So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của ngựa khi pha kháng nguyên với tá chất montanide ISA 50 v2 và montanide GEL PET a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG --- TRẦN THÚY HỒNG SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ CHẤT MONTANIDE IS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

TRẦN THÚY HỒNG

SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG

LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA

KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ

CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ

MONTANIDE GEL PET A

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯƠNG DẪN: TS VŨ NGỌC BỘI

TS LÊ VĂN BÉ

Nha Trang 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

TRẦN THÚY HỒNG

SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ

MONTANIDE GEL PET A

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Xin cám ơn: ThS Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường

- Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Vaccine Nha Trang đã giúp

đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

HIỆU TRƯỞNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- Căn cứ Quy chế về tổ chức đào tạo, kiểm tra, thi và công nhận tốt nghiệp Đại học

và Cao đẳng hệ Chính quy ban hành theo Quyết định số 04/1999/QĐ-BGD&ĐT ngày 11/02/1999 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục & Đào tạo;

- Căn cứ Quy định của Trường Đại học Nha Trang về công tác tốt nghiệp

QUYẾT ĐỊNH Điều 1: Nay giao cho sinh viên: Trần Thúy Hồng MSSV: 4913044026

Khoá: 49 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Đồ án tốt nghiệp: So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của

ngựa khi pha kháng nguyên với tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A

Nội dung thực hiện:

1) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ngựa đối với hai loại tá chất pha kháng nguyên là Montanide ISA 50V2 và Montanide Gel Pet A

2) Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố uốn

ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao

Nơi thực hiện: Viện Vaccine Nha Trang

Thời gian thực hiện: Từ ngày 02 /03 /2011 đến ngày 16 / 06/ 2011

Hoàn thành và nộp Báo cáo trước ngày: 10 / 07/ 2011 cho Cán bộ hướng dẫn

Điều 2: Ông: TS Vũ Ngọc Bội và TS Lê Văn Bé

Có trách nhiệm hướng dẫn sinh viên thực hiện Đồ án Tốt nghiệp theo Quy chế của Bộ và theo Quy định số 120 TB/ĐT ngày 15/3/2001 của Hiệu trưởng về việc thực hiện công tác tốt nghiệp

Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học có trách nhiệm theo dõi, kiểm tra việc thực

hiện công tác tốt nghiệp của SV do Khoa giao cho Bộ môn quản lý và định kỳ báo cáo về Trưởng Khoa

Điều 3: Sinh viên Trần Thúy Hồng phải nghiêm chỉnh chấp hành Nội quy, Quy

định của Trường và nơi thực tập, khắc phục khó khăn để hoàn thành Đồ án tốt nghiệp được giao

TL.HIỆU TRƯỞNG

Phó Giám đốc Viện

Mục lục

Trang

PHẦN I MỞ ĐẦU 6

PHẦN II TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 8

2.1 Bệnh uốn ván 8

2.1.1 Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván 8

2.1.2 Vi khuẩn uốn ván 8

2.1.3 Đặc điểm bệnh học: 11

2.1.4 Đặc điểm dịch tễ học 14

2.2.1 Miễn dịch tự nhiên 15

2.2.2 Miễn dịch chủ động 15

2.2.3 Miễn dịch thụ động 17

2.3 Huyết thanh 17

2.3.2 Thành phần hoá học của huyết thanh 18

2.3.3 Kháng thể 21

2.3.4 Huyết thanh phòng và chữa bệnh 23

2.4 Tá chất gây miễn dịch 24

2.4.1 Khái niệm tá chất 24

2.4.2 Cơ chế hoạt động của tá chất 25

2.4.3 Vai trò của tá chất 25

2.4.4 Tính an toàn của tá chất 26

2.4.5 Các loại tá chất thông dụng 26

2.5 Tá chất Montanide ISA 50 V2 29

2.5.2 Những tính chất của MONTANIDE TM ISA 50V2 30

2.5.3 Tính chất tạo nhũ dịch 31

2.5.4 Các thử nghiệm về độc tính 31

2.5.5 Số liệu về công hiệu 32

2.5.6 Cơ chế và tính ưu việt của Montanide ISA 33

2.6 Tá chất Montanide Gel Pet A 35

2.6.2 Đáp ứng miễn dịch 36

2.6.3 Montanide Gel Pet A tá chất trùng hợp mới để sản xuất vacxin ngựa 37

2.6.4 Tính ưu việt của Montanide Gel Pet A 37

2.7 Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật 37

2.7.1 Sản xuất kháng nguyên để gây miễn dịch 38

2.7.2 Miễn dịch súc vật sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván 40

2.7.2.1 Cơ chế miễn dịch của cơ thể súc vật 40

2.7.2.2 Súc vật để gây miễn dịch 42

2.7.2.3 Tiêu chuẩn ngựa sản xuất huyết thanh 43

2.7.2.4 Chăm sóc ngựa 44

2.7.2.5 Miễn dịch 44

PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

3.1 Vật liệu 49

3.1.2 Nguyên vật liệu 50

3.2 Phương pháp nghiên cứu 51

3.2.1 Bố trí thí nghiệm 51

Bảng 3.1 Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô thí nghiệm A 52

Bảng 3.2 Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô ngựa thí nghiệm B 54

3.2.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp lên bông 56

3.2.3.1 Nguyên tắc 56

3.2.3.2 Tiến hành 56

3.2.4 Xử lý số liệu kết quả 57

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58

4.1 Kết quả hiệu giá kháng thể kháng uốn ván đối với nhóm ngựa A sử dụng tá chất Montanide ISA 50V2 58

4.2 Kết quả hiệu giá kháng thể kháng uốn ván đối với nhóm ngựa B sử dụng tá chất Montanide GEL PET A 59

4.3 So sánh đáp ứng miễn dịch kỳ cao độ hai nhóm A và B 60

4.4 So sánh đáp ứng miễn dịch ở chu kỳ 2 của hai nhóm ngựa 63

4.5 So sánh đáp ứng miễn dịch chu kỳ 3 của hai nhóm ngựa 66

4.6 So sánh hiệu giá hai nhóm ngựa A và B qua các chu kỳ khai thác 68

4.7 Sức khỏe ngựa sau 3 chu kỳ khai thác 72

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75

5.1 Kết luận 75

5.2 Đề nghị 75

Tài liệu tham khảo 77

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1.Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 30

Bảng 2.2.Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2 31

Bảng 2.3 Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2 31

Bảng 2.4 Các thử nghiệm độc tính của Montanide ISA 50 V2 32

Bảng 2.5 Những tính chất của Montanide Gel Pet A 36

Bảng 3.1 Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô thí nghiệm A 52

Bảng 3.2 Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô ngựa thí nghiệm B 54

