và các điều kiện của Iqzyme hoặc thay Iqzyme mới

Đối chứng âm hiện

1 Rửa pipet, dùng típ mới Nên dùng riêng các lọai pipet cho PCR

2 Chạy phản ứng lại với hoá chất mới

3 Tham khảo ý kiến của Farming IntelliGene đề tiệt trùng PTN

bị ức chế Nếu đối chứng dương 103không hiện vạch thì phản ứng PCR

bị ức chế cần ly trích RNA lại

V.3 PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP

V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn

(nguồn: Diagnostic Bacteriology, AAHRI, 1996)

Các mẫu bệnh phẩm thủy sản được khử trùng bằng cồn 70o và giải phẫu bằng bộ tiểu phẫu vô trùng Vi khuẩn được phân lập từ gan, thận hay tụy và cấy lên môi trường Tryptic Soy Agar (TSA, Difco) và sau đó là môi trường chọn lọc, chẳng hạn như Aeromonas agar (Oxoid) có chứa ampicilin (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), hay môi trường TCBS Đĩa agar được ủ 24 giờ ở 28 °C Các khuẩn lạc đặc trưng được chọn để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và kiểu ribosom cùng với chủng chuẩn Các chủng vi khuẩn được trữ ở -80 °C trong môi trường nutrient broth (NB, Oxoid) có chứa 15% glycerol và 1-1.5 % NaCl tuỳ theo mẫu là thuỷ sản nước ngọt hay nước lợ

V.3.2 Phương pháp RFLP

(nguồn: Pedersen, K & J.L Larsen (1993) rRNA gene restriction patterns of Vibrio anguillarum serogroup O1 Diseases of Aquatic Organisms 16: 121-126)

V.3.2.1 Ly trích DNA

Vi khuẩn được nuôi 16 giờ trong 10 ml veal infusion broth có chứa 1 % NaCl Sau đó 1.5

ml dung dịch vi khuẩn được ly tâm 2 phút ở 13,000 vòng/phút, rút bỏ phần môi trường, trộn đều với 500 µl dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) trước khi cho

20 µl dung dịch 10 % SDS vào và ủ 30 phút ở 56 °C để làm vỡ tế bào vi khuẩn Sau khi ủ xong, dung dịch được trộn đều với 250 µl ammonium acetate, pH 4.5, để 15 phút ở -20

°C trước khi hoà vào 700 µl phenol:chloroform:isoamyalcohol (tỉ lệ 25:24:1) Sau đó dung dịch được ly tâm 15 phút ở tốc độ 13,000 vòng/phút, phần trong phía trên sau khi ly tâm được chuyển sang ống eppendop mới trộn với 800 µl chloroform:isoamyalcohol (tỉ lệ 24:1) và ly tâm 15 phút ở vận tốc 13,000 vòng/phút Phần trong phía trên lại được chuyển sang ống eppendop mới lần nữa để kết tủa DNA bằng 350 µl isopropanol Hỗn hợp được

để 30 phút ở -20 °C, ly tâm 15 phút với tốc độ 13,000 vòng/phút, hút bỏ phần dung dịch, rửa DNA bằng dung dịch 70 % ethanol, làm khô ở nhiệt độ phòng và hoà tan trong 10 µl dung dịch TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA) Hàm lượng DNA được đo bằng quang phổ kế ở bước sóng 260 nm

V.3.2.2 Cắt DNA bằng enzym giới hạn

DNA ly trích từ vi khuẩn được cắt bằng enzym giới hạn SmaI Phản ứng được thực hiện

gồm các thành phần: DNA ly trích từ vi khuẩn, 5 µl 10X restriction enzyme buffer, 3 µl

enzyme giới hạn (tuỳ theo giống vi khuẩn phân tích, chằng hạn như SmaI cho Aeromonas hay MluI cho Virio), thêm nước tinh khiết cho đạt dung tích 20 µl Hỗn hợp được trộn

đều, ly tâm nhanh và ủ 3 giờ ở 37 °C Sau đó hỗn hợp được trộn với 10 µl dung dịch nạp mẫu (2 mM EDTA pH 8.0; 0.1 % bromophenol blue; 30 % glycerol) và chạy điện di 18 giờ ở 25V trên gel (0.8 % agarose) bằng dung dịch đệm TAE (40 mM Tris, 40 mM sodium acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)

V.3.2.3 Quá trình khử puria, biến tính và thấm chuyển

Gel sau khi chạy điện di được ngâm 10 phút ở nhiệt độ phòng trong dung dịch khử puria 0.25 M HCl, rửa bằng nước cất và được xử lý 30 phút trong dung dịch 0.5 M NaOH và 1.5

M NaCl để làm biến tính DNA Sau đó, DNA trên gel được chuyển qua màng nylon bằng máy thấm chuyển chân không và được để 30 phút ở 80 °C để cố định DNA trên màng

V.3.2.4 Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng

DNA trên màng nylon được thấm với 20 ml dung dịch tiền lai và giữ 1 giờ ở 56 °C, rồi lai qua đêm ở 56 °C trong dung dịch lai chứa mẫu dò có trình tự bổ sung với RNA ribosom 16S và 23S của vi khuẩn Mẫu dò được đánh dấu bằng digoxigenin Sau khi lai, màng được rửa nhiều lần với dung dịch rửa

và pfge để định type vi khuẩn kháng chloramphenicol phân lập từ các trại nuôi thủy sản ở

đồng bằng sông cửu long Tạp chí Công nghệ Sinh học 4 (1): 1-10)

Màng chứa các vạch DNA được xử lý bằng phần mềm GelCompar (Applied Maths, Bỉ) Tỉ

số đồng dạng các vạch DNA của các chủng vi khuẩn được điểm số bằng hệ số tương quan Pearson Mức độ đồng dạng kiểu DNA của từng cặp chủng vi khuẩn được tính bằng phương pháp phân tích cụm với UPGMA và biểu thị bằng sơ đồ quan hệ của các chủng vi khuẩn

Ribotyping

.

molecular weight marker

Hình 7.3 Sơ đồ quan hệ các chủng vi khuẩn nghiên cứu với chủng chuẩn dựa trên kiểu ribosom xác định bằng hệ số tương quan Pearson tính bằng UPGMA sử dụng phần mềm GelCompair Thang DNA (Molecular mass marker): Hind III-digested l DNA (Nguồn: Đặng Thị Hoàng Oanh 2006 Đặc điểm sinh hoá và kiểu RNA ribosom của vi khuẩn Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm thuỷ sản nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Tạp Chí

Khoa học số 5 Đại học Cần Thơ)