i Lời cảm ơn Lời cảm ơn đầu tiên con muốn gửi đến ba mẹ và gia đình với lòng biết ơn sâu sắc. Ba mẹ đã cho con sự sống, gia đình cho con tinh thần và vật chất để con vững bước trên con đường học vấn và sự nghiệp. Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Duy và TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành đề án tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu và hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có được những nền tảng kiến thức không chỉ trong trong suốt quá trình học tập bốn năm tại trường và còn trên những bước đường đời sau nay. Bên cạnh đó, tôi còn muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ phòng thí nghiệm Viện công nghệ sinh học và Môi trường, các bạn Nguyễn Thị Hoàng Nhạn và Lê Thị Lệ lớp 50 SH, Nguyễn Thị Lý lớp 49 SH cùng tất cả các bạn lớp 49 SH và 50 SH đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện hỗ trợ để tôi hoàn thành đồ án này. Và một lần nữa xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người đã giúp đỡ và dành nhiều tình cảm cho tôi trong suốt thời gian qua. Nha Trang, ngày tháng 7 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thành Duy ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn 3 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum 9 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum 9 1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum 11 1.2.3. Khả năng tạo màng cellulose của Acetobacter xylinum 12 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn 15 1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới 15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam 16 1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài 18 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.2. Nội dung nghiên cứu 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum 26 2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum 27 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum 27 2.3.4. Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum 28 iii 2.3.5. Bảo quản chủng giống 30 2.3.6. Nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn 30 2.3.7. Thu nhận và xử lí màng cellulose vi khuẩn 31 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum 32 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum 33 3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum 34 3.4. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum 36 3.5. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose vi khuẩn Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose HS : Herstrin and Schram Glu : Gluccose GHK : Glucose hexokinase G6P : Glucose 6 phosphate G1P : Glucose 1 phosphate PGM : Phosphoglucoemutase UGP : UDPglucose pyro-gluco 6 phosphate PGA : Phosphogluconic acid PGI : Phosphoglucose isomerase FHK : Fructose hexokinase Frc : Fructose F6P : Fructose 6 phosphate 1PFK : Fructose 1 phosphate kinase F1P : Fructose 1 phosphate PTS : Hệ thống vận chuyển phosphat FDP :Fructose1,6 diphosphate PE : Polyethylen PVC : Polyvinylchlorua PP : Polypropylene v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC 5 Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose 5 Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 đến sự hình thành BC 6 Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 HPO 4 đến sự hình thành BC 7 Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC 8 Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC 8 Bảng 7: Một số ứng dụng của màng BC trên thế giới 15 Bảng 8: Mật độ và hình thái khuẩn lạc phân lập trên môi trường HS 32 Bảng 9: Sự thay đổi của pH trong suốt quá trình nuôi cấy 40 Bảng 10: Khảo sát tỉ lệ nước dừa trong nuôi cấy BC 40 Bảng 11: Các đặc điểm của màng BC 42 Bảng 12: Khảo sát khả năng chịu lực của màng BC 43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm 4 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 12 Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum 14 Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thực hiện nội dung nghiên cứu của đề tài 25 Hình 2.2. Các bước tiến hành nuôi tạo màng BC 31 Hình 3.1. