Tiểu luận sự tinh chế và đặc điểm của serin protease từ khuẩn bacillus laterosporus AK1 kiềm,chịu nhiệt

Sự tinh chế và đặc điểm của serin protease từ khuẩn Bacillus Laterosporus AK1 kiềm, chịu nhiệt Tóm tắt. Một loại protease kiềm , chịu nhiệt , ngoại bào phân lập từ Bacillus Laterosporus _ AK1 được làm sạch bởi phương pháp lọc gel G – 200 và những kĩ thuật của phép sắc ký trao đổi ion cenlulo DEAE. Chế phẩm protease thể hiện độ hoạt động tương đối lớn 100% trong chất nền cozein và xuất hiện như một vạch đơn dựa vào kĩ thuật điện di với phân tử khối 86.29 KDA. Hiệu suất thu hồi enzym protease đã được tinh sạch đến 11.1 lần đạt được 34.3%. Khoa nghiên cứu men chất lỏng cũng đã phát hiện ra một vùng thủy phân hoàn toàn nhờ vào sự hoạt động phân giải protein. Điều này phù hợp với vạch đơn đã thu được bằng phương pháp điện di. Enzym protease có PH = 9 và thể hiện độ hoạt động mạnh nhất ở 750C. Khả năng hoạt động của enzym dễ bị ảnh hưởng bởi chất ức chế protease serin đặc trưng PHSF khi có sự có mặt của protease serin cặn bả tại nơi hoạt động .Hoạt động của enzyme mạnh lên khi có mặt các ion kim loại Ca2+ và Mg2+ và enzyme này thích hợp với màng lọc sạch giữ ổn định 75% thậm chí 1 giờ trước khi vi khuẩn phát triển.Chế phẩm protease chuyển sang màu đỏ máu hoàn toàn khi sử dụng với chất tẩy rửa Wheel.

Sự tinh chế và đặc điểm của

serin protease từ khuẩn Bacillus Laterosporus AK1

kiềm, chịu nhiệt

Tóm tắt.

Một loại protease kiềm , chịu nhiệt , ngoại bào phân lập từ Bacillus Laterosporus _ AK1 được làm sạch bởi phương pháp lọc gel G – 200 và những

kĩ thuật của phép sắc ký trao đổi ion cenlulo DEAE.

Chế phẩm protease thể hiện độ hoạt động tương đối lớn 100% trong chất nền cozein và xuất hiện như một vạch đơn dựa vào kĩ thuật điện di với phân tử khối 86.29 KDA Hiệu suất thu hồi enzym protease đã được tinh sạch đến 11.1 lần đạt được 34.3%. Khoa nghiên cứu men chất lỏng cũng đã phát hiện ra một vùng thủy phân hoàn toàn nhờ vào sự hoạt động phân giải protein Điều này phù hợp với vạch đơn đã thu được bằng phương pháp điện di

Enzym protease có PH = 9 và thể hiện độ hoạt động mạnh nhất ở 750C Khả năng hoạt động của enzym dễ bị ảnh hưởng bởi chất ức chế protease serin đặc trưng PHSF khi có sự có mặt của protease serin cặn bả tại nơi hoạt động Hoạt động của enzyme mạnh lên khi có mặt các ion kim loại Ca2+ và Mg2+ và enzyme này thích hợp với màng lọc sạch giữ ổn định 75% thậm chí 1 giờ trước khi vi khuẩn phát triển.Chế phẩm protease chuyển sang màu đỏ máu hoàn toàn khi sử dụng với chất tẩy rửa Wheel

GIỚI THIỆU

Vi sinh vật ẩn dấu một sự đa dạng của enzym phân giải protein thuộc lớp thứ

tư Nó cũng được tìm thấy trên cơ thể động vật có vú

Protease có tính kiềm được sản xuất bởi Bacillus kiềm , chịu nhệt có thể chịu đưng với nhiệt độ cao, pH, tác nhân làm biến tính hoá học và môi trường không có nước

Vài tác giả có báo cáo (cho rằng) sự sản xuất của protease kiềm ,chịu nhiệt bởi

khuẩn que Bacillus kiềm và trung tính thoe phương pháp tổ hợp trung gian

Tuy nhiên có một vài báo cáo dựa trên sản phẩm của protease có tính kiềm bởi khuẩn que Bacillus trong phương pháp nhân tạo

Protease của vi khuẩn tiêu biểu cho một trong những lớp lớn nhất của những enzym công nghiệp, khoản 40% tổng enzym bán ra trên thế giới Vi khuẩn thể hiện tốt nhất nguồn gốc của enzym bởi những nét đắc trưng của nó

Ví dụ:

Sự rộng lớn hay tính đa dạng của hóa sinh, phát triển nhanh ,yêu cầu về không gian nuôi cấy hạn chế Như là sự không ràng buộc nơi enzym có thể di truyền nguồn gốc để sinh sản ra enzym mới cho những ứng dụng khác nhau.