Bảng 4.1 Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 61

Bảng 4.2 Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ 2 63

Bảng 4.3 Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ 3 67

Bảng 4.4 Hiệu giá trung bình của ba lần khai thác huyết thanh thô 69

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Trực khuẩn uốn ván 9 Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo phân tử IgG và vị trí cắt của enzym Papain và

Pepsin 22

Hình 2.3 Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50V2 21

Hình 2.4 Quá trình giải phóng kháng nguyên của một số tá chất khác

nhau theo thời gian 34

Hình 3 Sơ đồ tiêm miễn dịch và khai thác dùng cho hai lô ngựa A và B52 Hình 4.1 Biến động hiệu giá kháng thể chống độc tố uốn ván trong máu

ngựa được tối miễn dịch bằng vacxin với tá chất Montanide ISA 50V2 (lô A).58

Hình 4.2 Biến động hiệu giá kháng thể chống độc tố uốn ván trong máu

ngựa được tối miễn dịch bằng vacxin với tá chất Montanide Gel Pet A (lô B).60 Hình 4.3 Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch cao độ của hai lô ngựa 62

Hình 4.4 Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch nhắc lại ở chu kỳ 2 của lô

ngựa 65

Hình 4.5 Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch nhắc lại chu kỳ 3 ở hai lô

ngựa 68 Hình 4.6 Diễn biến đáp ứng miễn dịch của 2 lô ISA 50 V2 (lô A) và Gel

Pet A (lô B) ở 3 chu kỳ 72 Hình 4.7.1 Ngựa lô thí nghiệm A 73

Hình 4.7.2 Ngựa lô thí nghiệm

B 60

thanh kháng độc tố uốn ván (SAT) vẫn là cách điều trị dự phòng hữu hiệu

Tiêm kháng huyết thanh là biện pháp miễn dịch thụ động được dùng để trung hoà lại độc tố của vi khuẩn uốn ván nhằm điều trị bệnh này Ngày nay nhu cầu về huyết thanh uốn ván tăng lên do sự chủ quan trong phòng bệnh và tình trạng tai nạn giao thông tăng lên rất nhiều nên số lượng người có nguy cơ mắc uốn ván cũng tăng theo Vì vậy nghiên cứu ra quy trình gây miễn dịch để sản xuất huyết thanh có hiệu giá cao là vấn đề rất cần thiết Bên cạnh đó vấn đề an toàn cho sức khoẻ của ngựa sản xuất huyết thanh cũng được quan tâm

Viện Vacxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang đã và đang áp dụng quy trình miễn dịch ngựa, cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng uốn ván, tiến tới nâng cao sản lượng và chất lượng kháng huyết thanh miễn dịch, đồng thời

giảm giá thành sản phẩm Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “So sánh hiệu quả

đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của ngựa khi pha kháng nguyên với

tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A’’

7

Nội dung của đồ án

3) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ngựa đối với hai loại tá chất pha kháng nguyên là Montanide ISA 50V2 và Montanide Gel Pet A

4) Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố

uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao

Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn c ó các hạn chế, em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn

bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn!

8

PHẦN I TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 BỆNH UỐN VÁN

2.1.1 Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván

Bệnh uốn ván được mô tả từ rất cổ xưa vào thời Hyppocrates Đến năm

1854, Simpson khám phá rằng triệu chứng bệnh uốn ván rất giống những trường hợp ngộ độc Strychnine

Năm 1884, Carle và Rattonet gây được bệnh uốn ván thực nghiệm bằng cách tiêm dịch nghiền ở vết thương tấy mủ của người mắc bệnh uốn ván cho súc vật thí nghiệm Họ đã chứng minh tính chất nhiễm khuẩn và mô tả được bệnh uốn ván điển hình ở thỏ

Năm 1885, Nicolaier đã tìm thấy một loại trực khuẩn dài ở tại vết thương tấy mủ nhưng ông không nuôi cấy được thành chủng thuần khiết Ông cho rằng triệu chứng sinh bệnh học bệnh uốn ván là do một chất độc giống như Strychnine của trực khuẩn này tiết ra

Năm 1886, Rosebach tìm thấy nha bào của vi khuẩn uốn ván

Năm 1889, Kitasato đã phân lập được trực khuẩn uốn ván từ một vết thương tấy mủ, ông đã thuần khiết được trực khuẩn trong môi trường nuôi cấy và nhận thấy canh khuẩn thuần khiết này chứa một loại độc tố hòa tan, độc tố này gây nên triệu chứng bệnh uốn ván

1.1.2 Vi khuẩn uốn ván

Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn loại

Gram dương, có kích thước rộng 0,3 - 0,5 m, dài 2,0 - 2,5 m di động, mọc tốt trong môi trường yếm khí, có khả năng hình thành nha bào Nha bào hình trứng hoặc hình cầu phân bố lệch tâm hoặc ở cực tế bào, thông thường vùng có

9

nha bào trương ra có dạng bào tử nang tế bào trở nên có hình thoi, hình vợt, hình dùi trống

Hình 1.1 Trực khuẩn uốn ván

Nha bào uốn ván hiện diện trong đất có nhiều phân, đôi khi có trong bụi và

có sức chịu đựng rất tốt, tồn tại nhiều năm trong đất bùn, môi trường không có ánh sáng và không khí, chịu đựng được nhiệt độ sôi từ 1 - 3 giờ, có thể tồn tại 10 giờ trong dung dịch phenol 5% và 24 giờ trong phenol 3% Nhiệt độ 100 0C và các chất diệt khuẩn không diệt được nha bào, phải đun sôi kéo dài hay hấp ướt

121 0C trong 30 phút thì mới có thể diệt được nha bào uốn ván Trực khuẩn uốn ván lên men đường glucose, sự hình thành nha bào sẽ tăng lên trong môi trường

có huyết thanh và không có glucose

* Khả năng gây bệnh:

Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm độc thần kinh trung ương bởi độc tố của trực

khuẩn Clostridium tetani Trực khuẩn này thường tồn tại trong đất , cát, bụi bẩn

thậm chí ngay cả trong ruột già của người và động vật Phạm vi phân bố rộng mặt khác lại là vi khuẩn sinh nha bào nên khả năng tồn tại trong thiên nhiên rất lâu dài và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường vết thương ở chân tay nên

tỷ lệ mắc bệnh và chết do trực khuẩn uốn ván khá cao

Trực khuẩn uốn ván đã được tìm ra từ hơn một thế kỷ nay nhưng bệnh uốn ván vẫn còn là vấn đề cần được quan tâm vì tỷ lệ tử vong cao, nhất là trẻ sơ sinh Theo thông báo dịch quí II năm 1993, trẻ sơ sinh bị bệnh uốn ván là 36,4% còn các lứa tuổi khác 15,1% Nhờ chương trình tiêm chủng mở rộng và chương trình loại trừ UVSS được triển khai từ năm 1992 nên hiện nay tỷ lệ mắc uốn ván đã giảm rõ rệt

Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh và độc tố này xâm nhập vào các phần khác trên cơ thể Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, trực khuẩn bị phá hủy bởi acide dạ dày do đó không gây bệnh theo đường tiêu hóa

* Tính chất sinh hóa của độc tố uốn ván:

Tác nhân dẫn đến tử vong chính là độc tố uốn ván Độc tố uốn ván có tính độc rất mạnh, liều gây chết ở người 2,5ng/kg cân nặng

Độc tố uốn ván là một protein chiếm tới 5 - 10% trọng lượng tế bào, nó không có ích cho vi khuẩn, không phá hủy bất cứ cấu trúc tổ chức nào để giúp

vi khuẩn xâm nhập vào mô của động vật

Độc tố uốn ván về mặt hoá học gồm ba thành phần: một phần có tác dụng gây tan máu, có tính độc với tim, dễ bị ôxy hoá gọi là tetanolysin; một phần gọi

là tetanospasmin gây co giật các cơ, là triệu chứng cơ bản của bệnh uốn ván;

mg chất này gây chết 10 triệu chuột nhắt

Độc tố này tan trong nước, bắt đầu kết tủa trong dung dịch và mất hoạt tính khi pH 6 nhưng nó bền ở pH 5 khi có mặt glycerin, cơ chế việc sản sinh độc tố của trực khuẩn uốn ván đến nay còn nhiều điều chưa rõ Độc tố có độc lực rất mạnh, có ái tính cao với tế bào thần kinh bị phá huỷ ở nhiệt độ lên 700C Bản chất của độc tố uốn ván là một protein chứa 15,7% nitơ; 0,062% phospho; 1,04% sulfur, không có cacbonhydrat và lipid, điểm đẳng điện là 5 - 5,2 PI

Độc tố uốn ván được tổng hợp trong tế bào vi khuẩn uốn ván, là chuỗi polypeptide đơn có trọng lượng phân tử 150.000 dalton Trong các điều kiện nuôi cấy thí nghiệm, độc tố tách từ nước nổi của canh khuẩn gồm hai chuỗi polypeptide : một chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử 53.000 dalton và một chuỗi nặng có trọng lượng phân tử 107.000 dalton nối với nhau bởi cầu nối disulfur ( -S-S- ) Người ta thấy rằng độc tố uốn ván và độc tố ngộ độc thịt (butulinum) thường có khả năng gây bệnh nhiều nhất trong các loại độc tố do vi khuẩn tiết ra

1.1.3 Đặc điểm bệnh học

Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc do vi khuẩn Clostridium

tetani gây nên, trực khuẩn phát triển tại vết thương và tiết ra độc tố làm tổn

thương các nơron thần kinh trung ương gây nên co cứng cơ vân Triệu chứng

Bệnh cảnh lâm sàng của uốn ván thường xếp làm 4 loại chính :

- Uốn ván toàn thân

- Uốn ván cục bộ

- Uốn ván thể đầu

- Uốn ván rốn

* Uốn ván toàn thân:

Là thể bệnh uốn ván thường gặp nhất Bệnh khởi phát với mệt mỏi, nhức đầu, mỏi quai hàm và nhai khó, nói khó, nuốt vướng, uống nước sặc Dần dần, hàm cứng không há lớn được Giai đoạn toàn phát uốn ván thể điển hình bao gồm các dấu hiệu :

Cong người sang một bên

Gập người ra phía trước

13

+ Co giật và co thắt

Co cứng toàn thân tự nhiên hoặc do kích động bởi va chạm, ánh sáng chói, tiếng ồn Nguy hiểm nhất là cơn co thắt hầu họng gây khó nuốt, sặc đàm và co thắt thanh quản đưa đến tím tái và ngưng thở

+ Rối loạn cơ năng

Khó nuốt, khó nói, khó thở do co thắt hầu họng, tăng tiết đàm nhớt, tắc nghẽn đường hô hấp

+ Tổng trạng

Tỉnh táo

Không sốt cao lúc mới phát bệnh và 48 giờ đầu

Nếu hệ thần kinh thực vật bị tổn thương sẽ có các biểu hiện : mạch nhanh > 120-140 lần /phút, sốt cao, huyết áp dao động, vã mồ hôi nhiều, thở nhanh, tăng tiết catecholamin trong nước tiểu

Giai đoạn chót : huyết áp tụt

* Uốn ván cục bộ

Co cứng cơ khu trú ở vị trí tương ứng với nơi xâm nhập của vi trùng uốn ván Bệnh thường nhẹ và kéo dài, diễn tiến tự khỏi

Bệnh hay gặp ở người đã có miễn dịch một phần với tetanospasmin (ví dụ

đã được tiêm phòng SAT khi bị thương nhưng không xử trí vết thương đúng và không tiêm ngừa VAT) Co cứng cơ có thể lan sang chi đối diện hoặc có thể diễn tiến sang uốn ván toàn thân khi luợng độc tố đạt đến mức đủ đến hệ thần kinh trung ương

* Uốn ván thể đầu

14

Là dạng đặc biệt của uốn ván cục bô Vết thương khu trú ở vùng đầu, mặt,

cổ, thời gian nung bệnh thường ngắn hơn

Có hai loại biểu hiện :

+ Thể không liệt

Khởi đầu với triệu chứng co thắt hầu họng làm bệnh nhân khó nuốt, uống nước bị sặc

+ Thể liệt

Thường gặp hơn thể không liệt

Liệt mặt ngoại biên : thường gặp nhất, liệt cùng bên với vết thương, liệt cả hai bên nếu vết thương ở ngay giưõa sống mũi

Liệt dây thần kinh III, IV, VI : hiếm gặp hơn

* Uốn ván rốn

Thời gian nung bệnh : 3 - 5 ngày Biểu hiện : trẻ bỏ bú, nhắm mắt, khóc không ra tiếng rồi không khóc, bụng co cứng, bàn tay nắm chặt, chân co cứng Trẻ thường sốt cao, co giật nhiều, co thắt tím tái Bệnh tiến triển tốt khi bé mở mắt, ngủ được, khóc to dần, hết co giật Tỷ lệ tử vong còn rất cao : từ 70 đến 80%, do suy hô hấp, bội nhiễm, suy dinh dưỡng

1.1.4 Đặc điểm dịch tễ học

Vi khuẩn uốn ván có mặt ở mọi nơi và gây bệnh tản phát ở các nước trên thế giới Ở những vùng nông nghiệp và những nơi phải tiếp xúc với chất thải của súc vật và không được tiêm phòng đầy đủ, bệnh uốn ván thường gặp nhiều hơn