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A 3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường HS 33 Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A 3 sau khi nhuộm Gram 34 Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A 3 trên môi trường HS lỏng 34 Hình 3.4. Phản ứng catalase của vi khuẩn A 3 36 Hình 3.5. Vòng sáng quanh khuẩn lạc A 3 sau thời gian nuôi cấy 37 Hình 3.6 Khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid của chủng A 3 38 Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo màng của chủng A 3 39 Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng nước dừa trong nuôi tạo màng BC 41 Hình 3.5. Màng BC qua các giai đoạn 42 1 LỜI NÓI ĐẦU Túi nilon là một sản phẩm của dầu mỏ, được sử dụng nhiều nhất và rất phổ biến trên toàn thế giới. Với các tính năng tiện dụng như dẻo dai, dễ sử dụng, đủ mọi kích cỡ, màu sắc và kèm theo đó là dễ loại bỏ khi không còn dùng, thì túi nilon trở thành một thứ sản phẩm hữu ích cho nhu cầu của con người. Rác thải túi nilon trong rác thải sinh hoạt thực chất là hỗn hợp các loại nhựa phế thải mà trong đó bao bì bằng nhựa polyethylene (PE) hoặc polypropylene (PP) chiếm đa số. Chúng thuộc loại polyethylene tỉ trọng thấp (LDPE) hoặc tỉ trọng cao (HDPE). Các loại vật liệu nhựa ra đời từ đầu thế kỉ XX và gia tăng rất nhanh về số lượng, chủng loại. Chỉ tính riêng LDPE năm 1999 thế giới đã sản xuất 27,4 triệu tấn, năm 2000 là 33,8 triệu tấn. Số liệu thống kê mức tiêu thụ ở một số nước trên thế giới vào năm 1994 như Mỹ là 108 kg/ người/ năm; Nhật Bản là 85 kg/ người/ năm; Hàn Quốc là 74,9 kg/người/ năm….Riêng tại Việt Nam, số liệu năm 1998 là 5,3 kg/ người/ năm và tăng lên 15 kg/ người/ năm vào năm 2003. Hiện tại số liệu này đang ngày càng gia tăng ( Viện Vật liệu xây dựng- Bộ xây dựng, 2003). Chính vì sự gia tăng rất lớn của nhu cầu sử dụng và sản xuất các loại bao bì nhựa mà lượng rác thải nilon cũng tăng theo. Kéo theo đó là các tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng. Thời gian phân hủy của túi nilon có thể kéo dài từ 50 đến 100 năm hoặc hơn nên còn rất nhiều tác hại mà nó có thể gây ra khi bị thải vào môi trường. Trước tình trạng báo động về ô nhiễm túi nilon và các tác hại của nó, các nhà khoa học đã nghiên cứu để tìm ra loại bao bì có nguồn gốc tự nhiên, thân thiện với môi trường. Có nhiều loại nguyên liệu đã được chú ý và đưa vào nghiên cứu như polylactic acid (PLA), polyglyconic acid (PGS)…Tất cả đều có nguồn gốc tự nhiên từ tinh bột của sắn, ngô, khoai tây và một số loại khác. Ngoài các loại nguyên liệu trên thì còn có một loại nguyên liệu khác rất có tiềm năng trong việc tạo bao bì thân thiện môi trường. Đó là màng cellulose vi khuẩn. 2 Đây là một polysaccharide được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao đổi chất trong môi trường nuôi cấy. Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium…nhưng các chủng vi khuẩn Acetobacter là loại vi khuẩn sản xuất cellulose là đáng chú ý nhất. Trong đó có chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum là loài có khả năng tạo ra màng cellulose tốt nhất. Ngoài thực phẩm, màng cellulose vi khuẩn đã và đang được nghiên cứu nhằm mở ra các hướng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác như y học, mỹ phẩm và mới đây là các triển vọng trong lĩnh vực môi trường. Với các đặc tính cơ học bền, chắc, dai, màng bacterial cellulose có thể ứng dụng tạo loại ra loại bao bì thân thiện môi trường. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “ Phân lập và nuôi cấy Acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi khuẩn” với mục đích: Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum từ nguồn cơ chất nước dừa. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo tiền đề ứng dụng làm bao bì sinh học. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn Cellulose được tổng hợp bởi một số loại vi khuẩn như Acetobacter, Rhizobium, Sarcina và Agrobacterium được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose- BC). Trong các vi khuẩn nói trên thì Acetobacter là loại vi khuẩn sản xuất cellulose đáng chú ý nhất (Brown và cs, 1976). Về mặt cấu trúc, BC có cấu trúc dạng bó sợi đan xen lẫn nhau. Các sợi sắp xếp không theo trật tự, không theo quy luật, chúng đan xen vào nhau từ mọi hướng. Do trong quá trình lên men, các vi khuẩn A. xylinum chuyển động hỗn độn không theo qui luật, kết quả là tạo ra tính bền, dai chắc về mọi phía của màng BC. Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy đặc trưng. Tuỳ thuộc vào yêu cầu ứng dụng mà ta chọn điều kiện nuôi cấy tĩnh hay động ( Trần Thị Diễm Chi, 2000). Về tính chất, BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng. BC còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao). Màng BC sau khi sấy ở 90 0 C thì sẽ mỏng như tờ giấy, bề mặt láng bóng, rất dai chắc. Do chuỗi polymer của màng BC có chứa nhiều nhóm OH - nên dễ dàng tạo liên kết hydro với nước, chính vì vậy mà bên trong toàn bộ màng BC sau nuôi cấy nước chiếm tới 99% ( Nguyễn Thúy Hương, 2008). 4 Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm (99% thành phần màng là nước) Dựa vào các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự (1967), Trần Phú Hòa (1996) đã tiến hành một số khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC. Thứ nhất, trạng thái màng BC tạo thành chịu ảnh hưởng của nguồn đường. Kết quả sử dụng các nguồn đường của vi khuẩn A. xylinum và trạng thái màng BC được hình thành thể hiện qua bảng 1. A. xylinum có thể sử dụng glucose, saccharose, lactose, maltose, dextrin và galactose nhưng không thể sử dụng tinh bột. Đối với mỗi loại đường khác nhau sẽ cho ra màng BC có trạng thái khác nhau. [...]... màng 0,00 8,0 Không t o màng 0,00 ( Tr n Phú Hòa, 1996) 9 1.2.T ng quan v vi khu n Acetobacter xylinum 1.2.1 Phân lo i vi khu n Acetobacter xylinum Phân lo i khoa h c c a Acetobacter xylinum: Gi i: Vi khu n Ngành: Proteobacteria L p: Alpha Proteobacteria B : Rhodospirillales H : Acetobacteraceae Chi: Acetobacter Loài: Acetobacter xylinum Vi khu n Acetobacter phân b r ng rãi trong t nhiên và có th phân. .. thu c gi ng Acetobacter ã ư c phân l p và mô t , trong ó có nhi u loài có ý nghĩa kinh t Acetobacter xylinum (A xylinum) thu c nhóm vi khu n acetic và có ngu n g c t Philippines Theo h th ng phân lo i c a Bergey (1989) thì A xylinum là vi khu n Gram âm, thu c l p Schizommycetes, b Pseudomonadales, h Pseudomonadieae (Krieg và Holt, 1984) n nay ã có nhi u tác gi c p nv n phân lo i các loài vi khu n trông... polymer hóa glucose thành cellulose ( Bazon và cs, 1984) S t ng h p l p màng cellulose ngo i bào c a vi khu n A xylinum ư c Brown báo cáo l n u tiên vào năm 1886 nhưng n gi a th k XX thì A xylinum và BC m i ư c nghiên c u sâu b i Hestrin và c ng s Năm 1943 – 1954, Hestrin và các c ng s trong m t nghiên c u v kh năng t ng h p BC