Nghiên cứu mối quan hệ loài của ốc cối (conus spp ) ở vùng biển nam trung bộ việt nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA)

Bước đầu khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc Conus thu được vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen CO1 của DNA ti thể Mitochondrial DNA.. Chúng

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang em nhận được sự quan tâm của cơ quan, nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân

Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo của trường Đại học Nha Trang, thầy

cô giáo cán bộ Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong những năm học vừa qua

Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới

PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa và TS Đặng Thúy Bình đã tận tình quan tâm hướng

dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Em xin cảm ơn Ths Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ Nghiên cứu Triển khai công nghệ, cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ phòng thí nghiệm: Bộ môn Công Nghệ Sinh học, bộ môn Môi Trường thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại học Nha Trang giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn

bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Vì kiến thức và thời gian có hạn nên luận văn tốt nghiệp của em không sao tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong được sự góp ý của các thầy cô giáo để luận văn của em hoàn thiện hơn và đạt kết quả cao nhất Em xin chân thành cảm ơn!

Cuối cùng, em xin kính chúc mọi người dồi dào sức khỏe và thành công!

Nha Trang ngày 07 tháng 07 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Bích Hảo

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU 4

I.1.1 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm 4

I.1.2 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường huyện đảo Lý Sơn 5

I.1.3 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường thị xã Sông Cầu 5

I.1.4 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vịnh Vân Phong 7

I.2 TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ ỐC CỐI (CONUS SPP.) 9

I.2.1 Tổng quan ốc cối 9

I.2.1.1 Đặc điểm sinh thái và phân bố 9

I.2.1.2 Đặc điểm hình thái bên ngoài và cấu tạo bên trong của ốc cối 13

I.2.1.3 Đặc điểm sinh học và sinh sản 17

I.2.2 Tổng quan độc tố ốc cối 18

I.2.2.1 Giới thiệu về độc tố ốc cối 18

I.2.2.2 Cấu tạo bộ máy sinh độc tố 19

I.2.2.3 Phân loại độc tố conotoxin 22

I.2.2.4 Ứng dụng y học của độc tố ốc cối 24

I.3 TỔNG QUAN VỀ TY THỂ VÀ DNA TY THỂ 26

I.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.) 32

I.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 32

I.4.1.1 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loài của ốc cối 32

I.4.1.2 Nghiên cứu di truyền độc tố 35

I.4.1.3 Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối 36

I.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 36

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 39

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

II.2.1 Phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái ốc cối 42

II.2.2 Tách chiết DNA các loài ốc cối 44

II.2.3 Phản ứng khuếch đại 46

II.2.4 Giải và phân tích trình tự 48

II.2.5 Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh loài 48

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN III.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI ỐC CỐI 53

III.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN ỐC CỐI 59

III.2.1 Kiểm tra DNA tổng số 59

III.2.2 Khuếch đại gen 59

_Toc298320803III.2.3 Đa dạng di truyền DNA ốc cối 60

III.2.4 Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mt DNA 61

III.3 THẢO LUẬN 67

III.3.1 Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử CO1 mtDNA 67

III.3.2 Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dưỡng 69

III.3.3 Sự khác biệt di truyền giữa các trình tự 71

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT IV.1 KẾT LUẬN 73

IV.2 Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc điểm phân bố, sinh thái và kích cỡ trung bình của một số loài ốc phổ

biến ở biển Việt Nam 11

Bảng 1.2: Các superfamily của conotoxin (Bingham, 2010) 24

Bảng 1.3: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng 26

Bảng 1.4: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA 30

Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 43

Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 43

Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 43

Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 44

Bảng 2.5: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa 49

Bảng 2.6: Trình tự gen CO1 mtDNA và chế độ ăn của các loài ốc cối .50

Bảng 3.1: Kích thước, khối lượng, đường kính của một số loài ốc cối 57

Bảng 3.2: Bảng giá trị tính theo công thức chuẩn quốc tế của một số loài ốc cối 58

Bảng 3.3:Kết quả sự khác biệt di truyền giữa các trình tự 60

Bảng 3.4: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML và BI .64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Bản đồ phân bố ốc cối Conus trên thế giới 10

Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.) 13

Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) 14

Hình 1.4: Cấu tạo bên trong của ốc cối 14

Hình 1.5: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối 16

Hình 1.6: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối 16

Hình 1.7: Vòng đời của ốc cối (Conus spp.) (Rockel và cs, 1995) 18

Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối (Olivera, 2002, có bổ sung) 20

Hình 1.9: Răng kitin Conus spp .21

Hình 1.10: Cấu trúc của ty thể 26

Hình 1.11: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein 28

Hình 1.12: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 31

Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu (Cù Lao Chàm, Lý Sơn, Sông Cầu, Vân Phong) .40

Hình 2.2: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 41

Hình 2.3: Cấu tạo bên ngoài của ốc cối 42

Hình 2.4: Chương trình nhiệt độ của phản ứng khuếch đại 47

Hình 2.5: Chương trình nhiệt độ của phản ứng tiền giải trình tự 48

Hình 3.1: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở vùng biển Việt Nam 53

Hình 3.2: Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 59

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA của các mẫu ốc cối.60 Hình 3.4: Cây phát sinh loài dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 62

Hình 3.5: Cây phát sinh loài theo phương pháp Baysian Inference (BI) dựa trên gen CO1 mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam 63

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

PMD (Position of Maximum Diameter of

proportion of shell length)

Chiều cao tương đối của tháp vỏ

RW (Relative Weight of shell) Trọng lượng tương đối của ốc cối

MỞ ĐẦU

Thực tế hiện nay cho thấy đa dạng sinh học đang bị suy thoái với tốc độ rất nhanh Bằng các hoạt động của mình, con người đã gây mất hàng loạt các khu rừng nguyên sinh, các vùng đất ngập nước qua đó đã làm gia tăng tốc độ tuyệt chủng của các loài gấp 1.000 lần so với tỷ lệ tự nhiên Số loài và số lượng cá thể của các loài hoang dã bị suy giảm mạnh Các nguồn gen hoang dã cũng đang trên đà suy thoái nhanh và thất thoát

Bờ biển Việt Nam dài 3260 km và có hơn 3000 đảo lớn nhỏ Việt Nam có tiềm năng về kinh tế biển với khoảng 20 hệ sinh thái biển, trong đó có hơn khoảng

11000 loài bao gồm 2500 loài cá biển, 225 loài tôm, hơn 200 loài thủy sinh vật, gần

700 loài động vật nổi và 100 loài thực vật rừng ngập mặn, 15 loài cỏ biển và hơn

6000 loài động vật không xương sống Theo ước tính có khoảng 1122 km2 rạn san

hô phân bố từ Bắc vào Nam, 90% các loài san hô cứng ở vùng biển Ấn Độ- Thái Bình Dương được tìm thấy ở Việt Nam (http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tai-nguyen-he-sinh-thai-bien-viet-nam.514937.html)

Ở nước ta, ốc là một trong những nhóm nguồn lợi hải sản quan trọng, có mức

độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại cao như ốc Tù Và, ốc Hương, ốc Bàn Tay, ốc Cối Trong số đó có thể kể đến ốc Cối, là một trong những họ động vật thân mềm lớn thuộc loài ăn thịt và có nọc độc Các loài ốc Cối có giá trị kinh tế cao do vỏ của chúng có màu sắc và hoa văn đẹp nên thường được khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm Ngoài ra, ốc Cối còn là nguồn nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau mãn tính, ung thư và nhiều bệnh khác Vì những lợi ích về kinh tế và y học đó mà tình trạng khai thác bừa bãi các loài ốc Cối ngày càng gia tăng Bởi vậy, đòi hỏi chúng ta phải có các nghiên cứu để bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này

Các nghiên cứu về ốc Cối ở nước ta cho tới nay mới chỉ được thực hiện ở mức độ khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan; xác định độc tính và kiểm chứng tính chất của một số độc tố (http://www.vnio.org.vn/ ) Hiện nay các nghiên

cứu phát sinh chủng loại nào về ốc Cối Việt Nam tiến hành ở mức độ phân tử còn nhiều hạn chế Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là rất cần thiết, nó sẽ góp phần vào công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn gen ốc Cối Việt Nam

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ

loài của ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ

thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA)” Dựa trên việc nghiên cứu

mối quan hệ giữa các loài này ta tiến hành điều tra để đánh giá hiện trạng nguồn lợi

ốc cối ở vùng biển Việt Nam Đây là vấn đề rất cần thiết vì bước đầu tạo cơ sở dữ liệu đầu vào cần thiết cho việc tính toán, đề xuất các biện pháp quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi ốc cối ở vùng biển Việt Nam

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:

 Khảo sát và đánh giá đặc điểm di truyền của loài ốc cối (Conus spp.)

