LÊN MEN ETHANOL TRONG HỆ THỐNG IMMOBILIZED CELL REACTOR (ICR) BẰNG SACCHAROMYCES CEREVIASIAE

Tế bào vi sinh vật cố định được sử dụng trong các phản ứng enzyme khác nhau,chúng có thể thực hiện từng phản ứng xúc tác riêng biệt hoặc hệ thống các phản ứngenzyme, bao gồm các phản ứng

Chương 1:

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với nhu cầu phát triển của xã hội ngày càng cao Đòi hỏi sự đáp ứng vậtchất nhu cầu phải được đầy đủ… để có những đáp ứng vật chất này thì đòi hỏi cần cónguồn năng lượng để sản xuất Trong khi đó, nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạnkiệt không thể tái sinh… Do vậy, chúng ta phải tìm những nguồn năng lượng khác đểthay thế phục vụ cho sản xuất và nhu cầu đời sống của xã hội Để giảm bớt nguồn nhiênliệu từ hóa thạch, chúng ta phải sử dụng nguồn năng lượng khác có thể tái sinh, tiện lợi và

an toàn (Chum và Overend,2001)

Các nguồn năng lượng thì rất nhiều như năng lượng gió, năng lượng mặt trời, nănglượng thủy điện….trong mỗi lĩnh vực thì có những nghiên cứu và thành công nhất định cơbản Với yêu cầu trong môn học thì ta chú ý đến lĩnh vực tạo nguồn nhiên liệu để cungcấp năng lượng bằng con đường sinh học Mà trong đó vi sinh vật sản xuất ethanol đượcchú ý và được xem như là nguồn nhiên liệu cho tương lai khi mà nguồn nhiên liệu hóa

thạch ngày càng cạn kiệt Vài vi sinh vật Clostridium sp….mà sự hiểu biết tốt nhất là về nấm men sản xuất ethanol Saccharomyces cerevisiae và Zymomonas mobilis được chú ý

để cho sản xuất ethanol (Flickinger và drew, 1999: Gunasekaran và Raj, 2001)

Trong con đường tạo năng lượng bằng con đường sinh học chủ yếu là quá trình lên men,lên men có thể liên tục, bán liên tục và theo mẻ Hiện nay, ta chú ý nguồn năng lượngethanol là chủ yếu

Quá trình lên men theo mẻ của S cerevisiae có những ảnh hưởng bởi những thông

số khác nhau về tỷ lệ sinh trưởng hay có sự ức chế của sản phẩm hoặc là ức chế của cơ

chất Quá trình lên men của S cerevisiae có những điều kiện tối ưu riêng.

Từ những yều cầu trên chúng ta cần có những đề tài về nghiên cứu sản xuấtethanol sao cho có năng suất cao và hiệu quả nhất

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Biofuel

Nhiên liệu sinh học (còn được gọi là nhiên liệu từ nông nghiệp – agrofuel) theođịnh nghĩa rộng là những nhiên liệu rắn, lỏng hay khí được chuyển hóa từ sinh khối Tuynhiên, phần này chỉ đề cầp chính đến nhiên liệu sinh học dạng lỏng được sản xuất từ sinhkhối

Nói chung, nhiên liệu sinh học mang lại những lợi ích sau: Giảm khí thải nhà kính,giảm gánh nặng lên nhiên liệu hóa thạch, tăng sự an toàn về năng lượng quốc gia, gópphần phát triển nông thôn và là một nguồn năng lượng bền vững trong tương lai Ngượclại, nhiên liệu sinh học cũng có một số hạn chế: nguồn nguyên liệu phải được tái tạonhanh, công nghệ sản xuất phải được thiết kế và tiến hành sao cho cung cấp lượng nhiênliệu lớn nhất với giá thấp nhất và mang lại lợi ích về môi trường nhất Nhiên liệu sinh học

và những dạng nhiên liệu tái tạo khác nhắm đến tính chất trung tính về carbon Điều này

có nghĩa là carbon được thải ra trong quá trình đốt cháy nhiên liệu để cung cấp nănglượng vận chuyển hay sinh điện năng được tái hấp thụ và cân bằng với lượng carbon hấpthụ bởi cây cối Những cây này sau đó lại được thu hoạch để tiếp tục sản xuất nhiên liệu.Những nhiên liệu trung tính về carbon không gây ra sự tăng carbon trong khí quyển, vìthế không góp phần vào hiệu ứng trái đất nóng lên Sau đây là một số các loại nhiên liệusinh học thế hệ đầu tiên theo phân loại của tự điển bách khoa toàn thư trực tuyếnWikipedia.org:

 Dầu thực vật: Dầu thực vật có thể dùng để làm nhiên liệu sử dụng cho rất nhiềunhững loại động cơ diesel đời cũ, và chỉ ở điều kiện khí hậu ấm áp Trong đa sốtrường hợp, dầu thực vật được sử dụng để sản xuất biodiesel