Ở hầu hết các nước công nghiệp, bệnh hiếm gặp mang tính tản phát

15

Bệnh uốn ván là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tử vong ở nhiều nước đang phát triển thuộc Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ, đặc biệt ở những vùng nông thôn và vùng nhiệt đới

Tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh uốn ván Nhóm người có nguy cơ cao mắc bệnh: Nông dân, nhân viên chăn nuôi gia súc, nghiện chích ma túy Bệnh có thể gặp bất kỳ thời gian nào trong năm, không mang tính chất mùa

1.2.2 Miễn dịch chủ động

Việc cơ thể sản sinh kháng thể đặc hiệu hoặc tế bào Tc sau khi bị cảm nhiễm hoặc sau khi được tiếp nhận một cách nhân tạo vi sinh vật mầm bệnh (sống hoặc vô hoạt) hoặc là kháng nguyên của chúng (kể cả các loại độc tố) và giải độc tố (toxoid),… được gọi là miễn dịch chủ động Miễn dịch chủ động có được sau khi bị cảm nhiễm gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên, các trường hợp tạo miễn dịch do con người đưa kháng nguyên hay mầm bệnh vào cơ thể (tiêm vacxin) gọi là miễn dịch chủ động nhân tạo Tế bào ký chủ có được miễn dịch chủ động sau khi tiếp cận với kháng nguyên và mất khá nhiều thời gian (thường

cơ thể con người tạo ra kháng thể trung hòa độc tố uốn ván, nhờ đó bảo vệ được

cơ thể, chống lại bệnh Khả năng bảo vệ này tùy thuộc vào lượng độc tố uốn ván, hàm lượng của kháng thể uốn ván

Để gây miễn dịch chủ động có kết quả tốt, ngày nay người ta nghiên cứu sản xuất những vacxin đơn giá như TT (vacxin phòng bệnh uốn ván) dùng cho người lớn; vacxin phối hợp hai thành phần như DT (vacxin bạch hầu - uốn ván hấp phụ) dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi; Td (vacxin bạch hầu - uốn ván giảm liều hấp phụ) dùng cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên; vacxin phối hợp 3 thành phần giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, xác vi khuẩn ho gà gọi là DTP dùng cho trẻ

em dưới 6 tuổi Các giải độc tố thường được dùng kết hợp với tá chất để làm tăng hiệu quả đáp ứng của cơ thể

Có thể phòng bệnh uốn ván suốt đời bằng cách tiêm vacxin như sau:

- Tiêm vacxin DTP cho trẻ em dưới 6 tuổi

- Tiêm vacxin Td cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên

- Tiêm vacxin TT cho phụ nữ mang thai và lứa tuổi sinh đẻ (15 - 44 tuổi) Tiêm đủ 5 liều trong vòng 31 tháng, tiêm càng sớm càng tốt khi có thai

- Tiêm vacxin TT cho những người có nguy cơ mắc cao (người làm vườn, người làm việc ở các nông trại, công nhân xây dựng công trình…) Tiêm miễn dịch 3 liều trong vòng 6 tháng, cứ sau 5 - 10 năm tiêm nhắc lại một liều (Viện vacxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang, 2004)

17

1.2.3 Miễn dịch thụ động

Năm 1890, Berhing và Kitazato đã đặt nền móng cho kiểu miễn dịch thụ động Về sau Roux đã đưa ra một quan điểm là có thể dùng huyết thanh miễn dịch để điều trị cho tất cả bệnh nhiễm trùng Kiểu miễn dịch thụ động được sử dụng trong những trường hợp phải tạo miễn dịch nhanh chóng khi có nguy cơ mắc bệnh cao hoặc nghi ngờ bị bệnh

Nguyên tắc của miễn dịch thụ động là đưa vào cơ thể bệnh nhân một lượng kháng thể đặc hiệu được sản xuất từ súc vật hay người đã được gây miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu Kháng thể này sẽ trung hoà các độc tố hay virus trong máu của bệnh nhân Một vấn đề quan trọng trong miễn dịch thụ động là thời gian miễn dịch rất ngắn, kháng thể đặc hiệu sẽ bị thải ra ngoài Vì vậy trong việc điều trị dự phòng bệnh uốn ván hay bệnh dại bao giờ người ta cũng có sự phối hợp giữa miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động Ngoài ra khi sử dụng huyết thanh miễn dịch để phòng ngừa hay điều trị thường gây ra phản ứng dị ứng, bệnh huyết thanh Để loại bỏ những phản ứng trên, người ta phải tinh chế huyết thanh miễn dịch để loại bỏ các phần tử không cần thiết đối với huyết thanh khác loài hay điều chế huyết thanh miễn dịch cùng loài (huyết thanh từ người) hoặc kháng thể đơn dòng

1.3 HUYẾT THANH

Sử dụng huyết thanh là phương pháp tạo miễn dịch thụ động rất có hiệu quả Có thể điều chế kháng huyết thanh chống độc tố và vi khuẩn từ máu ngựa được gây miễn dịch với kháng nguyên hoặc từ máu người đã tiêm vacxin và có kháng thể cao Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ-globulin lấy

từ máu nhau thai γ-Globulin được tinh chế có ưu điểm đáng kể là giảm hẳn các

18

phản ứng phụ cho người tiêm, đặc biệt có nồng độ kháng thể cao điều trị rất hữu hiệu

1.3.1 Tính chất lý hóa chung của huyết thanh

Máu là dịch lỏng, nhớt, màu đỏ Máu toàn phần gồm hai phần:

- Tế bào máu bao gồm các tế bào máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu

- Huyết tương gồm huyết thanh (serum), các yếu tố đông máu hòa tan trong

đó (protein tạo sợi tơ huyết fibrinogen khi đông máu)

Khi máu để đông tự nhiên thì các tế bào máu và các yếu tố đông máu bị đông lại Phần còn lại tách ra khỏi cục máu là chất dịch màu vàng rơm gọi là huyết thanh Máu có độ nhớt cao hơn nước: nước = 1, : máu = 5; : huyết tương = 1,7 - 2 ,2 Độ nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh

lý

Độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ H+, OH– và có ý nghĩa rất quan trọng Khi pH của huyết thanh không phải là hằng số thì pH của máu cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong cơ thể không xảy ra Bởi vậy pH của huyết thanh luôn ở khoảng giá trị 7,2 - 7,5

1.3.2 Thành phần hoá học của huyết thanh

Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 - 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu vàng nhạt Trong huyết thanh nước chiếm 90 - 91%, chất khô chiếm 9 - 10% gồm protein, đường, lipit, muối khoáng