 Bước đầu khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc Conus thu được

vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen CO1 của DNA ti thể (Mitochondrial DNA)

NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI:

 Nghiên cứu mối quan hệ loài của các loài ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển

Nam Trung Bộ Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử gen CO1 của DNA ty thể (CO1 mtDNA)

 Xây dựng cây phát sinh loài của các loài ốc cối ở vùng biển Nam Trung

Bộ Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU

I.1.1 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm

Quảng Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, chỉ có 2 mùa là mùa mưa và mùa khô, chịu ảnh hưởng của mùa đông lạnh miền Bắc Nhiệt độ trung bình năm 20-21oC, không có sự cách biệt lớn giữa các tháng trong năm Lượng mưa trung bình 2000-2500mm, nhưng phấn bố không đều theo thời gian và không gian, mưa ở miền núi nhiều hơn đồng bằng

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa hải đảo nên nhiệt độ nước biển cũng chịu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng

từ 22,5 – 30,5oC

Hàm lượng vật lơ lửng ở ven bờ Quảng Nam thường giao động trong khoảng 0,2 – 1,2mg/l, đặc biệt cực trị hàm lượng vật lơ lửng cao (3,5mg/l) xảy ra vào tháng 1 năm 2008

Cù Lao Chàm là một cụm đảo xã đảo Tân Hiệp, thành phố Hội An, tỉnh Quảng Nam, nằm cách bờ biển Cửa Đại 15km Cù Lao Chàm bao gồm 8 đảo: Hòn Lao, Hòn Dài, Hòn Mồ, Hòn Khô mẹ, Hòn Khô con, Hòn Lá, Hòn Tai, Hòn Ông

Do địa thế các đảo chụm lại với nhau tạo thành vịnh kín, đồng thời là bức tường bảo

vệ các rạn san hô, nhờ thế mà nơi đây tạo thành hệ sinh thái, và còn là nơi trú ngụ của nhiều loài ốc như ốc đụn, ốc cối

Phân bố của các hệ sinh thái khu vực Cù Lao Chàm

Các rạn san hô phân bố chủ yếu ở phía Tây và Tây Nam đảo Hòn Lao và xung quanh các đảo nhỏ với tổng diện tích khoảng 165ha Các rạn san hô này phát

triển tốt với các loài ưu thế thuộc các chi Acropora, Montipora và Goniopora

Vùng phía Bắc và phía Đông đảo chính Cù Lao Chàm, chủ yếu là rạn đá dốc đứng, các nguồn lợi sinh vật khó tồn tại và phát triển ở khu vực này

Vùng phía Nam của Cù Lao Chàm, xen kẽ giữa các rạn san hô là các bãi cát

và thảm cỏ biển phát triển Diện tích các bãi cát và thảm cỏ biển được ước tính lên đến 75 ha Hải sâm cũng có thể phân bố ở khu vực này

I.1.2 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường huyện đảo Lý Sơn

Vùng biển Quảng Ngãi có địa hình thềm lớn, có nới cách bờ chưa tới 3 hải lý

đã có độ sâu 50m, cách bờ trung bình 20 hải lý đã có độ sâu trên 100m, cách bờ 30 hải lý đã có độ sâu trên 200m Nền đáy biển từ 50m nước trở vào chủ yếu là cát bùn, trên 50m trở ra chủ yếu là cát pha vỏ sò Địa hình đáy biển gần bờ có các bãi rạn nhỏ, vùng khơi có những rãnh sâu, lục địa vùng biển Quảng Ngãi nói chung và

Lý Sơn nói riêng có độ dốc gò rạng

Nước biển Quảng Ngãi mang đặc trưng của vùng nước biển sâu, màu mặt nước xanh thẳm, độ trong suốt lớn, biển thoáng, hoàn lưu nước trao đổi trực tiếp với biển Đông Nhiệt độ nước biển biến động lớn nhất xảy ra ở lớp nước mặt và giảm dần đến độ sâu 200m Nhiệt độ tầng nước mặt đạt giá trị cao nhất vào tháng 5, trung bình 28oC - 29,8oC; thấp nhất vào tháng 1, trung bình 22oC - 24,7oC Độ mặn nước biển khá cao, có sự thay đổi theo mùa, nhưng biên độ dao động độ mặn giữa mùa khô và mùa mưa không lớn và độ mặn đều lớn hơn 32‰ Mùa gió Tây Nam, độ mặn tầng mặt ven bờ trung bình 32 - 33‰, ngoài khơi là 33,5 - 34,5‰; mùa gió Đông Bắc, nước biển có độ mặn cao khoảng 33,8 - 34‰

Vùng biển Quảng Ngãi có một đảo lớn là Lý Sơn (cù lao Ré) và một đảo nhỏ

là đảo Bé Ven bờ quanh đảo Lý Sơncó nhiều rạn đá, san hô bao bọc đã hình thành

hệ sinh thái biển khá đặc sắc và nguồn lợi thủy sản phong phú, có thể khai thác, bảo tồn nhiều loài đặc sản biển có giá trị

I.1.3 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường thị xã Sông Cầu

Phú Yên là tỉnh duyên hải miền Trung , nằm ở toạ độ địa lý 12050'-13042' độ Bắc, 108041' - 109023' kinh độ Ðông Diện tích tự nhiên toàn tỉnh là 5.045,31 km2,

chiếm 1,53% tổng diện tích tự nhiên cả nước Phú Yên có đường bờ biển dài 189

km với nhiều vũng, vịnh thuận lợi cho phát triển nuôi trồng thuỷ sản Ngoài ra dải đất cát ven biển có thể phát triển thành những vùng nuôi tôm trên triều đạt hiệu quả cao

Địa hình tỉnh thấp dần từ Tây sang Đông với những dạng địa hình núi, đồi xen kẽ đồng bằng Vùng trung du có những cao nguyên rộng, tương đối bằng phẳng Rải rác có núi đá chạy sát ra biển đã chia cắt dải đồng bằng ven biển của tỉnh

thành nhiều đồng bằng nhỏ, lớn nhất là đồng bằng thuộc hạ lưu sông Ba với diện tích 500 km2 Đây là vựa lúa lớn của miền Trung

Phú Yên thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương Nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,5°C, nhiệt độ cao nhất là 30,3°C, thấp nhất là 23,8°C.Độ ẩm trung bình khoảng 78% Thời tiết có 2 mùa rõ rệt: mùa khô từ tháng 1 đến tháng 8, mùa mưa từ tháng 9 đến tháng 12, tập trung từ 70 – 80% lượng mưa cả năm Lượng mưa trung bình hàng năm là 1500-1700mm/năm.

Thị xã Sông Cầu nằm ở phía Bắc của tỉnh Phú Yên, có tọa độ 13021’ đến

13042’ vĩ độ bắc và 109006’ đến 109020’ kinh độ đông; phía Bắc giáp thành phố Quy Nhơn tỉnh Bình Định, phía Nam giáp thị xã Tuy An, phía Tây giáp thị xã Đồng Xuân, phía Đông giáp Biển Đông Bờ biển Sông Cầu dài 80 km, với 15.700

km2 mặt nước

Địa hình Sông Cầu có những nhánh núi tách ra từ dãy Trường Sơn chạy theo hướng Đông - Nam ra đến biển, tạo thành những đèo, dốc tương đối cao, hiểm trở như đèo Cù Mông, dốc Găng…đồng thời chia vùng đồng bằng thành những cánh đồng, vùng đất trồng hoa màu nhỏ hẹp

Khí hậu Sông Cầu thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, được chia làm hai mùa rõ rệt Mùa khô từ tháng 1 đến tháng 8, chịu ảnh hưởng của gió Tây và gió Tây Nam Tháng 4 là tháng khô nhất, tháng 7, 8 có gió Nam hay còn gọi là gió Lào khô, nóng Mùa mưa từ tháng 9 đến tháng 12 chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông - Bắc Hằng năm, thường mưa nhiều vào tháng 10, tháng 11, chiếm 60% lượng mưa hàng năm Tổng số ngày mưa trong năm là 130 ngày, độ ẩm trung bình 81% Số giờ nắng trung bình trong năm là 2500 giờ Số giờ nắng trung bình trong một ngày 6-8 giờ Nhiệt độ trung bình cao nhất là 290C, thấp nhất là 200C, trung bình là 250C

Đặc điểm môi trường sinh thái thì dựa vào đặc tính cư trú và sinh sống, có thể chia động vật dưới nước thành 2 nhóm chính là: động vật sống ở nước ngọt và động vật sống ở nước mặn-lợ.Các loài động vật chân rìu và chân bụng ở Phú Yên cũng rất phong phú và đa dạng, theo điều tra có các bộ, họ loài ốc nhảy, họ ốc tù và,

họ ốc hương, họ ốc mỏ vịt, học ốc dừa và họ Conidae (họ ốc cối) gồm có 13 loài Nơi cư trú của các loài ốc là vùng bờ biển vách đá, vùng biển triều và thềm lục địa dưới triều có san hô và thảm rong biển Vì thế từ Cù Mông đến Đèo Cả các loại ốc đều cư trú và sinh sống được.