Mặc dù, sự khác nhau của sự phân giải protein và những vi khuẩn đã biết nhưng chỉ một vài trong chúng cung cấp độ họat động (lớn) với những thành công trong thương mại Bacillus được khai thác một cách rộng lớn phục vụ cho sự sản xuất protease

Protease kiềm đựơc ứng dụng rộng rãi trong một vài ngành công nghiệp như là thuốc làm sạch áo quần trong tiệm giặc ủi, sự thu hồi hoặc hòa tan protein, sự làm mềm thịt, trong công nghiệp đồ da và các cơ sở tổng hợp nhân tạo

Nói chung, protease kiềm là tế bào ngoài tự nhiên và tham gia vào quá trình lên men bởi vi sinh vật Như vậy việc đơn giản quá trình sử lý của enzym được so sánh với những protease thu được từ thực vật và động vật một protease kiềm chịu nhiệt từ B Clausii phát triển trong môi trường trung gian Casein đậu tương, protein kiềm được sản xuất với số lượng đáng kể (15000 Uml -1 ).

Protease kiềm có những thuộc tính bất thường như chịu nhiệt độ tối thích 80 0 C,

PH = 11.5 tính tưong thích và độ bền có ý nghĩa quan trọng đến những chất hoạt động

bề mặt và những chất ôxi hóa (Ganesh Kumar và cộng sự 2004).

Tuy nhiên, giá trị kinh tế lớn của protease đã thúc đẩy quá trình tìm kiếm protease mới với những thuộc tính mới Protease được dùng làm chất phụ gia, thuốc tẩy nên ổn định và tích cực khi có mặt của thành phần thuốc tẩy như chất hoạt động bề mặt, chất xây dựng, tác nhân tẩy trắng, chất lọc, chất làm mềm cách thức tăng trưởng khác nhau

Enzym này được sử dụng như một thành phần tích cực trong sự phát triển của sản phẩm sinh học như kính áp tròng trong suốt và cũng có hiệu quả trong việc làm sạch Trong nghiên cứu, hiện tại chúng tôi đang báo cáo về sự cô lập của vi khuẩn phân giải protein Bacillus Laterospeorus AK1 từ sự phân trộn phân lập chất cặn bả và sự tinh chế của protease kiềm

Vật liệu và phương pháp.

Sephadex G – 200, DEAE là những chất ức chế enzym xenluloza và protease được mua từ sigma của Mĩ và là phân tử đánh dấu cho sự phân tích điện di đạt được từ Genei Banglore, India Tất cả các hóa chất khác cần thiết trong những bước phân lập

Sự phân lập Bacillus Laterosporus – AK1.

Những mẫu đất thu thập được từ sự phân hủy chất hữu cơ tại Ariyalur, Tamiler Nadu, ẤnĐộ ,được pha loãng trong dung dịch muối vô trùng Những mẫu đã pha loãng được đặt ở trong môi trường thạch sữa bao gồm: dung dịch protein 0.1% dung dịch Nacl 0.5%, ván sữa 10% và thạch sữa 2.0% Những đĩa đó được ủ ở nhệt độ 600oC trong vòng 24h

Khi sữa đã thủy phân hoàn toàn thì bổ sung thêm enzym protease đã được xác định là sản phẩm của cơ thể sinh vật Dựa vào vùng phát quang, một dòng vi khuẩn sẽ được chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.Dòng vi khuẩn phân giải protein là một bào

tử có dạng Gram dương được xác định như loài B laterosporus và nó có cấu trúc như B laterosporus- AK1( Holt và cộng sự 1994.)

Sản xuất enzyme

Qúa trình sản xuất enzym protease bởi Bacillus Laterosporus được thực hiện trong môi trường trung gian chứa các chất sau: dung dịch Glucoza 0.5% dung dịch sucrose 1.0% dung dịch K 2 HPO 4 0.05%, dung dịch MgSO 4 7H 2 O 0.05%, dung dịch Nacl 0.02% dung dịch CaCl 2 H 2 O 0.05% với PH = 9 và duy trì ở nhiệt độ 37 0 C trong 48h trong tủ định ôn (120rpm) Sau khi hoàn thành quá trình lên men toàn bộ men cho li tâm ở 1000g tại 4 0 C và dịch nỗi lên trên bề mặt được thu lại và sử dụng như một nguồn enzym.