Trong huyết thanh thành phần khí có O2 và CO2 Cứ 100 ml máu động mạch chứa khoảng 18 - 20 ml O2 và CO2 ở dạng hoà tan kết hợp với hemoglobin của hồng cầu Khoảng 45 - 50 ml CO2 có trong huyết tương và hồng cầu

Các chất vô cơ chính trong huyết thanh gồm cation như Na+, K+, Ca2+,

Mg2+, và các anion Cl–, HCO3–, SO42–, PO43–… Ngoài ra huyết thanh còn chứa

Bằng phương pháp điện di trên giấy người ta phân tích được protein huyết thanh gồm 5 thành phần: phần chạy nhanh nhất là albumin, 1-globulin, 2-globulin, chậm nhất là  -globulin

Nếu điện di miễn dịch trên gel tinh bột hoặc gel polyacrilamit có thể tách được 18 - 21 thành phần protein khác nhau Protein huyết thanh có ở dạng tự do hoặc phức hợp với lipit (lipoprotein), gluxit (glucoprotein), kim loại (metaloprotein), axit nucleic (nucleoprotein)

- Albumin:

Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị kết tủa bởi dung dịch muối bão hoà Trong các protein của huyết thanh albumin chiếm một lượng lớn tới 56,6%, vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì áp suất thẩm thấu của huyết tương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể, tham gia vận chuyển các chất không tan trong máu như billirubin tự do, axit béo, một số thuốc…

- Globulin:

Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần Globulin hoà tan trong dung dịch muối loãng, không tan trong nước tinh khiết

+ -globulin: chiếm khoảng 11,7% trong đó có siderophilin (protein chứa

* Các enzym: Có rất nhiều enzym trong huyết thanh như amylase,

phosphatase, transaminase…

* Những chất có nitơ phi protein:

Là những sản phẩm thoái hoá của protein, trong đó đa số là những sản phẩm thoái hoá cuối cùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, acid uric, billirubin… Ngoài ra huyết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian

của protein như polypeptid và các acid amin tự do

21

1.3.3 Kháng thể

Kháng thể hay là globulin miễn dịch là các protein có trong huyết thanh hoặc dịch sinh học của cơ thể (nước tiểu, sữa…) có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng

Kháng thể chính là protein thường được phát hiện ở phần  -globulin của huyết thanh, dịch bạch huyết và các dịch khác của cơ thể Về cấu trúc và hoá tính

đó là những  -globulin điển hình, vì vậy không thể phân biệt được chúng với các  -globulin “bình thường” bằng phương pháp hoá học Chỉ có thể phát hiện kháng thể bằng “thuốc thử” đặc hiệu là kháng nguyên tương ứng Kháng thể được phát hiện từ những năm đầu của lịch sử miễn dịch Sự kết hợp đặc biệt giữa kháng nguyên và kháng thể, với khả năng sản xuất được kháng thể đặc hiệu đã làm cho kháng thể được dùng rộng rãi vào mục đích chẩn đoán và điều trị

Các kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (Ig) Có nhiều lớp globulin miễn dịch khác nhau nhưng tất cả các lớp đều có đặc điểm cấu trúc giống nhau

- Phân tử Ig có hai chuỗi polypeptit nặng (H) và hai chuỗi polypeptit nhẹ (L)

- Các chuỗi H và L bao giờ cũng từng đôi và giống nhau hoàn toàn trong mỗi phân tử Ig

- Tất cả các chuỗi Ig đều có chuỗi L thuộc type kappa (κ) hoặc lamda (λ) còn chuỗi H của các lớp Ig thì khác nhau Các lớp Ig ở người bao gồm IgG, IgA, IgD, IgE và IgM

IgG: Là lớp kháng thể có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, có thể đạt

12 mg/ml (chủ yếu trong máu) Phân tử lượng nhỏ cỡ 150.000 dalton Chính vì nhỏ nên nó có mặt trong huyết thanh và cả dịch kẽ tế bào Khi IgG bị thuỷ phân

sẽ tạo thành 3 mảnh có khối lượng tương đối giống nhau khoảng 50.000 dalton

22

Hai mảnh có cấu trúc giống nhau gọi là Fab (antigen-binding fragment) có khả năng kết hợp kháng nguyên Một mảnh khác không có khả năng kết hợp kháng nguyên nhưng có khả năng kết tinh gọi là Fc (crystallisable fragment) giúp cho phân tử kháng thể bám trên bề mặt tế bào thực bào

IgG có bốn phân lớp khác nhau về cầu nối disulfur S–S nên dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc không gian và có tỷ lệ phân bố trong huyết thanh cũng khác nhau, tương ứng với IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 là 75%, 8 - 10%, 7 - 8%, 4 - 8% IgG1 và IgG3 có khả năng bám tốt trên đại thực bào còn IgG2 và IgG4 không có khả năng này

S –S

S –S Papain

Pepsin

S –S

S –S Papain

Pepsin

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử IgG và vị trí cắt của enzym papain và pepsin

Có thể chiết IgG từ huyết thanh bằng phương pháp sắc ký trên Celluloza Dùng enzym có thể cắt IgG ra nhiều mảnh khác nhau Với papain hoạt hoá sẽ tách được 3 mảnh: 2 mảnh Fab và 1 mảnh Fc; với pepsin chỉ tách được 2 mảnh: 1 mảnh gần giống 2 Fab hợp lại nhưng không giống hoàn toàn nên có ký hiệu là F(ab)2 có hai vị trí kết hợp kháng nguyên Phần còn lại tương ứng với Fc

DEA-bị chặt thành nhiều mảnh peptit nhỏ, mỗi mảnh trên có hoat tính sinh học khác nhau

Huyết thanh động vật: được chế từ máu động vật (thường là ngựa hoặc bò, cừu đã được miễn dịch với những bệnh nhiễm trùng khác nhau) đem loại bỏ các protein không đặc hiệu, còn kháng thể giữ ở nồng độ cao Tuỳ theo tác nhân gây miễn dịch, người ta phân biệt:

- Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đã được tiêm độc tố vi khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD), chống uốn ván (SAT)

- Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đã được miễn dịch đối với virus dại dùng để chống bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virus viêm gan B…

- Huyết thanh kháng nọc độc: huyết thanh của động vật đã được tiêm nọc độc đã làm giảm độc của những loài có nọc độc, chẳng hạn như nọc rắn (SAV)

- Huyết thanh của người mới lành bệnh: hiện nay ít dùng

Ở Việt Nam, huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế được sản xuất duy nhất tại Viện vacxin Nha Trang theo phương pháp của Pope và quy trình của Lavergne - Pháp (Paris): quy trình IVAC2 -1995