I.1.4 Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vịnh Vân Phong

Khánh Hòa là một tỉnh ven biển miền Trung nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, trong khoảng 11o 41’53’’- 12o 52’10’’N, và 108o 40’12’’- 109o 30’00’’E Bờ biển có độ dài xấp xỉ 200 km (nếu tính cả đường viền các đảo ven bờ chiều dài này xấp xỉ 400 km) với nhiều cửa lạch, đầm vịnh, với hàng trăm đảo lớn, nhỏ và vùng biển rộng lớn, có 4 vịnh lớn là vịnh Vân Phong, vịnh Nha Phu, vịnh Nha Trang và vịnh Cam Ranh Độ sâu vùng biển Khánh Hòa không lớn, từ vĩ độ 10905 E trở ra là vùng đại dương có độ sâu từ 100 - 600 m, các đường đẳng sâu chạy dọc song song với bờ

Khí hậu Khánh Hòa mang tính gió mùa của Nam Trung Bộ Mùa mưa chính bắt đầu từ tháng 9 đến tháng 11 với lượng mưa đạt từ 250 -350 mm, từ tháng 5 đến tháng 6 là thời kỳ mưa tiểu mãn (lượng mưa đạt từ 60 - 120 mm) Mùa khô kéo dài

từ tháng 3 đến tháng 8 Chế độ gió mùa đã ảnh hưởng lớn đến chế độ dòng chảy ở đây Gió mùa tây - nam từ tháng 6 đến tháng 9 và gió mùa đông - bắc từ tháng 11 đến tháng 3 (Nguyễn Hữu Hồ và cs, 2003)

Vịnh Vân Phong nằm ở phía bắc Khánh Hòa trong khoảng 12020’–12040’N;

109011’- 109026’E, độ sâu trung bình của vịnh khoảng 15 m và độ sâu cực đại là 40

m Độ dài theo chiều trục vịnh khoảng 30 km2, cửa vịnh rộng khoảng 13 km Đây là một vịnh lớn, sâu và tương đối kín của Việt Nam Vân Phong là một trong những vịnh lớn nhất của miền Trung Việt Nam, với diện tích 510 km2 trong đó khoảng 50,5 km2 là diện tích các đảo, trong đó phần ngập nước khoảng 458 km2 (Vũ Tuấn Anh, 2004; Thái Ngọc Chiến và cs, 2006; 2010)

Vịnh Vân Phong nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa Nam Trung Bộ với hai mùa gió chính thịnh hành trong năm (gió mùa Đông Bắc và gió mùa Tây Nam) và chịu ảnh hưởng mạnh bởi chế độ gió địa phương (gió Tu Bông

khô lạnh, gió tây khô nóng và cả gió đất biển) Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng từ 23,8 – 30,6oC Là khu vực có chế độ nhiệt cao hơn hẳn so với các khu vực khác thuộc Trung Bộ

Do sông suối ngắn, hàm lượng vật lơ lửng ở vịnh Vân Phong thường thấp, chúng dao động trong khoảng 0,2 – 1,2mg/l, đặc biệt cực trị hàm lượng vật lơ lửng cao (1,9mg/l) xảy ra vào tháng 12 năm 2006

Vịnh Vân Phong bao gồm 3 vùng nhỏ: vịnh Vân Phong phía ngoài; vũng Bến Gỏi ở phía bắc và vụng Cổ Cò - Lạch Cửa Bé ở phía đông - bắc Địa hình đáy vũng Bến Gỏi không phức tạp lắm, chỉ những nơi có san hô thì nền đáy mới có sự

gồ ghề, lồi lõm Độ sâu lớn nhất trong khu vực đạt 18 m, sự phân bố các đường đẳng sâu theo một khoảng cách tương đối đồng đều, song song với nhau và song song với đường bờ

Địa hình đáy phần vịnh Vân Phong hoàn toàn khác với địa hình đáy vũng Bến Gỏi Đáy vịnh tương đối bằng phẳng tạo thành một máng lớn, lòng máng thoi, nghiêng dần về phía cửa vịnh, sự phân bố các đường đẳng sâu có dạng ngoằn nghèo, uốn lượn và phân không không đều Vụng Cổ Cò - Lạch Cửa Bé tạo ra do sự

có mặt của đảo Hòn Lớn và bán đảo Hòn Gốm Địa hình đáy ở đây rất đơn giản: độ sâu tăng từ hai bờ lạch ra giữa dòng Mặt cắt ngang hình chữ V với độ sâu lớn vì ở đây là một thung lũng hẹp và sâu

Theo kết quả nghiên cứu của Tống Phước Hoàng Sơn (2007) Vịnh Vân Phong bao gồm các hệ sinh thái vùng triều chính sau: Rạn san hô trong vịnh Vân Phong có diện tích tổng cộng 1.398ha, phân bố chủ yếu ở:

- Vịnh Bến Gỏi có diện tích 584,3ha, phân bố chủ yếu ở Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cùm Meo, Rạn Trào, Rạn Tướng, ven bờ Tây Bắc vịnh Vân Phong cũng với hàng lọat bãi cạn ngầm kích thước nhỏ tồn tại trong khu vực

- Bờ Đông vịnh Vân Phong diện tích 476,6ha phân bố ở Đông Bán đảo Hòn Gốm, Lạch Cổ Cò, Hòn Tre và một số đảo nhỏ phía Bắc Hòn Lớn

- Ở ven bờ Tây Nam vịnh Vân Phong diện tích 337,1ha phân bố ở Mũi Dù, Hòn Khói, Mỹ Giang, Bãi Cỏ, và một vài bãi cạn ngầm nằm cách ly với bờ không xa

I.2 TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ ỐC CỐI (CONUS SPP.)

I.2.1 Tổng quan ốc cối

Hệ thống phân loại ốc cối

I.2.1.1 Đặc điểm sinh thái và phân bố

* Đặc điểm sinh thái

Hiện nay trên thế giới có khoảng 500-700 loài ốc Conus Chúng thường sống

trong các rạn san hô, rạn đá hoặc vùng triều, nhiều loài còn sống ở vùng nước sâu hàng trăm mét Nền đáy có thể là đá, san hô, vách đá, đáy bùn hoặc cát Hầu hết các loài ốc cối nhiệt đới sống trong hoặc gần các rạn san hô, chúng có thể ẩn mình trong cát hoặc dưới các tảng đá, sỏi (Rockel và cs,1995) Các loài cận nhiệt đới được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều, trong các khe rẽ của rạn san hô ở độ sâu từ 10-30m

và dưới các tảng đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly,2005) Một số loài khác có

thể sống ở các rừng ngập mặn, hoặc sống ở vùng nước sâu đến 400m (Rockel và cs, 1995)

* Phân bố

Giống ốc cối phân bố khắp nơi trên thế giới, chúng thường phân bố ở vùng vĩ

độ giữa 400 Bắc và 400 Nam, tương đương với các vùng biển: Ấn độ - Thái Bình Dương, Panamic, Caribbean, Peru, Patagonic, Tây và Nam Phi và Địa Trung Hải Một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 như ở Nam Phi, Nam Australia, Nam

Nhật Bản và biển Địa Trung Hải ) Chúng phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm như Philippine, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii…Tuy nhiên, một số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây California, Hoa Kỳ

Bản đồ phân bố ốc cối trên thế giới được trình bày ở hình 1.1:

Hình 1.1: Bản đồ phân bố ốc cối Conus trên thế giới

(http://128.192.10.160/mp/20m?kind=Conus) Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo) với khoảng 76 loài (Hylleberg và Kilburm, 2003)

Hylleberg, và Kilburm (2003) trong khuôn khổ dự án Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) đã công bố 76 loài ốc cối được tìm thấy ở vùng biển

Việt Nam Một số loài ốc cối phổ biến ở Việt Nam như ốc cối nâu (C vexilum), ốc cối vàng (C quercinus), ốc cối địa lý (C geographus), ốc cối vua (C imperrialis) vv được ghi nhận vùng phân bố là Vũng Tàu, Nha Trang, Phan Rang, đảo Cơn

Sơn, đảo Phú Quý, Long Hạ, vùng biển Ấn Độ-Thái Bình Dương; http://vn.vinaseashells.com/oc-coi-nau.html (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Đặc điểm phân bố, sinh thái và kích cỡ trung bình của một số loài ốc phổ biến ở biển Việt Nam