Sự hoạt động của enzym protease kiềm được xác định bằng phương pháp củaTruchia và công sự (1986) Mỗi lần hoạt động của enzym protease được định nghĩa bằng một lượng enzym cần thiết để phân giải một μ mol tryrosine trong 30 phút ở nhiệt

độ 450C Hoạt động đặc biệt này được mô tả bằng những đơn vị/mg protein Số lượng protein của mẫu được xác định bằng phương pháp nhuộm liên kết của Brad –for (1976)

sử dụng huyết thanh gia súc làm tiêu chuẩn chuẩn

Trong những bước lọc sắc kí hàm lượng protein xác định bởi sự hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 280nm

Sự kết tủa aceton

Như đã mô tả ở trên, khuẩn Bacillus Laterosporus AK1 lớn lên trong khoảng 36h và những tế bào của nó đựợc tách ra bởi phép li tâm (10.000 x g, 15 phút)

Protease nỗi lên trên mặt được kết tủa với 70% axêton Tất cả những bước kế tiếp của quá trình tinh chế đều xảy ra ở nhiệt độ 4 0 C Protein được tách lơ lững trong 0.05M hệ đệm Tris HCl, độ PH = 0.9 và được thẩm tách ngược lại qua cùng một hệ đệm.

Phép lọc sắc ký chất Gel sephadex G – 200

Protein đã kết tủa sẽ được chuyền đến một cột lọc chất làm đông có chứa chất Gel sephadex G – 200 (1.5x24cm) và được cân bằng với bộ đệm Tris – HCl Cột này được tách rửa với tốc độ chảy 40ml/h với cùng một bộ đệm

Từ những mô tả sơ lược về phép tách rửa, người ta quan sát được rằng chất protease bị tách rửa ra như một đỉnh riêng lẻ Những phần hoạt động được tổ hợp, thẩm tích và cô đặc lại bằng phương pháp đông khô

Mẫu enzym đã cô đặc được đưa lên một cột phản ứng trao đổi ion của xenluloza DEAE (2.5cm x 22cm),được cân bằng với 50 M Tris HCl, độ PH = 9 và được làm sạch cùng với cùng một bộ đệm

Tinh chế enzyme

Phương pháp điện di chất Gel SDS –

polyacrylamide.

Theo phương pháp của laemmh (1970) SDS – PAGE được thực hiện trên một tấm Gel đặc quánh chứa 8% (W/v) polyacrylamide Theo phương pháp của Davis (1964), PAGE tự nhiên được thực hiện trong chất Gel đặc quánh chứa 8% (W/v) polyacrylamide với bộ đệm Tris/Glyxin, độ Ph = 8.3.

Theo mô tả của Heusen và Dowdle (1980): protein được phát hiện có màu bạc việc nghiên cứu Gel genlatin được thực hiện trong một tấm Gel đặc quánh polyacrylamide chứa SDS và genlatin (0.1%) như một chất được trùng hợp hóa (như sự mô tả của Heusen

và Dowdle) Sau khi điện di chất Gel đặc quánh sẽ được làm trong Triton X – 100 (2.5% v/v) trong 1 giờ ở nhiệt độ 40C để loại SDS và được ủ trong 0.05M bộ đệm Tris – HCl, độ

Ph = 9 trong 5 giờ ở nhiệt độ 500C Sau đó chúng được nhuộm màu xanh Coomass rực rỡ

Nhóm những phần hoạt động được quan sát như một vùng genlatin không màu,trong suốt nỗi bật trên nền màu xanh

Enzyme được tách rửa như một đường thẳng tuyến tính của 0 – 0.5M NaCl trong cùng một bộ đệm Mỗi phần 3ml được tập hợp lại với tốc độ chảy 30ml/h bằng cách dùng một máy tổng hợp từng phần tự động (máy tổng hợp từng phần LKB 7000

U/tra) Hàm lượng protein của một phần được đọc ở 280nm Những phần protease hoạt động sẽ được tổng hợp, thẩm tách và cô đặc lại bằng phương pháp đông khô và được sử dụng cho những phân tích sâu hơn về sau

Đặc điểm của enzyme protease

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme.