Huyết thanh kháng độc tố uốn ván do Viện vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang sản xuất là một sinh phẩm có nguồn gốc động vật (từ ngựa) chứa các globulin miễn dịch đặc hiệu thu được bằng phương pháp tinh chế huyết thanh

24

kháng uốn ván thô sau khi xử lý với enzym và kết tủa phân đoạn trong muối ammonium sulfate Chế phẩm được bảo quản bằng merthiolate 1/10.000 Mỗi năm Viện sản xuất hàng trăm ngàn ống (loại 1500 IU) để phục vụ công tác phòng ngừa uốn ván ở Việt Nam

* Tác dụng phụ của protein có trong huyết thanh:

Hàm lượng protein cao trong huyết thanh do quá trình tinh chế chưa loại hết albumin gây phản ứng

- Phản ứng tức khắc: xảy ra sau khi tiêm vài phút hay vài giờ Thường tai biến xảy ra sau khi tiêm lần thứ hai, đặc biệt là nếu tiêm hai huyết thanh của cùng một loại động vật trong vòng 10 ngày Chỗ tiêm bị phù nề, ban đỏ (thường

biến mất sau 24 - 36 giờ) Triệu chứng toàn thân: trạng thái lo âu, tức ngực khó

thở, lên cơn ho, tím tái, run, sốt cao, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, tim đập nhanh, huyết áp giảm; có thể bị ngoại ban toàn thân Tuy nhiên tình trạng nguy kịch chỉ xảy ra trong vài phút, trường hợp tử vong rất ít

- Phản ứng chậm: xảy ra vào khoảng 9 - 15 ngày sau khi tiêm

- Sốt nhẹ, nhức đầu, suy nhược, biếng ăn, buồn nôn, tiêu chảy, nổi mề đay, ban đỏ…

Ngoài ra có thể gây đau khớp, lách to; các biểu hiện viêm đường hô hấp cấp (viêm mũi, phế quản, phù nề thanh quản, hen); tiểu ít, albumin niệu, trụ niệu; cá biệt gây viêm dây thần kinh tiến triển làm teo cơ

Các phản ứng nói chung có thể khỏi sau vài ngày, tuy nhiên cũng có trường hợp kéo dài, cá biệt có thể gây viêm nút quanh động mạch

1.4 TÁ CHẤT GÂY MIỄN DỊCH

1.4.1 Khái niệm tá chất

Người ta ứng dụng tá chất trong lĩnh vực sản xuất vacxin để tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh và kéo dài Tá chất được sử dụng cả ở người và động vật nhưng khác nhau về chủng loại và bản chất Trong quy trình sản xuất kháng huyết thanh SAT từ máu ngựa, tá chất có vai trò đặc biệt quan trọng vì vậy việc sử dụng nó như là một điều kiện bắt buộc

1.4.2 Cơ chế hoạt động của tá chất

Một tá chất trong vacxin có thể ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch theo một hoặc nhiều cơ chế sau:

- Đưa kháng nguyên vào vị trí thích hợp trong cơ thể

- Lưu giữ và giải phóng kháng nguyên chậm từ vị trí mà nó lắng đọng

- Tuyển mộ và hoạt hoá các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) và lympho bào

- Hoạt hoá bổ thể, tăng cường tổng hợp tiết và gắn kết của các cytokin

- Mang các epitop của tế bào T đến MHC lớp I và lớp II

1.4.3 Vai trò của tá chất

Nhờ các cơ chế hoạt động trên mà tá chất có những vai trò sau:

- Tăng cường hiệu lực của các peptide tổng hợp hoặc tái tổ hợp nhỏ, có tính kháng nguyên yếu

26

- Tăng cường tốc độ, sức mạnh và sự tồn lưu đáp ứng miễn dịch cho những kháng nguyên lớn hơn

- Điều hoà miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào

- Điều hoà sản xuất kháng thể, số lượng kháng thể, tính đặc hiệu của kháng thể, loại kháng thể ứng với các epitope trên các phức hợp sinh miễn dịch

- Làm giảm lượng kháng nguyên trong vacxin, nhờ vậy có thể giảm sự cạnh tranh kháng nguyên và sự chèn ép epitope đặc hiệu, giảm lượng kháng nguyên trong một liều vacxin nhờ đó tăng số lượng vacxin và giảm giá thành sản xuất

1.4.4 Tính an toàn của tá chất

Ưu điểm lớn nhất của tá chất trong vacxin hấp phụ là khả năng tăng cường miễn dịch Tuy nhiên, sử dụng tá chất vẫn tiềm ẩn những nguy cơ đối với sức khỏe con người Các nguy cơ theo lý thuyết và thực tế của tá chất là:

- Gây nhiễm trùng cấp tính hoặc mãn tính, hình thành các ổ mủ gây đau, các

u nhọt lâu khỏi

- Gây các triệu chứng như cảm cúm, sốt, nhức đầu, nhức mỏi cơ, khớp

- Gây dị ứng, độc lâm sàng cho các mô và cơ quan

- Phản ứng chéo với các kháng nguyên của bể cầu thận hay bao thần kinh, gây ra viêm thận hay viêm màng não

- Nhạy cảm với tuberculin hoặc các kháng nguyên thử nghiệm trong da khác

- Gây ung thư, đẻ non và quái thai

- Gieo rắc và phát tán các vector và vật chủ vào môi trường

1.4.5 Các loại tá chất thông dụng

27

Tá chất được xếp nhóm theo nguồn gốc hơn là theo cơ chế hoạt động bởi vì

cơ chế hoạt động của hầu hết các tá chất chưa được hiểu đầy đủ

* Hợp chất nhôm (Al 3+ ):

Hợp chất nhôm (bao gồm hydroxyt nhôm Al(OH)3, phosphate nhôm AlPO4hoặc kết hợp cả hai) được sử dụng trong sản xuất nhiều loại vacxin như vacxin uốn ván hấp phụ, vacxin bạch hầu - ho gà - uốn ván, vacxin viêm gan A, B và vacxin dại…

Tá chất nhôm đã trở thành căn cứ để đánh giá các tá chất mới trong vacxin dùng cho người Tá chất nhôm khó được tạo ra theo cách tổng hợp hoá lý, điều này ảnh hưởng đến đặc tính lý hoá của kháng nguyên, loại tá chất nhôm, điều kiện hấp phụ và nồng độ tá chất Không phải tất cả các hợp chất nhôm đều có hiệu quả như nhau, chẳng hạn hydroxyt nhôm có hiệu quả hơn phosphate nhôm

Do đó, một dạng pha chế đặc biệt của hydroxyt nhôm (Alhydrogel) đã được khuyến cáo dùng như một tá chất chuẩn

 Ưu điểm của tá chất nhôm:

- Ưu điểm chính của việc sử dụng tá chất nhôm là tính an toàn đã được ghi nhận qua hàng tỷ liều vacxin và sự hình thành kháng thể sớm hơn, cao hơn và kéo dài hơn sau khi miễn dịch sơ cấp so với các dạng vacxin không sử dụng tá chất tương ứng đặc biệt đối với các giải độc tố

- Hình thành kho lưu giữ tại vị trí tiêm nên cho phép giải phóng kháng nguyên chậm, kích thích các tế bào miễn dịch qua con đường hoạt hóa bổ thể, hoạt hóa đại thực bào

- Kháng nguyên hấp phụ được nhận diện nhờ bản chất và kích thước hạt tối

ưu (<10µg)

28

- Nhôm kích thích miễn dịch qua trung gian tế bào

- Là các thành phần trong vacxin đã được cho phép sử dụng

 Nhược điểm của tá chất nhôm:

- Gây phản ứng tại chỗ như sưng phồng và ban đỏ tại vết tiêm

- Thời gian tồn tại ở chỗ tiêm có thể lên tới một năm ở chuột

- Có một số hạn chế về miễn dịch bao gồm: không có khả năng tăng cường miễn dịch dịch thể cho một số vacxin dùng cho người và hầu như không có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đặc biệt đáp ứng qua tế bào T độc đối với các sinh vật nội bào Không tạo ra miễn dịch qua trung gian tế bào là một hạn chế của vacxin chống lại các sinh vật ký sinh nội bào như sốt rét và HIV Thậm chí tá chất nhôm kìm hãm một cách có chọn lọc sự phát triển của các

tế bào hoạt động CD8+ bởi một số kháng nguyên

- Các dung dịch tá chất nhôm không phải lúc nào cũng tạo được gel, không thể tiệt trùng bằng phương pháp lọc, không được để đông đá, không đông khô được

* Chitosan

Chitosan là một amino polysaccharide, có cấu trúc từ các đơn vị glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucoside Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột màu trắng ngà, không mùi, không vị Tính chất của chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh khiết, độ deacetyl hóa, phân tử lượng và độ rắn Phân tử lượng của chitosan quyết định khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel Chitosan và các dẫn xuất được sử dụng làm tá chất phải có độ deacetyl ít nhất là 75% Chitosan hay các dẫn xuất có thể sử dụng làm tá chất dưới các dạng vật lý khác nhau: dung dịch, bột hay các dạng đặc biệt Các dạng đặc biệt hay dùng là

* Tá chất Freund

Tá chất Freund là hỗn dịch nước trong dầu, bao gồm hai loại là tá chất hoàn

toàn (FCA) và không hoàn toàn (FIA) FCA có thêm vi khuẩn Mycobacterium

tuberculosis hàm lượng khoảng 0,5 mg/ml Đây là tá chất chuẩn, hiệu quả tác

dụng mạnh, đã từng được sử dụng rộng rãi trong các vacxin thử nghiệm trên súc vật

Dầu khoáng kết hợp với xác vi khuẩn lao cùng với chất tạo nhũ (mannide monoleate) tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào Tuy nhiên FCA cũng có thể tạo các khối u biểu mô, các vết loét khi tiêm dưới da, gây sốt và bệnh tự miễn như thấp khớp Do đó, loại tá chất này thường chỉ được dùng trên súc vật thí nghiệm

Để giảm các phản ứng có hại của tá chất Freund, một số nghiên cứu cải tiến

về loại dầu khoáng trong tá chất Freund được phát triển như Montanide 80, Montanide ISA 51, ISA 720 và ISA 724…

1.5 TÁ CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2

Montanide ISA là loại tá chất dạng nước trong dầu (W/O – 50 thể tích nước /50 thể tích đầu) Thành phần của nó bao gồm dầu khoáng, mannitol và acid oleic tinh chế có nguồn gốc thực vật Dạng nhũ dịch W/O của Montanide ISA 50 V2 được thể hiện qua hình vẽ sau:

30

Hình 1.3 Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50

V2

* Những tính chất của MONTANIDE TM ISA 50V2

Các tính chất vật lý và hóa học của MONTANIDE ISA 50V2 được trình bày ở bảng 1.1 và 1.2 dưới đây

Bảng 1.1 Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2

31

Bảng 1.2 Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2

* Tính chất tạo nhũ dịch

Khả năng tạo nhũ của Montanide ISA 50 V2 khá tốt, thời gian duy trì ở 4oC kéo dài hơn 12 tháng (bảng 1.3.)

Bảng 1.3 Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2

Độ ổn định

* Các thử nghiệm về độc tính

32

Tá chất MONTANIDETM ISA đạt tiêu chuẩn an toàn của hội đồng chung Châu Âu trên súc vật thí nghiệm, 2377/90/EC phụ bản II, tuân thủ các thử nghiệm được kê dưới đây (bảng 2.4.)

Bảng 1.4 Các thử nghiệm độc tính của Montanide ISA 50 V2

Liều LD50 theo đường uống (trên

Không chết sau 7 ngày

Không mổ phân tích các trường hợp bất thường

* Số liệu về công hiệu

Montanide ISA 50V2 đã được sử dụng thành công trong một số công thức như là vacxin FMD, vacxin Pasteurella multocida, vacxin ký sinh trùng Tick, vacxin cowdriosis,

- Đáp ứng trên chuột:

Các nhóm chuột gồm 10 con cho một nhóm được tiêm miễn dịch với BSA (10 µg) hỗn hợp với Montanide ISA 50V, Al(OH)3, hay không có tá chất Montanide ISA 50V làm tăng đáp ứng kháng thể IgG1 cao và thời gian đáp ứng miễn dịch kéo dài đồng thời cũng làm tăng đáp ứng sản sinh tế bào lympho Vì vậy loại tá chất này có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào

33

- Đáp ứng trên cừu:

Montanide ISA 50V làm khơi dậy hàm lượng cao kháng thể trung hoà kháng virus blue tongue Vào ngày 117, tại thời điểm bảo vệ, hiệu giá kháng thể trung hoà vẫn còn cao hơn nhiều khi so sánh với FIA

- Đáp ứng trên bò:

Nghiên cứu so sánh trên gia súc về công hiệu của vacxin FMD hỗn hợp với

tá chất dầu hay nhôm hydroxyde, kết quả cho thấy rõ ràng rằng Montanide ISA 50V làm tăng tính miễn dịch mạnh và dài hơn nhôm hydroxyde

* Cơ chế và tính ưu việt của Montanide ISA

Hoạt tính của tá chất Montanide ISA chưa thực sự được hiểu rõ ràng, nó có những điểm khác biệt trong các trường hợp khác nhau