Vũng Tàu, Khánh Hòa, Tây Thái Bình Dương

xx Vùng xa bờ 4cm (1,5in)

2 ốc cối nâu C vexilum Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, đảo Con Son, Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxxx Vùng xa bờ 8cm(3,2in)

3 ốc cối vàng C quercinus Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Tây Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxxx Rạn san hô và đáy cát 9cm (3,5in)

4 ốc cối địa

lý

C geographus Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxx Rạn san hô 7 (2,8n)

5 ốc cối vua C imperrialis Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxxx Rạn san hô ở vùng

nước nông

7cm (2.8n)

6 ốc cối văn C striatus Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxxx Vùng nước nông 9cm (3,5in)

xxx Đáy cát 10cm (4in)

8 Ốc cối vai

nhọn

C genenralis Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxxx Đáy cát

9 Ốc cói đầu

tím

C litteratus Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

C obscunus Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

xxxx Vùng xa bờ 6cm (2,5in)

11 Ốc cối

vàng nhạt

C distans Vũng Tàu, Nha Trang, Phan

Rang, Đảo Côn Sơn, Ấn Độ- Thái Bình Dương

I.2.1.2 Đặc điểm hình thái bên ngoài và cấu tạo bên trong của ốc cối

* Đặc điểm hình thái bên ngoài

Ốc cối có hình dạng như trái tim (một số vùng ở Việt Nam ngư dân thường gọi là ốc trái tim), cùng với sự đa dạng về loài thì chúng cũng có kích cỡ rất khác nhau Loài có kích cỡ lớn nhất có dài đến 23cm (Röckel và cs, 1995), ốc cối thường

có màu sắc sặc sỡ và có hoa văn rất thú vị Ốc cối có vỏ dạng hình thoi thuôn dài, dày, tầng thân lớn, miệng vỏ hẹp dài, trục vỏ thẳng, không có nếp uốn vặn, mép trong và mép ngoài miệng vỏ đơn giản, nắp vỏ bằng chất sừng, da vỏ có vân màu phân bố Vỏ tạo thành ống rỗng cuộn vòng quanh trục chính thành các vòng xoắn, thường theo chiều thuận với chiều kim đồng hồ Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân được bao bọc trong vỏ dưới một lớp nhày

Các chỉ tiêu phân loại ốc cối dựa vào đặc điểm hình thái vỏ được mô tả ở hình 1.2:

Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus spp.)

Vỏ của ốc cối thường có 3 dạng hình thái khác nhau: hình nón, hình nón rộng và hình nón hẹp (Hình 1.3) Đây là một trong những chỉ tiêu quan trọng để

phân loại ốc Loài C betulinus, C litteratus và C leopardus thuộc nhóm ốc có hình nón rộng Loài C capitaneus, C bandanus và C marmoreus thuộc nhóm có hình nón và C lynceus thuộc nhóm có hình nón hẹp

Tháp vỏ

Mương trước miệng vỏ

Mép trong miệng vỏ

Miệng vỏ Xoang vỏ

Đáy vỏ

Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.)

* Cấu tạo bên trong của ốc cối

Cấu tạo trong của ốc cối gồm các bộ phận như mô tả ở hình 1.4:

Hình 1.4: Cấu tạo bên trong của ốc cối

1) Vòi hút (Proboscis): vòi hút là vũ khí săn mồi của ốc cối Độc tố được tiêm vào

con mồi bằng các răng chứa trong túi răng chitin Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp 2 lần cở thể ốc cối

2) Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng như mũi Đó là một túi có thể duỗi

dài ra và phát hiện con mồi trong môi trường nước xung quanh Nó cũng góp phần đưa nước đến mang giúp cho quá trình hô hấp

3) Mắt : ốc cối có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng Hiện tại vẫn chưa biết được về khả năng nhìn

của ốc cối hay câu hỏi đặt ra là liệu có đủ ánh sáng ở các vùng biển sâu hay không?

Hình nón: Phần chóp

không cao và không thấp

Hình nón rộng: Phần chóp thấp hay bằng phẳng

Hình nón hẹp: Phần chóp cao so với cơ thể

4) Miệng : ốc cối có miệng có thể mở rộng ra phía trước để nuốt con mồi Hệ thống

cơ có thể co duỗi để đưa miệng vào trong vỏ

5) Chân : chân có cấu tạo bằng cơ giúp ốc cối di chuyển trên các bề mặt

* Chế độ dinh dưỡng và phương thức săn mồi

Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), có tính chuyên hóa cao, chúng ăn mồi sống Thức ăn chính của chúng là các loài cá nhỏ (piscivorous) 70%, giun biển (vermivorous) 15%, nhuyễn thể (molluscivorous) 15%, và ngay cả các loài ốc cối khác (Terlau và Olivera, 2004; Olivera và cs, 2002) Chúng có một cơ quan bắt mồi chuyên biệt là dải răng kitin Răng kitin của ốc cối thì hõm sâu và có gai, giống như những cây lao thu nhỏ (chiều dài của răng thường khoảng vài mm, nhưng đôi khi

có thể lên tới 10mm) Khi ốc cối nhận ra đối tượng, thì vòi của chúng sẽ kéo dài ra,

và nhờ một lực co cơ mà những mũi tên từ ống vòi được phóng rất nhanh, kèm theo một lượng lớn độc tố được phóng thích, làm tê liệt nhanh chóng con mồi Sự tấn công này chỉ xảy ra trong khoảng một phần nghìn giây Chất độc sẽ làm tê liệt con mồi và gây tử vong cho đối tượng trong thời gian rất ngắn

- Loài ăn cá (Piscivorous): Ốc cối săn mồi các loại cá nhỏ được goi là piscivorous

Có 2 loại phương thức săn mồi đối với ốc cối ăn cá: săn mồi bằng móc câu

(hook-and-line hunters) và săn mồi bằng lưới (net hunters)

+ Phương thức săn mồi theo dạng móc câu (Hình 1.5)

Ốc cối phóng răng kitin có móc gai để giữ chặt đồng thời tiêm chất độc vào con mồi, sử dụng vòi hút giống như 1 cần câu cá, chúng sử dụng ống siphon-1 cơ quan như mũi để tìm kiếm con mồi xung quanh vùng nước Nếu phát hiện mồi chúng sẽ mở rộng vòi (vòi có thể mở rộng gấp đôi chiều dài cơ thể) trong vòi có lao móc chứa nọc độc sẽ bắn vào cơ thể con mồi Nọc độc từ lao móc là hỗn hợp của nhiều chất độc khác nhau sẽ xâm nhập vào cơ thể và làm tê liệt con mồi, ban đầu con mồi sẽ co giật mạnh vài giây sau đó bất động và cứng đờ Răng kitin có các gai móc buộc chặt con mồi vào vòi của nó, con mồi nhanh chóng được cuốn vào miệng

để ốc có thể ăn Càc loài ốc săn mồi theo cách này cần con mồi trở nên cứng đờ để

có thể dễ dàng nuốt chúng

Hình 1.5: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối

(http://www.theconesnail.com/explore-cone-snails/prey/piscivores)

+ Phương thức săn mồi theo dạng lưới (Hình 1.6)

Một hoặc nhiều con mồi bị bắt giữ thông qua vòi được mở rộng như lưới sau

đó tiêm chất độc vào chúng thông qua các gai móc để làm tê liệt con mồi Một số loài có vòi hút ở ngoài giống như ngón tay làm con mồi nhầm tưởng là hải quỳ Phần miệng mở rộng trông giống như một cái bát san hô hoặc nơi trú ẩn trên rạn san

hô Ở các loài săn mồi theo cách này độc tố của chúng gây ra dạng tê liệt mềm, quá trính tiêu hóa con mồi sẽ kéo dài từ vài giờ đến vài ngày

Hình 1.6: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối (http://www.theconesnail.com/explore-cone-snails/prey/piscivores)

- Loài ăn nhuyễn thể (Molluscivorous) : ốc cối ăn các loài nhuyễn thể khác được

gọi là molluscivorous Một vài loài ốc cối ăn các loài ốc khác như là ốc tiền (cowries), olive shells, turbo snails, và conch snails, trong khi đó các loài khác lại

ăn các loài ốc cối khác Những loài ốc này có thể giết và nuốt những con mồi lớn hơn chúng

- Loài ăn giun biển (Vermivorous) : ốc cối ăn các loài giun biển (polychate) được

gọi là vermivorous Ốc cối ăn giun biển dùng hệ thống phân phối độc tố tương tự như ốc ăn cá và nhuyễn thể Khi con mồi bị tiêm nọc độc và tê liệt, ốc cối sẽ nhanh chóng tiêu hóa chúng