c a vi khu n A xylinum ã ch ng minh r ng A xylinum có th s d ng ư ng trong... trông gi ng Acetobacter, nhưng áng chú ý nh t là b ng phân lo i Acetobacter c a J-Frateur (1950) Frateur ã ưa ra m t khóa phân lo i vi khu n Acetobacter d a trên các tính ch t sinh hoá Trên cơ s này, Frateur ã chia thành 4 nhóm: Suboxydans, mesoxydans, oxydans và peroxydans • Nhóm Suboxydans g m các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter melanogennum • Nhóm Mesoxydans g m Acetobacter xylinum, Acetobacter. .. aceti và Acetobacter mesoxydans • Nhóm Oxydans g m các loài không có kh năng t o các h p ch t keto như Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens 10 • Nhóm Peroxydans g m Acetobacter pezoxydans và Acetobacter paradoxum không ch a catalase và không oxy hoá ư c glucose M ts c i m chung c a Acetobacter: D ng hình que, tuỳ i u ki n nuôi c y (nhi t , thành ph n môi trư ng nuôi c... tr n s hình thành màng BC ư c th hi n qua b ng 6 B ng 6: nh hư ng c a pH pH n ngày th 10 thì dày- tr ng thái n s hình thành màng BC Kh i lư ng màng (g) 2,5 Không t o màng 0,00 3,0 Không t o màng 0,00 3,5 Màng m ng- m m 92,60 4,0 Màng m ng- m m 148,52 4,5 Màng dày- ch c 188,32 5,0 Màng dày- ch c 193,89 5,5 Màng dày- ch c 184,20 6,0 Màng dày- ch c 173,70 6,5 Màng m ng- ch c 163,85 7,0 Màng m ng- m m 86,90... nên cellulose Năm 1957, Next và Colvin ch ng minh r ng cellulose ư c A xylinum t ng h p trong môi trư ng có ư ng và ATP Năm 1989, nhóm Saxena Trư ng i h c Texa ã thu nh n ư c enzyme cellulose synthase tinh s ch c a A xylinum Enzyme này g m 2 chu i polypeptide có tr ng lư ng phân t là 83 và 93 kD Trong ó, ti u ph n 83 kD liên quan trình sinh t ng h p cellulose tinh khi t Năm 1990, nhóm ã xác h p cellulose. .. cellulose t A xylinum như sau: Hình 1.3 Sơ quá trình t ng h p Cellulose c a A xylinum 15 1.3 Tình hình nghiên c u và ng d ng màng ccellulose vi khu n 1.3.1 Tình hình nghiên c u và ng d ng cellulose vi khu n trên th gi i Do các c tính ưu vi t như b n, dai , ch c mà BC có th ng d ng vào nhi u lĩnh v c khác nhau (b ng 7) B ng 7 M t s ng d ng c a màng BC trên th gi i Lĩnh v c Ví d - Th c ăn tráng mi ng (th... màng Bacterial cellulose c a vi khu n Acetobacter xylinum t o ti n ng d ng làm bao bì sinh h c 21 CHƯƠNG II: V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u nghiên c u 2.1.1 i tư ng nghiên c u Vi khu n A xylinum ư c phân l p t môi trư ng nư c d a lên men t nhiên có váng tr ng Sau ó vi khu n ư c gi trong môi trư ng th ch nghiêng 2.1.2 Hóa ch t a Môi trư ng phân l p và gi gi ng Herstrin và Schram (HS)... t 34oC Acetobacter pasteurianum: hình d ng tương t như Acetobacter aceti nhưng váng vi khu n có d ng khô và nhăn nheo, váng b t màu xanh khi nhu m v i thu c Iod 1.2.2 c i m sinh h c c a vi khu n A xylinum A xylinum là lo i vi khu n hình que dài kho ng 2 µm, ng riêng l ho c x p thành chu i, có kh năng t o váng hemicellulose khá dày, b t màu xanh v i thu c nhu m Iod và H2SO4 (do ph n ng c a hemicellulose), . tài “ Phân lập và nuôi cấy Acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi khuẩn với mục đích: Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum từ nguồn cơ chất nước dừa. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose. sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum 28 iii 2.3.5. Bảo quản chủng giống 30 2.3.6. Nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn 30 2.3.7. Thu nhận và xử lí màng cellulose vi khuẩn 31 CHƯƠNG. vi khuẩn Acetobacter xylinum 9 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum 9 1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum 11 1.2.3. Khả năng tạo màng cellulose của Acetobacter