 Biodiesel: Được sản xuất từ dầu hoặc chất béo qua quá trình tranesterification và làmột chất lỏng giống như diesel từ dầu mỏ

 Bioalcohols: Là những rượu được sản xuất từ quá trình lên men sinh học

 Bioalcohols phổ biến là ethanol, rồi đến propanol và butanol

 Biogas: Biogas được sinh ra từ quá trình tiêu hủy kỵ khí các chất hữu cơ bởi các visinh vật kỵ khí Sản phẩm phụ dạng rắn từ quá trình này có thể được sử dụng làm

nhiên liệu hoặc phân bón Biogas chứa chủ yếu là methane Nhiên liệu sinh họcdạng rắn: Ví dụ như: gỗ, than hoặc phân khô.

Cũng theo tự điển Wikipedia.org, nhiên liệu sinh học thế hệ thứ 2 bao gồm:

 BioHydrogen: Là khí Hydro được sản xuất từ nguồn nguyên liệu sinh khối.BioHydrogen được dùng trong pin nhiên liệu (fuel cell)

 DMF: Được sản xuất DMF từ fructose và glucose sử dụng công nghệ sinh nhiên liệu lỏng có xúc tác

khối- Bio-DME: Là DME được sản xuất từ biomethanol qua quá trình dehydration cóxúc tác, được sử dụng trong động cơ khí nén

 Biomethanol: Methanol được sản xuất từ sinh khối, có thể được pha vào dầu đến10-20% mà không làm thay đổi tính chất cơ bản của dầu

Để đảm bảo an ninh năng lượng bảo vệ môi trường phát triển bền vững, nhiềuquốc gia và các tổ chức quốc tế trong vài thập kỉ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụngnhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch, tiến tới xây dựng ngành

“nhiên liệu sạch” ở quốc gia mình Các nước đã có thành công nghiên cứu và sử dụngnhiên liệu sinh học là Brazil, Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu có Anh, Pháp, Đức, Tây BanNha, Bỉ, Áo…Châu Á có Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Sở dĩ nhiều nước đẩynhanh chương trình nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học vì đã cam kết thực hiệnnghị định Kyoto về cắt giảm khí nhà kính và để đảm bảo an ninh năng lượng khi nguồndầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần cuối thế kỷ này

2.2 Ethanol nhiên liệu

2.2.1 Lịch sử ethanol nhiên liệu

Nguyên mẫu đầu tiên của động cơ đốt trong được đưa ra bởi Samuel Morey USA

1826 Điều này được xem là sự bắt đầu của động cơ gasoline nhưng thực tế ông sử dụngethanol để cấp nguồn năng lượng cho động cơ Năm 1908, Henry Ford xây dựng mô hìnhnổi tiếng về xe ô tô chạy bằng ethanol Cuối cùng, công nghiệp dầu mỏ “chiến thắng”trong sự cạnh tranh với ethanol Sự thúc đẩy “thương mại hóa” ethanol trong giao thôngvận tải phát triển trong suốt thập niên 1970 Cuộc khủng hoảng dầu mỏ vào năm 1973 và

trở nên có giá trị Tại thời điểm này, cơ quan bảo vệ môi trường (EPA) đã tìm kiếm mộtchất thay thế cho chì trong gasoline để gia tăng chỉ số octane Ethanol sớm thiết lập mộtchỗ đứng vững mạnh trong việc gia tăng chỉ số octane Một động cơ khác thúc đẩy côngnghệ sản xuất ethanol ở Mỹ trong suốt những năm 80, đó là khi giá bắp hạ thấp Các nhàlập pháp Mỹ xem ethanol từ bắp là một phương tiện để ổn định thu nhập của nôngnghiệp.

2.2.2 Ứng dụng của ethanol nhiên liệu

Gasohol còn gọi là xăng sinh học được chế tạo từ hỗn hợp ethanol khan 99,5% phaxăng tỷ lệ 5, 10, 20 hoặc 40% ethanol khan, với hỗn hợp ethanol trong gasohol khoảng10-20% thì không cần cải tạo động cơ Khi xem xét ứng dụng hiện nay của bioethanol,hiển nhiên cần bắt đầu từ Brazil Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theoquy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhậpkhẩu Lệnh cấm vận dầu mỏ của Trung Đông đã bắt buộc Brazil phải tìm kiếm nhữngnhững nguồn nhiên liệu vững bền hơn cho nhu cầu năng lượng của đất nước Tuy rằng cónhững vấn đề nảy sinh, nhưng chương trình này của Brazil được xem như một mô hìnhthành công trong việc phát triển bền vững Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụngxăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (cóthể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu)

Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía Trong mô hình này, mỗi tấn míacho năng suất 72 lít ethanol Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng,hoặc dùng làm ethanol nhiên liệu tinh Rõ ràng con số này cho thấy có rất nhiều thànhphần không được sử dụng trong quá trình chuyển hóa biomass thành ethanol Hầu hếtnhững thành phần này là hemicellulose và cellulose Nước Mỹ đang bám theo Brazil vàđầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng cópha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm tăng tỉ số này Đa phần mọi phương tiện bán ở

Mỹ đều phải có động cơ linh hoạt về nhiên liệu Liên minh Châu Âu cũng đã tiến đến việckhuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụngphương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành viên Trong tương lai, Colombia bắtbuộc những thành phố có dân số trên 500.000 dân phải bán xăng có pha 10% ethanol ỞVenezuela, công ty dầu quốc gia đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía

trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10%ethanol) Chính phủ Canada nhắm đến việc 45% xăng trong cả nước có pha 10% ethanolvào năm 2010 Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho việc sử dụng xăng pha10% ethanol bắt đầu từ 2007 Ở Ấn Độ, một chương trình bioethanol đã kêu gọi ngườidân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới việc sử dụng xăng E10 và E20.

2.3 Tình hình ethanol nhiên liệu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu Phầnđông ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp.Tổng cộng năng suất là 25 triệu Lit/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000Lit/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu BìnhTây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 – 5000 Lit/ngày Cho đến thời điểm này, ethanolnhiên liệu vẫn chưa được tiêu thụ trên thị trường Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứuđược thực hiện trong lĩnh vực này Điển hình là sự hợp tác giữa Công ty rượu Bình Tây,Saigon Petro và Công ty Nguyễn Chí từ năm 2005 Các doanh nghiệp này đã triễn khai

5 đề tài: gasohol từ cồn công nghiệp (cồn 96%), gasohol từ cồn khan (cồn 99,5%), đầu tưnhà máy sản xuất gasohol, đầu tư nhà máy sản xuất cồn công nghiệp, đầu tư nhà máy sảnxuất cồn khan Tất cả nhằm mục đích đưa xăng sinh học với tỉ lệ 10-12% vào thị trườngnăng lượng

2.4 Triển vọng ethanol tương lai

Cần có những nghiên cứu để tăng hiệu quả của bioethanol cũng như của quá trìnhchuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững để thay thế xăng dầu Điều này có lienquan đến việc giảm chi phí chuyển hóa, tăng năng suất và tăng sự đa dạng của các nguồnnguyên liệu có thể sử dụng Hướng đi cho những nghiên cứu để phát triển và cải tiếnbioethanol là tìm những phương pháp chuyển hóa hemicellulose thành đường để lên men.Một khía cạnh rất thú vị, và cũng được nghiên cứu trong đề tài này, là quá trình đườnghóa và lên men đồng thời (SSF) Những phương pháp hiện nay có thể đạt được hiệu suất

50 – 72% ethanol cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của nấmmen đối với ethanol Điều này dẫn đến hướng khả thi nghiên cứu những chủng nấm men

ở việc phát triển những giống vi sinh vật khác có khả năng chuyển hóa cellulose và lignintạo thành đường và lên men ethanol.

2.5 Cố định tế bào

2.5.1 Các đặt tính của sự cố định

Sự cố định tế bào sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào sinh vật vàopha riêng biệt tách khỏi pha tự do của dung dịch nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất vớicác phân tử cơ chất có mặt trong pha tự do nói trên Pha chứa tế bào thông thường khôngtan trong nước và là polymer cao phân tử có tính ưa nước hoặc hệ thống của chúng

Tế bào vi sinh vật cố định được sử dụng trong các phản ứng enzyme khác nhau,chúng có thể thực hiện từng phản ứng xúc tác riêng biệt hoặc hệ thống các phản ứngenzyme, bao gồm các phản ứng liên kết tương hỗ với nhau, trong đó một phản ứng nàyđảm bảo cho diễn biến của phản ứng khác Các tế bào sinh vật cố định có phổ hoạt độngrộng hơn và các quá trình do tế bào sinh vật cố định thực hiện thông thường rẻ hơn so vớiquá trình tương ứng do enzyme cố định thực hiện

Phương pháp cố định tế bào phải đơn giản, độ lặp lại lớn, không gây biến tính,phải cho phép dễ dàng kiểm soát được số lượng tế bào cố định và các tế bào không bị rửatrôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng hoặc bảo quản