I.2.1.3 Đặc điểm sinh học và sinh sản

* Tuổi thọ, kích cỡ và trọng lượng

Dựa vào chỉ tiêu sinh trưởng của vỏ thì vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10-15 năm trong tự nhiên, cũng như trong điều kiện nuôi nhốt Chúng có thể đạt đến kích cỡ chiều dài tối đa là 23cm, nhưng hầu hết các loài đều có kích thước nhỏ dưới 8cm, và khối lượng dưới 100g (Rockel và cs, 1995)

* Tập tính sống

Ốc cối thường sống đơn lẻ, nhưng một số loài được tìm thấy với số lượng

lớn ở một số khu vực riêng biệt do môi trường sống thích hợp Chúng đạt đến mật

độ tối đa là 40 cá thể/m2, nhưng thường có số lượng ít phong phú hơn (Korn và cs, 2001)

Phần lớn các loài ốc cối săn mồi vào ban đêm Mặc dù chúng có cuống mắt nhưng tầm nhìn của chúng rất kém, và chúng được cho là sử dụng khả năng cảm nhận hóa học để tìm kiếm con mồi Mặc dù một số loài có thể thích nghi với vùng nước lạnh, và một số loài, bao gồm các loài có vỏ lớn có thể được tìm thấy ở độ sâu

≥ 100m, ốc cối đa dạng nhất ở vùng nước nông nhiệt đới Trên một triền san hô ở trung tâm vùng biển Ấn Độ- Thái Bình Dương, hơn 30 loài ốc khác nhau đã được tìm thấy (Korn và cs, 2001)

* Đặc điểm sinh sản

Sinh sản của ốc cối vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi, nhưng hầu hết các loài này đều có sự phân chia giới tính và thụ tinh trong Quá trình thụ tinh tiến hành trong xoang áo Cơ quan giao phối là một tua đầu biến đổi, có rãnh ở giữa và các giác bám kém phát triển Khi thụ tinh thì con đực lấy một ít bao tinh từ túi Needham rồi chuyển vào xoang áo của con cái và gắn chặt vào lỗ sinh dục cái Trứng bé và có

ít noãn hoàng Noãn hoàng dùng để cung cấp chất dự trữ cho quá trình phát triển

của phôi Trong quá trình phát triển mắt được hình thành từ lá phôi ngoài, tua miệng được chuyển ra phía trước và xếp quanh miệng Phát triển trực tiếp không qua biến thái

Trứng được đẻ một lần trong năm Mỗi trứng được bao bọc bởi nhiều nang trứng, mỗi nang trứng lại chứa rất nhiều trứng khác nhau Ấu trùng và con non của

ốc cối thường có 2 hình thức chính: Dạng ấu trùng Veliger (ấu trùng bơi lội tự do),

và dạng con non Veliconcha (có hình dáng gần giống cá thể trưởng thành) Thời kì đầu của quá trình phát triển thường bị hạn chế, bởi số lượng ấu trùng bị hao hụt rất nhiều Do đó, trong quá trình ương nuôi ốc cối thường gặp nhiều khó khăn Thời kì

ấu trùng sống ngoài khơi thường kéo dài khoảng từ 1 đến 50 ngày Ngoài ra sự lai giống của ốc cối vẫn chưa được thông báo Vòng đời của ốc cối được trình bày ở hình 1.7:

Hình 1.7: Vòng đời của ốc cối (Conus spp.) (Rockel và cs, 1995)

I.2.2 Tổng quan độc tố ốc cối

I.2.2.1 Giới thiệu về độc tố ốc cối

Độc tố ốc cối (conotoxin) là những đoạn peptide nhỏ dài 12 - 46 axit amin, giàu liên kết disulfide, có hoạt tính gây độc thần kinh gọi là conotoxin Chúng được tiết ra từ cơ quan miệng có răng sừng dạng kim và một ống xoắn gắn với một túi chứa dạng bầu có thể co bóp Đây là vũ khí hữu hiệu giúp chúng bắt mồi, cạnh tranh sinh học và tự bảo vệ Mỗi loài ốc chứa một loại độc tố riêng, mỗi loại độc tố lại là một hỗn hợp các peptide độc rất phức tạp, có cấu trúc và tính dược lý đặc trưng

Conotoxin gồm có các conopeptide (những peptide nhỏ chứa nhiều liên kết disulfide và gốc cysteine) và conantokins (những peptide không chứa gốc cysteine

mà thường đặc trưng bởi gốc gama – carbocyglutamic acid – Gla)

Tuyến nọc độc chứa lượng lớn các peptide có tác động chọn lọc lên hệ thần kinh ngoại biên và trung tâm thần kinh của động vật có xương sống và không xương sống Các thành phần khác nhau sẽ có tác động riêng biệt lên các ion và các thụ thể cũng như các nhân tố khác của hệ thông tin liên lạc giữa các tế bào Tập tính

ăn của các loài ốc sẽ dẫn đến sự khác nhau trong thành phần của conotoxin, điều này giải thích cho sự đa dạng của các peptide độc tố Hầu hết conotoxin ở các loài

ốc ăn cá có sự đa dạng hơn các loài ăn giun và nhuyễn thể (Olivera, 1985)

Tuyến nọc độc của ốc cối chứa peptide ngắn được gọi là conotoxin, mỗi loài

ốc cối sản sinh ra một hỗn hợp các peptide độc rất phực tạp, có cấu trúc và tính dược lý đặc trưng Conotoxin gồm những nhóm sau:

• Conotoxin tác động lên kênh natri: µ− ,µ0- và δ - conotoxin

• Conotoxin tác động lên kênh canxi: nhóm ω conotoxin

• Conotoxin tác động lên thụ thể nicotinic acetylcholine: họ α conotoxin

• Conotoxin tác động lên kênh kali: κ- conotoxin

• Conotoxin tác động lên N – methyl – D – Aspatide: họ conantokin

I.2.2.2 Cấu tạo bộ máy sinh độc tố

Đặc tính của ốc là loài di chuyển chậm nên dễ bị các loài động vật ăn thịt khác tấn công Do đó, muốn tồn tại và phát triển cơ thể chúng phải có cấu tạo đặc biệt để thích nghi với điều kiện môi trường Cơ quan đó chính là tuyến độc Tuyến độc tiết ra nọc độc giúp chúng bắt những con mồi xa dễ dàng bằng cách tấn công làm tê liệt con mồi, mặt khác tuyến độc còn là vũ khí giúp chúng tự vệ cũng như tiêu diệt kẻ thù

Tuyến nọc độc của ốc cối gồm 4 bộ phận : túi nọc độc, ống dẫn độc, vòi hút, túi răng kitin Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối được trình bày ở hình 1.8:

Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối (Olivera, 2002, có bổ sung)

Túi nọc độc: còn được gọi là túi Leiblin, là cơ quan lớn nhất trong tuyến nọc

độc, có chức năng tiết ra độc tố, đồng thời tạo ra áp lực khi bơm độc tố vào con

mồi Túi nọc độc có hình lưỡi liềm, màu trắng sữa, nằm vuông góc với trục của cơ thể, lõm về phía đỉnh vỏ, lồi ra về phía ngược lại

Ống dẫn độc: là đường dẫn chính trong tuyến nọc độc, có vai trò dẫn chất độc từ

túi nọc đi ra răng kitin để tiêm vào con mồi, màu vàng nhạt, trong cơ thể nó cuộn thành

bó nằm trong phần lõm của túi nọc độc (hình 8) nằm ở mặt phải và phía sau của hầu

Vòi hút: là phần cuối cùng của tuyến nọc độc, rỗng phía trong, hình chóp cụt,

lớn hơn ở phần nối với hầu, nhỏ hơn đối với phần còn lại, có khả năng thay đổi kích thước và độ đàn hồi rất tốt Khi tấn công con mồi, vòi hút sẽ phình to lên hút con mồi vào bên trong đưa đến nhánh ngắn của túi răng kitin và răng kitin được phóng vào, tiếp đến chất độc sẽ được bơm đầy làm tê liệt con mồi Cấu trúc mô học của vòi hút là lớp tế bào cơ vân, chính cấu trúc này giải thích cho khả năng đàn hồi và sức chứa đựng lớn

Túi răng kitin (dải răng kitin): chứa các răng kitin Dải răng này bao gồm hai

nhánh như hai cánh tay Nhánh dài có màu đỏ ở phần nối với ống dẫn và vàng nhạt

ở phần còn lại, nhánh còn lại trong suốt Phía cuối túi răng kitin này có tế bào odontoblast (tế bào tạo răng) có vai trò tạo ra các răng kitin Các răng kitin ban đầu mềm sau đó trở nên cứng khi chúng di trú từ nhánh dài đến nhánh ngắn Quá trình