Đầu tiên, tá chất là kho chứa và giải phóng chậm kháng nguyên từ vị trí tiêm Tùy theo kiểu nhũ dịch của tá chất (là W/O, W/O/W, O/W) mà động học của quá trình giải phóng kháng nguyên khác nhau Người ta đã thực hiện thí nghiệm sử dụng phương pháp thẩm tích nghịch đảo để đánh giá in vitro động học quá trình giải phóng kháng nguyên từ nhũ dịch, kết quả cho thấy động học của quá trình sẽ khác nhau tùy thuộc vào kiểu nhũ dịch

Cụ thể là, những protein không có tá chất sẽ bị giải phóng ngay tức thời Nhũ dịch O/W cho phép quá trình này chậm hơn chút ít nhưng protein vẫn bị giải phóng nhanh Nhũ dịch W/O là có hiệu quả nhất, nó làm cho quá trình giải phóng kháng nguyên xảy ra rất chậm chạp Điều này liên quan đến độ ổn định của dạng nhũ dịch, ngay khi trạng thái nhũ tương bị phá vỡ kháng nguyên sẽ được giải phóng ồ ạt Tuy nhiên, quá trình giải phóng này vẫn chậm hơn nhũ dịch O/W Còn loại nhũ dịch W/O/W thì có độ hoạt động nằm giữa hai loại nhũ

34

dịch trên, nghĩa là nó sẽ giải phóng kháng nguyên chậm hơn dạng O/W và nhanh hơn dạng W/O

Hình 1.4 Quá trình giải phóng kháng nguyên của một số tá chất khác nhau

theo thời gian

Ngoài ra, Montanide ISA sau khi được tiêm vào cơ thể sẽ khuếch tán đến hạch lympho dưới dạng các giọt dầu nhỏ, trong các giọt dầu này có chứa kháng nguyên Bằng cách này kháng nguyên sẽ được vận chuyển trong hệ tuần hoàn

Do được bao bọc bởi các giọt dầu nên kháng nguyên có thể tránh khỏi sự phân hủy nhanh chóng của các enzyme trong cơ thể, kháng nguyên sẽ giữ được lâu hơn với số lượng lớn so với trường hợp không có tá chất hoặc sử dụng tá chất khác Bên cạnh đó, Montanide ISA có thể làm tăng tính lạ cho kháng nguyên bằng cách thay đổi điện tích của các kháng nguyên này (Human vaccine adjuvants, 2009) Các tá chất còn kích thích quá trình viêm và tuyển mộ các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) là đại thực bào, kể cả lympho bào Ngoài ra

tá chất còn có tác dụng làm cho sự hấp phụ kháng nguyên của các tế bào APC diễn ra được thuận lợi hơn Điều này có được là do tương tác giữa chất hoạt

động bề mặt trong tá chất với màng của các tế bào APC

35

Cơ chế bẫy các tế bào lympho lại là một cơ chế hoạt động khác của các tá chất dầu Chúng kích thích sự tích lũy các tế bào lympho tại hạch bạch huyết Ngoài ra tá chất còn ảnh hưởng đến sự hoạt hóa các cytokin, các cytokin đặc biệt

sẽ được hoạt hóa tùy theo kiểu nhũ dịch của tá chất được sử dụng

Như vậy hoạt động của tá chất Montanide ISA 50V2 có những ưu việt sau:

- Tạo ra kho giữ trữ kháng nguyên

- Giải phóng kháng nguyên chậm và kéo dài

- Bảo vệ được kháng nguyên khỏi sự phân hủy của enzym và quá trình đào thải của cơ thể

- Làm biến đổi điện thế bề mặt kháng nguyên, thu hút các tế bào trình diện kháng nguyên

- Tạo thuận lợi cho quá trình tóm bắt kháng nguyên và trình diện kháng nguyên cho tế bào có thẩm quyền miễn dịch

- Kích thích sinh kháng thể và hoạt hóa các cytokin

1.6 TÁ CHẤT MONTANIDE GEL PET A

Montanide GEL PET A là tá chất dạng nước cơ bản, được tạo ra để cải thiện tính an toàn và hiệu quả của vacxin nước Montanide GEL PET A là một loại tá chất trùng hợp mới dùng cho động vật nuôi, chỉ cần một lượng nhỏ, tá chất có khả năng chịu đựng tốt, sản phẩm vô trùng, tá chất này được sản xuất dưới điều kiện thanh trùng trong xưởng dành cho sản xuất dược phẩm, áp dụng theo tiêu chuẩn GMP, không chứa chất bảo quản và bất cứ chất nào có nguồn gốc động vật Tá chất này màu trắng, mờ đục và có dạng gel Tính chất kết dính

và khả năng hoạt động dưới mọi điều kiện pH làm cho nó có thể sử dụng rất dễ dàng, đặc biệt dùng cho các loại vật nuôi Montanide GEL PET A sản xuất theo tiêu chuẩn GMP nên vô trùng So sánh với Al(OH)3 truyền thống để sản xuất

36

vacxin, Montanide gel thì an toàn và tạo ra sự chịu đựng miễn dịch và đáp ứng miễn dịch mạnh hơn

* Những tính chất của Montanide GEL PET A

Tỉ lệ sử dụng Montanide GEL PET A khoảng 2,5% đến 10% được ghi nhận

là nhạy cảm đối với động vật và có tính phản ứng kháng nguyên Tá chất này sản xuất riêng biệt, sau đó hỗn hợp với kháng nguyên (vaccin thô) để có vaccin thành phẩm Hỗn hợp dạng nước thu được với Montanide GEL PET A có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc thấp hơn Montanide GEL PET A rất lỏng, làm vacxin nước ổn định

Bảng 1.5 Những tính chất của Montanide GEL PET A

Tính ổn định

Loại Độ nhớt

(mPa/s)

Dẫn suất (mS/cm)

Sau khi bảo quản ở

4oC

Sau khi bảo quản ở

25oC

Sau khi bảo quản

ở 37oC Nước Khoảng 5

ở 25 oC

>10 Dung dịch nước muối sinh

lý

Ít nhất 12 tháng

Ít nhất 12 tháng

Ít nhất 1 tháng

* Đáp ứng miễn dịch

Montanide GEL PET A có thể cải thiện hiệu quả vacxin theo hướng miễn dịch mạnh và kéo dài thời gian miễn dịch Nó đã được chứng minh trên chó đối

với vi khuẩn (Leptospira icterohaemorrhagiae) rằng nó là một tá chất tốt tạo đáp

ứng miễn dịch với độ an toàn cao Sản phẩm này được sử dụng đối với kháng nguyên vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và cũng có thể kết hợp với vacxin sống Tá chất Montanide GEL PET A được tinh chế ở mức độ cao của tá chất cao phân tử

để dành cho chó, mèo và ngựa