Nhiệt độ tối thích dành cho hoạt độ của chế phẩm protease được xác định bằng thí nghiệm nuôi cấy enzyme ở những nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 40 đến 100 trong môi trường dung dịch đệm 50mM Tri-HCl trong thời gian 30 phút.khả năng chịu nhiệt của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi cấy trong môi trường có cùng dung dịch đệm,trong 30 phút, ở các nhiệt độ khác nhau (40-100 o C)

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme.

Ảnh hưởng của ph đến hoạt tính của enzyme protease được xác dịnh bằng phương pháp nuôi cấy enzyme tại 40 trong 30 phút tại các giá trị ph khác nhau

để làm môi trường nuôi cấy người ta sử dụng các hệ đệm (nồng độ 0.05) sau:phosphate (ph 5.0-7.0),Tri-Hcl (ph 8.0-10.0) và glycine-NaOH (ph 11-12) hoạt động của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi cấy trong 30 phút,trong các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau (5.0-12.0) tại 40 o C

Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế hoạt tính của enzyme.

Ảnh hưởng của các ion kim loại như: Ca 2+ , Na 2+ , Hg 2+ và EDTA được khảo sát khi trộn chúng lại thành một lượng 5mM và ủ ở nhiệt độ 40 o C,thời gian 30 phút dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.Sự ảnh hưởng của 2mM chất ức chế protease khác nhau như: phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF),ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), 2-mercaptoethanol và idoacetate được xác định bằng phương pháp nuôi cấy enzyme trong 30 phút ở 40 o C trước khi thêm chất nền.Hoạt động liên quan được xác định dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm

Tính chất đặc trưng của chất nền Hoạt tính của protease với chất nền protein khác như: casein, Azocasein, BSA, Egg albumin và Galatin được phân tích bởi sự pha trộn 10µg Của enzyme và 200µl của phép phân tích hệ đệm có chứa chất nền (2mg /ml) Phản ứng của hỗn hợp được xảy ra

ở 40oC trong 30 phút dưới điều kiện chuẩn của phép phân tích

Độ bền của chất tẩy rửa.

Chất tẩy rửa được pha loãng đến nồng độ 8mg/ml phù hợp với điều kiện tẩy rửa của Phadtare và cộng sự (1993) Sự tương thích của protease được kiểm tra với các chất tẩy rửa trong nghành thương mại đó là: ariel, Surf Excel, Tide và Hekô Chế phẩm protease có nồng độ 0,04mg/ ml được ủ ở 60 o C trong những chất tẩy rửa thương mại khác nhau với mỗi giai đoạn là 60 phút Trong khoảng

10 phút thì hoạt tính của protease được xác định Không phải chất tẩy rửa nào cũng được ủ ở cùng điều kiện

Kiểm tra việc tẩy rửa với protease đã được chuẩn bị

Hiệu qủa của chế phẩm protease (3,000U/ml) được xem xét bởi sự pha trộn với chất tẩy rửa thương mại như Wheel và nó được sử dụng trong loại vải cotton trắng cỡ (4 × 4cm) được nhuộm với màu đỏ máu.

Chúng được ngâm trong: (a) nước cất 100ml, (b) 100ml nước cất + 1ml chất tẩy rửa có nồng độ 7mg/ml, + ml enzyme hoà tan Sau đó mẫu được ủ ở 60 o C trong 15 phút và được rửa bằng nước sạch một cách kĩ lưỡng với nước cất và được sấy khô Xem xét kĩ bằng mắt những mẫu khác nhau đã làm.

Những kết quả và thảo luận.

Khuẩn que Laterosporus –AK1 cho thấy sự phát triển cực đại và sự sản xuất enzyme lớn nhất trong 36 giờ Khi cho vào môi trường

trung gian ở nhiệt độ phòng Vi khuẩn này

có mặt trong khu vực thuỷ phân trong môi trường trung gian thạch sữa.

Sự tinh chế protease ngoại bào của B Laterosporus- AK1.

Tóm tắt các bước tinh chế tiếp theo của protease kiềm t hời gian ủ bệnh

từ B laterosposus- AK1 Fig1:Thời gian xảy ra của quá trình sản xuất proteaseFig1:Thời gian xảy ra của quá trình sản xuất protease

và được thể hiện ở bảng dưới quá trình phát triển của B laterosporus

.