Ống dẫn

Túi nọc Túi răng

Vòi hút

đi tới nhánh ngắn răng kitin đi song song dọc theo túi Chỉ một răng kitin trưởng thành, cứng lên và đi về phía hầu chuẩn bị cho việc tấn công

Cấu tạo răng kitin của ốc cối được trình bày ở hình 1.9:

Hình 1.9: Răng kitin Conus spp

Ngạnh đầu (N1), ngạnh thứ hai (N2), lưỡi kim (L), đường răng cưa (Rc), thân răng

(Tr), cựa đáy (C), dây chằng (Dc)

Răng kitin: răng kitin của Conus spp giống như kim tiêm trong suốt, khi

tiêm vào cơ thể con mồi răng kitin sẽ được giữ lại trong cơ thể, răng này có vai trò trực tiếp đưa chất độc vào cơ thể con mồi Trên răng có các ngạnh để giữ răng kitin lại trong con mồi Tùy từng loài sẽ có kích thước răng kitin khác nhau Có những loài răng là những kim tiêm rất nhỏ yếu, có loài răng kitin lại rất cứng và chắc Các ngạnh của kim tiêm giống như các ngạnh của lưỡi câu Tất cả răng kitin các loài ốc cối có ngạnh đầu, một số có ngạnh thứ hai, ngoài ra còn tìm thấy một số rất ít loài

có ngạnh thứ ba Lưỡi răng kitin có vai trò cắt và mở rộng diện tích tiếp xúc khi phóng kim tiêm vào con mồi Đường răng cưa là một dãy răng nhỏ chạy dọc phía trong thân răng kitin từ ngạnh đầu xuống gần giữa răng kitin Các răng nhỏ này có

kích thước lớn dần từ đỉnh đến giữa thân răng kitin Hầu hết tất cả các loài có một

hàng răng nhỏ, chỉ một số ít có hai hàng, một số loài không có đường răng cưa này

I.2.2.3 Phân loại độc tố conotoxin

Độc tố ốc cối được phân ra thành 6 superfamily (A-, M-, O-, P-, S-, và T) dựa trên khung cystein của chúng, sự tương đồng của trình tự pre-pro của gen, kiểu cuộn và tác dụng sinh lý (Olivera và cs, 2006) Các độc tố trong một superfamily có thể có các đích tác dụng khác nhau như ức chế hoặc kìm hãm đối với một kênh ion hoặc receptor gắn với protein G đặc trưng (Becker và Terlau, 2008) Chúng được biết có hoạt tính antinoceptive, chống động kinh, bảo vệ tim, bảo vệ thần kinh, do

đó chúng trở nên các công cụ hữu ích trong nghiên cứu ung thư và rối loạn tâm lý

(Bingham, 2010)

Superfamily A gồm 4 họ độc tố: α-, αA-, κA- và ρ-conotoxin Trong đó α-,

và αA-conotoxin là các nAChR đối kháng, κA- conotoxin tấn công vào các kênh

K+ trong khi ρ-conotoxin là các antagonist ưa thích tấn công vào các a1Badrenoceptor α-conotoxin làm ngăn cản các thụ thể acetylcholine nicotinic (nAChR) Các α-conotoxin có chứa từ 12 đến 25 acid amin và có 4 cystein, tạo nên hai liên kết disulfid α-conotoxin SII có chứa 6 cystein và 3 liên kết disulfid Việc

ức chế các thụ thể này cho thấy có liên quan trúc tiếp đến việc học, antinoception,

nghiện nicotin, và rối loạn thần kinh thuộc bệnh Parkinson và Alzheimer

Superfamily M nhỏ hơn, có hai họ là µ- và ψ-conotoxin Psi (ψ)-conotoxin

tấn công vào kênh nAChR, không cạnh tranh trong khi mu (µ)-conotoxin làm nghẽn kênh natri phụ thuộc điện thế (voltage) Nav trong các tế bào excitable như cơ, tim,

mô cơ xương và mô thần kinh Với kích thước trung bình, 22 acid amin,

µ-conotoxin có 6 cystein và 3 liên kết disulfid

Superfamily O là lớn nhất và có 5 họ: µO-, δ-, ω-, κ- và γ-conotoxin Cả hai

họ µO- và δ-conotoxin tấn công kênh Nav ( khác vùng với µ-conotoxin) trong khi các họ khác tương ứng tấn công các kênh Ca2+, kênh K+ và kênh Pacemaker δ-

conotoxin có chứa khoảng 30 acid amin và có bản chất kỵ nước mạnh

Superfamily P chỉ chứa một họ có tính ức chế cystein knot motif, gây chứng

co cứng cơ Các độc tố này gây chứng liệt cơ ( spastic paralysis) nhưng phân tử của chúng vẫn chưa xác định được Một ví dụ của conotoxin gây liệt cơ là Tx9a, là một peptid chứa acid glutamic gamma carboxy được tìm thấy trong độc tố của loài ốc ăn

nhuyễn thể là Conus textile Sự biến đổi sau khi phiên dịch mã (post-translational

modifications, PTMs) trong các conotoxin là phổ biến và thay đổi; đặc điểm này

làm làm tăng tính đa dạng sinh học và khả năng tấn công mục tiêu

Superfamily S cũng chỉ có một họ, tách ra từ Conus geographus, cũng chưa

được biết rõ Họ σ-conotoxin có peptide khá lớn, 41 acid amin, chứa 8 cystein và 4 liên kết disulfid Họ này có đặc điểm hóa học rất khác so với các họ đã nói trên Chúng là antagonist của thụ thể 5HT3, có đáp ứng kích thích kéo theo trong neuron

khi serotonin liên kết (5-hydroxytryptamine)

Cuối cùng là superfamily T bao gồm hai họ là τ- và χ-conotoxin Các peptide

thuộc các họ này có 4 cystein và hai liên kết disulfid τ-conotoxin ức chế kênh Ca2+

pre-synap trong khi χ-conotoxin ức chế NET

Các lớp nhỏ hơn của các conopeptide không được xếp vào các superfamily nói trên Chúng hoặc là chỉ chứa một liên kết disulfide hoặc có bản chất tuyến tính không chứa cystein Các superfamily của conotoxin của ốc cối được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Các superfamily của conotoxin (Bingham, 2010) Super-

family

Khung

Mục tiêu (thụ thể/kênh) Ví dụ Nguồn gốc ốc

K+

α-Iml ρ-TIA αA-PIVA κA-SIVA

C.imperialis C.tulipa C.purpurascens C.Striatus

Ψ

κM

Na+nACh

K+

Μ-GIIIA Ψ-PIIIE κM-RIIIK

C.geographus

C purpurascens C.radiatus

µO-MrVIA δ-TxVIA ω-MVIIA κ-PVIIA γ-PnVIIA

C.marmoreus

C.textile C.magus

C purpurascens C.pennaceus

P C-C-C-C-C-C Spastics Chưa xác định Tx9a C.textile

τ-TxIX χ-MrIA

C.textile C.marmoreus

Lys-cono-C.geographus C.amadis

Tuyến tính Không có

cystein O-linked

Conantokins Conorfamide Contulakin

Glutamate(NM DA)

RF amide Neurotensin

Pr1 CNF-Sr2 Contulakin

C.parius C.spurius C.geographus

I.2.2.4 Ứng dụng y học của độc tố ốc cối

Tùy thuộc vào khả năng gây tử vong, mỗi loại peptide của độc tố ốc thuộc

loại conotoxin (gây tử vong) hoặc conopeptide (không gây tử vong) Mỗi loại độc tố

ốc là một dãy duy nhất chứa trên 100 loại peptide khác nhau Khi giải mã gen, người ta thấy rằng các conotoxin là các propeptide, sau đó chúng được enzym endoprotease phân cắt để tạo thành các peptide độc cuối cùng Các peptide này có kích thước nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định, tác dụng vào các mục tiêu

chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dò (probe) lý tưởng trong dược học Một điều rất ngạc nhiên là đa số các độc tố ốc có liên quan sự giảm đau đớn và được dùng trong trị liệu giảm đau Người ta ước lượng có khoảng trên 50.000 đến 100.000 loại conopeptide nhưng chỉ mới khoảng 0,1% được đặc trưng hóa về dược học Chính nguồn độc tố lớn lao này là một nguồn vật liệu dồi dào cho việc nghiên

cứu đặc tính và ứng dụng

Việc nghiên cứu độc tố ốc cối đã được tiến hành trên sáu thập niên, qua đó

đã phát hiện và tìm ra các peptide có dược tính giảm đau Hiện nay mới chỉ có trên

1000 chuỗi peptide được định danh và xác định được tính chất ức chế các kênh ion của chúng So với nguồn từ trên 50.000 cho đến 100.000 loại peptide trong độc tố