Bảng 1 Tóm tắt qúa trình tinh chế của protease kiềm từ B Laterosporus- Bảng 1 Tóm tắt qúa trình tinh chế của protease kiềm từ B Laterosporus-

3 Sephadex 200 17840 32 557,6 7,7 55,0

4 DEAE cellulose 11145 14 796,0 11,1 34,3

Xấp xỉ 11,1 folds của sự tinh chế được thực hiện từ sự nuôi cấy vi khuẩn ban đầu với mức cuối cùng là 34,4% Độ hoạt động đặc trưng của chế phẩm enzyme là 796 U/mg

SDS-PAGE của chế phẩm protease từ B AK1.

Chế phẩm protease được biểu hiện bằng một vạch đơn xuyên qua PAGE là dấu hiệu của sự chuẩn bị đồng nhất Khối lượng phân tử của protease được xác định bởi sự so sánh khoảng di chuyển với mốc chuẩn.Khối lượng phân

SDS-tử của protease bằng 86,29 Kda vầ việc nghiên cứum hoạt động tạo màucũng đã phát hiện một phần thuỷ phân hoàn toàn của hoạt động phân giải lại protein trên nền màu xanh.(fig2) Tuy nhiên Nagano và To (2000) báo cáo rằng có một collagenolytic từ B FS2 có phân tử khối 125 KDa

Fig2: Fig2 : SDS- PAGE và việc nghiên cứu của chế phẩm protease Vạch1: chế phẩm protease

Vạch 2: phân tử khối chuẩn Vạch 3:nghiên cứu hoạt tính chế phẩmenzyme

Fujiwara và Yamamoto, 1987) Protease bền trong khoảng rộng từ 55 o C-80 o C, nhưng nhanh chóng giảm ở nhiệt độ cao hơn, độ bền này cao hơn một ít

so với protease kiềm tính TheoKahayashi nhiệt độ ( o C)

và cộng sự : một protease kiềm tính từ Fig3 Fig3 Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau

BacilusspKSM- K16 đên độ hoạt động và độ bền của protease

thể hiện độ bền ở 50 o C.

là10,0 – 10,5, protease tương đối bền trong khoảng

pH :7,0- 12,0.Enzyme thô thể hiện độ hoạt động tương đối giống với chế phẩm enzyme độ pH khi nhìn ở khía cạnh pH Fig 4: Ảnh hưởng của pH khác nhau lên độ hoạt động và độ bền của

protease

Tác động của ion kim loại và những chất ức chế.

Hầu hết các ion kim loại được thử nghiệm có tác động kích thích hoặc tác động ức chế nhẹ lên hoạt động của enzyme Những ion kim loại như Ca2+ , Mg2+ làm tăng và làm ổn định hoạt động của protease Điều này xảy ra được là nhờ sự kích thích hoạt động của các ion kim loại này Ngược lại những ion kim loại khác như: Na2+, Mg2+ và EDTA ức chế nhẹ đến độ hoạt động của enzyme.Những cation làm tăng tính bền nhiệt của protease thu được từ khuẩn que Những kết quả này chỉ ra rằng những ion kim loại bảo vệ enzyme chống lại sự biến tính do nhiệt và đóng một vai trò thiết yếu trog việc duy trì hoạt động ổn định của enzyme ở nhiệt độ cao.( Pan và Lin; Steele và cộng sư 1992 )

Nghiên cứu sự ức chế mang lại những hiểu biết sâu sắc

về bản chất của enzyme, về những điều kiện cần thiết Ion kim loại nồng độ tỉ lệ hoạt động

và chất ức chế của enzyme

của nhóm ngoại và về bảnchất của trung tâm hoạt động Trong những chất ức chế khác nhau thì iodoacetate gây

ức chế mạnh nhất đến độ hoạt động của enzyme

Kế đến là 2-mercaptoethanol và EDTA (bảng 2)

Tuy nhiên PMSM cũng gây ức chế hoàn toàn

Sự hoạt động của enzyme, nó đặc trưng cho hệ Enzyme- cơ chất Serin protease Điều này đã được nhận xét bởi Adinrayana và Ellaiah(2003) , North (1982), Uchida và cộng sự (2004).

Sự thuỷ phân của chất nền protein

Chất nền đặc trưng của protease được tìm thấy với số lượng lớn khi casein được sử dụng làm chất nền Tiếp theo là Azocasein (85%), albumin của trứng (58%), BAS (52%) và gelatin (22%) tương ứng.Tương tự protease kiềm thu được từ

B stearothermophilus F1 và Bcillus sp K5M-K16 được công bố từ độ hoạt động cao nhất về casein (theo Kobayashi và cộng sự 1995 ).