ốc cối, đây mới chỉ là con số nhỏ bé

Hiện nay, có 6 peptide khác nhau của ốc cối đã được thử nghiệm lâm sàng trên người Một bước tiến quan trọng là việc sử dụng các đoạn peptide của ốc cối để làm thuốc giảm đau đã được chấp nhận bởi Viện Vệ Sinh và An Toàn Thực Phẩm vào tháng 12 năm 2004 (Olivera, 2006) Sản phẩm thương mại Prialt (gọi chung là

ziconitite) được bào chế từ các đoạn peptide tự nhiên, chủ yếu là từ loài Conus magus, và được thiết kế một cách độc đáo từ họ peptide ω-conotoxin MVIIA Đây

là một trong những lớp peptide được tchs chiết từ độc tố của loài ốc cối ăn cá (tác dụng lên kênh Ca2+ ) Một loại peptide khác, cũng hoạt động theo cơ chế như trên,

là ω-conotoxin GVIA từ Conus geographus cũng được ứng dụng rộng rãi trong

khoa học thần kinh, với khoảng hơn 2000 nghiên cứu sử dụng thành phần này trong

nghiên cứu dược lý học (Terlau và Olivera, 2004) Những ứng dụng y học của các peptide độc tố được trình bày ở bảng 1.3:

Bảng 1.3: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng

I.3 TỔNG QUAN VỀ TY THỂ VÀ DNA TY THỂ

 Ty thể (Hình 1.10)

Hình 1.10: Cấu trúc của ty thể (www.nangluongsinhhoc2011.blogspot.com)

Ty thể được phát hiện và mô tả đầu tiên bởi Altman từ năm 1894 và đến năm

1897 Benda đặt tên là mitochondria Cấu trúc siêu hiển vi của ty thể được Palad nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử vào năm 1952 và Sjostand vào năm 1953

Các động vật có cấu trúc phức tạp, bao gồm cả con người, đều cần một lượng lớn năng lượng mới có thể tồn tại được Ty thể là những bào quan phổ biến trong các tế bào nhân chuẩn có lớp màng kép và hệ gene riêng Chúng có thể được coi là những nhà máy sản xuất năng lượng của tế bào Tại đây xảy ra quá trình hô hấp tế bào chuyển ôxy và chất dinh dưỡng thành adenosine triphosphate (ATP)

- Hình dạng và thành phần hóa học của ty thể

Ty thể là những bào quan nhỏ vùi trong tế bào chất đường kính 1-10 micromet Số lượng thay đổi tùy thuộc từng loại tế bào Ví dụ: tế bào gan động vật thường chứa khoảng 1000 - 2000 ti thể, phân bố tương đối đều, chiếm 1/5 thể tích tế bào

Ty thể có đường kính trung bình 0.5-1µm, thường có dạng hình thoi hoăc bầu dục Có thể tròn (ở những tế bào cần ít năng lương) hoặc dài (ở tế bào có hoạt động mạnh) Có thể phân tán đều trong tế bào chất, có thể tập trung ở một số vùng nhất định: tế bào ruột-ở gân lông nhung, tế bào tinh trùng-quanh đoạn giữa

Trong ty thể có các thành phần : C, H, O, N, S, P và một số nguyên tố vi lượng Các ion Ca, Ma cũng có trong Ty thể với số lượng nhỏ Các đại phân tử gồm

có prôtêin chiếm tỉ lệ 30-40%, lipit 25-30%, các loại axit nucleic 1% Trong ty thể

có tập hợp các hệ enzim xúc tác quá trình oxy hóa-khử và trao đổi năng lượng Ngoài ra trong ty thể đáng chú ý là ADN ty thể và ribôxom

- Cấu trúc của ty thể

Ty thể được cấu tạo bởi hai lớp màng, các màng này đóng vai trò quyết định trong hoạt động chuyển hoá năng lượng Từ trong ra ngoài cấu trúc của ty thể bao gồm: khoang chất nền, màng trong, khoang gian màng và cuối cùng là màng ngoài

Chất nền là khoảng chiếm bên trong cùng của ty thể

+ Màng ngoài trơn nhẵn, ngăn cách ty thể với tế bào chất

+ Màng trong bao quanh xoang trống của ty thể và hình thành nên các tấm

răng lược ( mào), chúng ngăn ty thể thành 2 xoang là xoang trong và xoang ngoài

nhưng vẫn lưu thông với nhau

+ Trên mào chứa enzim hô hấp

+ Chất nền có chứa ADN và Ribôxôm

+ Ty thể chứa nhiều ADN vòng, ARN, Prôtêin và Lipit

- Chức năng của ty thể

+ Là trạm chuyển hoá năng lượng từ chất dinh dưỡng thành năng lượng tích trữ dưới dạng ATP Mào chứa nhiều enzim hô hấp có vai trò quan trọng trong việc biến đổi năng lượng dự trữ trong các nguyên liệu hô hấp( glucose) thành năng lượng ATP cho tế bào

+ Tham gia quá trình di truyền qua tế bào chất

+ Sản xuất một số hợp chất hữu cơ Có khả năng tự tổng hợp 1 số loại Prôtêin (các enzim ôxi hoá)

+ Tạo ra nhiều sản phẩm trung gian có vai trò trong quá trình chuyển hoá vật chất

 Hệ gen ti thể (Mitochondrial DNA – mtDNA) (Hình 1.11)

DNA ty thể (mitochondrial DNA- mtDNA) là một genome độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ty thể Bộ gen ty thể có cấu tạo xoắn kép, trần, mạch vòng với 2 chức năng chủ yếu:

- Mã hóa nhiều thành phần của ty thể

- Mã hóa cho một số protein tham gia vào chuỗi chuyền điện tử

Hình 1.11: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng

mã hóa protein Mũi tên đỏ chỉ gen CO1.

(www.nangluongsinhhoc2011.blogspot.com)

DNA ty thể của tế bào động vật mã hóa đặc trưng cho 13 protein, 2 rRNA và

22 tRNA DNA ty thể của nấm men Saccharomyces cerevisiae dài hơn mtDNA

của tế bào động vật năm lần do sự có mặt của các đoạn intron dài

Các genome ty thể có kích thước tổng số rất khác nhau, các tế bào động vật có kích thước genome nhỏ (khoảng 16,5 kb ở động vật có vú) Có khoảng một vài trăm

ty thể trên một tế bào Mỗi ty thể có nhiều bản sao DNA Số lượng tổng số của DNA ty thể so với DNA nhân là rất nhỏ (<1%)

Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae, genome ty thể có kích thước khá

lớn (khoảng 80 kb) và khác nhau tùy thuộc vào từng chủng Có khoảng 22 ty thể trên một tế bào, tương ứng khoảng 4 genome trên một cơ quan tử Ở những tế bào sinh trưởng, tỷ lệ mtDNA có thể cao hơn (khoảng 18%)

Kích thước của genome ty thể ở các loài thực vật là rất khác nhau, tối thiểu khoảng 100 kb Kích thước lớn của genome đã gây khó khăn cho việc phân lập nguyên vẹn DNA, nhưng bản đồ cắt hạn chế (restriction map) trong một vài loài thực vật đã cho thấy genome ty thể thường là một chuỗi đơn, được cấu tạo như một mạch vòng Trong mạch vòng này có những chuỗi tương đồng ngắn và sự tái tổ hợp giữa chúng đã sinh ra các phân tử tiểu genome (subgenome) mạch vòng nhỏ hơn, cùng tồn tại với genome “chủ” (master genome) hoàn chỉnh, đã giải thích cho sự phức tạp của các DNA ty thể ở thực vật

Bảng 1.4 tóm tắt sự phân công của các gen trong một số genome ty thể Tổng

số gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan với kích thước của genome

Ty thể động vật có vú sử dụng các genome 16 kb của chúng để mã hóa cho 13 protein, trong khi đó ty thể nấm men S cerevisiae dùng các genome từ 60-80 kb mã hóa cho khoảng 8 protein Thực vật với genome ty thể lớn hơn nhiều mã hóa cho nhiều protein hơn Các intron được tìm thấy trong hầu hết các genome của ty thể, nhưng lại không có trong các genome rất nhỏ của động vật có vú

Bảng 1.4: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA

Hai rRNA chính luôn được mã hóa bởi genome ty thể Số lượng các tRNA được mã hóa bởi genome ty thể dao động từ không cho đến đầy đủ (25-26 trong ty thể) Nhiều protein ribosome được mã hóa trong genome ty thể của thực vật và sinh vật nguyên sinh, nhưng chỉ có một ít hoặc không có trong genome của nấm và động vật

Ti thể di truyền theo dòng mẹ Hệ gen ti thể có số lượng gen ít hơn hệ gen nhân, ko có hiện tượng trao đổi chéo, các thay đổi chủ yếu do đột biến nên dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử

 Cấu trúc gen ty thể của ốc cối Conus textile (Hình 1.12)

Năm 2008, trình tự DNA ty thể của Conus textile đã được giải mã hoàn toàn

có chiều dài 15.562 nucleotide và có cấu trúc tương tự như DNA ty thể loài ốc

Lophiotoma cerithiformis Hệ gen ty thể Conus textile là một phân tử DNA dạng

vòng, có chiều dài 15562 nucleotide, mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA

Trong đó, các gen mã hóa protein ty thể bao gồm: các gen coxI-III mã hóa cho cytochrome oxidase 1-3; các gen atp6 và atp8 mã hóa cho các tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPase; các gen nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b Các gen khác bao gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen rrnS mã hóa 12S rRNA và gen rrnL mã hóa cho 16S

rRNA) và 22 gen mã hóa các tRNA Hai tiểu đơn vị lớn và nhỏ của rRNA được sao chép từ cùng một sợi trong khi các tRNA cho M, Y, C, W, H, G, E, và T được sao chép từ các sợi bổ sung (Bandyopadhyay và cs, 2008)

Hình 1.12: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile Mũi tên ký hiệu gen CO1

 Ứng dụng chỉ thị CO1 mtDNA(Cytochrome oxidase subunit 1) trong nghiên cứu di truyền:

CO1 (cytochrome c oxidase subunit 1) là một protein được tìm thấy trong ty thể CO1 chỉ di truyền qua hệ mẹ, nó thường được sử dụng trong mã hóa trình tự DNA của các loài vì tần số đột biến của nó thường đủ nhanh để phân biệt mối quan hệ chặt chẽ giữa các loài Ngoài ra CO1 còn có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu di

truyền như định danh loài và nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa

Folmer và cs (1994) thiết kế cặp mồi của chuỗi phản ứng (PCR) khuếch đại đoạn 710bp của gen CO1 mt DNA từ 11 ngành động vật không xương sống: Echinodermata, Mollusca, Annelida, Pogonophora, Arthropoda, Nemertinea, Echiura, Sipuncula, Platyhelminthes, Tardigrada, and Coelenterata Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài của các loài sinh vật Nhóm tác giả tập trung vào gen CO1 vì nó xuất hiện bảo thủ trong số các gen mã hóa protein trong bộ gen ty thể của động vật và được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu tiến hóa về sau

Bandyopadhyay và cs (2008) đã hoàn thành giải trình tự DNA ty thể của loài

Conus textile và xác định được trình tự đoàn chèn giữa coxI và coxII của C textile

dài hơn 165bp, điều này có ý nghĩa quan trọng trong phân tích mối quan hệ tiến hóa

giữa các loài Conus với nhau và đặc biệt có ý nghĩa trong việc xây dựng mô hình

tiến hóa giữa các loài trong tổng họ Conoidea

Duda và Rolan (2005) sử dụng gen CO1 mtDNA của 90 loài ốc cối trong đó

có 30 loài đặc hữu ở quần đảo Cape Verde để khảo sát mối quan hệ tiến hóa và xác định nguồn gốc các loài ốc cối ở Cape Verde Kết quả cho thấy các loài này được phân làm 2 nhóm riêng biệt và thể hiện quần đàn đặc trưng cho vùng địa lý rất hẹp này

Duda và cs (2008) đã sử dụng các chỉ thị phân tử của DNA ty thể (16S rRNA

và CO1) và một chỉ thị phân tử của DNA nhân để kiểm chứng phân loại một số loài

ốc trong giống Conus (Conus sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis, Conus musicus và Conus parvatus) tại khu vự miền tây Ấn Độ - Thái Bình Dương và Conus nux ở khu vực đông Thái Bình Dương Kết quả trong sự phân tích phát sinh của Conus nanus và Conus sponsalis cho thấy sự tiến hóa khác biệt, hoàn toàn phù

hợp với hình thái khác nhau của chúng, và cũng đã xác định được một vài loài cận giống mà mức độ loài tiến hóa khác nhau

I.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.)

I.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

I.4.1.1 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loài của ốc cối

Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái giải phẫu (mà chủ yếu là kích thước, màu sắc, hoa văn vỏ, cấu tạo của hệ thống tiêu hóa, …) đôi khi mang lại kết quả không chính xác, đặc biệt là đối với các loài có quan hệ gần gũi và do vậy có nhiều đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhau Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết.Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một

họ gen Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau

Với những loài có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng Song với các

loài có quan hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao) Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và Robert, 2005) Sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể sẽ giúp nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ Gen 16S rRNA mang đặc điểm cấu trúc cơ bản, có mặt ở khắp nơi và có đặc tính tiến hóa, bởi vậy nó trở thành marker phổ biến nhất trong sinh học phân tử

Tuy nhiên, cho tới nay, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc giống ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do các chỉ thị phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Espiritu và cs, 2002; Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005) Vì vậy, trong các nghiên cứu gần đây, các chỉ thị phân tử của DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị phân tử của DNA nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Duda & Palumbi, 1999; Cunha và cs, 2005; Duda và Kohn, 2005; Bandyopadhyay và cs, 2008; Nam

và cs, 2009) Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin…và vùng không mã hóa như đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2)

Duda và Kohn (2005) đã sử dụng gen mã hóa 16S rRNA (ty thể) và protein calmodulin (gen nhân) để nghiên cứu phát sinh chủng loại của 138 loài ốc cối Conus thu thập tại các vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương, đông Thái Bình Dương

và Đại Tây Dương Kết quả chỉ ra rằng các loài hiện nay là con cháu từ 2 nhánh

(lineage) chính và phân hóa ít nhất cách đây 33 triệu năm Sự phân bố địa lý của chúng cho thấy 1 một nhóm (clade) bắt nguồn từ biển Ấn Độ - Thái Bình Dương, còn nhóm kia ở đông Thái Bình Dương và tây Đại Tây Dương

Cunha và cs (2005) đã sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val, cytochrome b) kết hợp với một gen nhân (gen mã hóa một lipoprotein giống megalin) để xây dựng cây phát sinh chủng loại của 49 loài ốc cối thuộc quần đảo Cape Verde, trong đó có 3 loài chưa được định danh Kết quả các loài ốc cối này được chia làm hai nhánh chính: nhánh thứ nhất bao gồm các loài ốc cối có vỏ lớn và nhánh thứ hai bao gồm các loài có kích thước nhỏ hơn Cả hai nhánh đều chứa các loài đặc hữu, điều này chứng tỏ tổ tiên của chúng đã di cư tới Cape Verde một cách độc lập

Cunha và cs (2008) tiếp tục nghiên cứu phát sinh chủng loại của 4 loài ốc thuộc

nhánh có vỏ lớn là C ateralbus, C pseudonivifer, C trochulus, và C venulatus sử dụng các gen coxI (mã hóa cytochrome oxidase I) và nad4 (mã hóa tiểu đơn vị 4

của NADH dehydrogenase) Nghiên cứu được tiến hành trên 200 mẫu ốc thu thập tại 16 địa điểm thuộc các đảo Sal, Boavista và Maio Kết quả cho thấy, các mẫu ốc thuộc 4 loài này được chia làm 3 nhánh rõ ràng, tương đối cách xa nhau mà việc phân loại dựa vào màu sắc vỏ và hoa văn không thể hiện rõ ràng

Nam và cs (2009) sử dụng chỉ thị phân tử của gen nhân ITS2 để đánh giá mối quan hệ tiến hóa của 26 loài ốc thu thập tại vùng biển thuộc quần đảo Marinduque, Philippines Kết quả cho thấy trình tự ITS2 được bảo tồn giữa các cá thể thuộc cùng một nhóm dinh dưỡng, nhưng lại thể hiện sự đa dạng ở mức độ phù hợp cho việc xác định vị trí phân loại của các loài mới phân hóa Hơn nữa, việc sử dụng kết hợp các chỉ thị ty thể (12S rDNA, 16S rDNA và CO1) và chỉ thị ITS2 đã chia nhóm ăn nhuyễn thể (M) thành 3 nhánh rõ ràng là Conus, Cyclinder và Darioconus

Như vậy, việc sử dụng rộng rãi các chỉ thị phân tử, đặc biệt là việc kết hợp các chỉ thị phân tử DNA ty thể và DNA bộ gen đã góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ loài ốc cối nói chung và theo vùng địa lý nói riêng Các nghiên cứu cũng giúp nâng cao hiểu biết về lịch sử tiến hóa, địa sinh học của ốc cối cũng như phân biệt các loài cận giống