Sự cố định tế bào, enzym hay chất xúc tác đã được nghiên cứu rộng trong suốt 20năm qua do sự tiềm ẩn ngày càng tăng trong các lĩnh vực rộng lớn, bao gồm cả y học,thực phẩm, nông hoá học, môi trường, lưu trữ tế bào, các xúc tác phản ứng hoá học Sựcần thiết là tìm một chất nền có khả năng chịu được áp lực cao, môi trường nuôi cấy hoặcnhững ức chế môi trường khác thường không tương thích với khả năng của tế bào Thí dụ,hầu hết những phương pháp cố định tế bào dựa trên liên kết ngang các chất nền và do đóliên quan đến các gốc hoặc các dung môi hữu cơ, là bất lợi cho các tế bào và do đó khôngthích hợp cho các ứng dụng y học hoặc thực phẩm Mặc khác, dù chất đa điện ly như gelalginete Ca là không độc cho tế bào và do đó phù hợp cho việc cố định tế bào, chúng cósẵn chất ổn định là hợp chất Ca2+ hay các cation hoá trị 1 do đó làm cản trở trong việc ứngdụng Thêm vào đó, khi nuôi cấy vi khuẩn ở mật độ cao đòi hỏi các tế bào được cố địnhtrong các hạt với đường kính hạt nhỏ hơn 300µm để duy trì nồng độ oxy đi qua khối gel

Công nghệ tế bào cố định đã được áp dụng rộng rãi trong một loạt các nghiên cứu ứng dụng và công nghiệp Dùng vi khuẩn acid lactic đã được cố định khi bắt đầu nuôi cấytrong công nghiệp chăn nuôi bò sữa là một trong những ứng dụng tiềm năng Nhiều kỹthuật cố định đã mô tả bẫy tế bào trong polymer tổng hợp và tự nhiên là một trong nhữngphương pháp là phổ biến nhất vì dễ dàng và đơn giản hơn, chi phí xây dựng thấp và cácđiều kiện duy trì của tế bào mang tính khả thi cao… Một chất liệu tạo thành gel phổ biến

là alginate mà là một polysaccharide dị hình tuyến tính với lượng dư acid D-mannuronic

và L-guluronic Na alginate ion hoá liên kết ngang với các cation đa hoá trị (tiêu biểu

tế bào và nơi mà nó ức chế sản phẩm Vi sinh vật thay thế có thể phá vỡ chất mang gel vàhạn chế sự khuếch tán bên trong và bên ngoài lớp gel và gây ra sự tích luỹ sản phẩm tiếpgiáp với các tế bào Sự bất lợi của việc hao hụt hay giảm nồng độ trong suốt quá trình lênmen lactic là do sự thay thế của ion Ca2+ bằng ion lactate từ các hạt alginate

Trong số những phương pháp cố định, bẫy tế bào trong polymer sinh học thườngdùng κ-carrageenan hay Ca-alginate như chất mang Lợi thế chính của cố định gel là khảnăng tương thích; mặc dù đưa vào tỷ lệ lớn là khó khăn, các hạt thường thấm qua các tếbào, những hạn chế khối lượng chuyển giao thường gặp phải và khối lượng chiếm đóngcủa lò phản ứng hạt nói chung là đáng kể Cuối cùng gel alginate chứa vi khuẩn acidlactic có xu hướng bị hoá lỏng bởi acid lactic

Có một số báo cáo về quá trình lên men axit lactic sử dụng vi khuẩn cố định

Sự cố định làm vi khuẩn có thể duy trì các tế bào ở trạng thái ổn định và có sức sống vàcung ứng cho quá trình lên men liên tục Trong tự nhiên các vi sinh vật đó ở trạng thái cốđịnh sẽ được thử pH khác nhau, nồng độ sản phẩm trong môi trường so sánh trực tiếp với

ảnh hưởng toàn bộ quá trình xử lý Vì vậy, thông tin về sinh lý của vi sinh vật trong việcthay đổi môi trường là điều kiện tiên quyết cần thiết để vận hành quá trình lên men trongđiều kiện tối ưu.

Cố định thường được thực hiện bằng cách sử dụng một gel phân tử trùng hợp cókhả năng hút nước cao như alginate, agarose… Trong trường hợp đó, các tế bào được cốđịnh bẫy trong gel thích hợp qua một quá trình tạo giọt So với lên men truyền thống thì

vi khuẩn biến đổi khi sử dụng sự cố định tế bào, năng suất thu được trong lần sau thì caohơn đáng kể, rõ ràng một phần do mật độ tế bào cao và các lỗ hổng cố định đem lại hay

có sự thay đổi di truyền Tuy nhiên, một vài thông số quan trọng như chi phí của sự cốđịnh, các giới hạn chuyển đổi khối lượng, tính có thể ứng dụng được đến sản phẩm cuốiđặt trưng… được xem xét một cách cẩn thận trước khi chọn bất kỳ phương pháp cụ thểnào

Những hệ thống cố định yêu cầu sự lựa chọn một phương pháp cố định mà phươngpháp đó sẽ giới hạn lỗ hở tế bào Trong số những phương pháp cố định khác, có sự hỗ trợchất rắn (polyarylamide, gốm, non-woven các sợi vải hay các hạt thuỷ tinh lỗ lớn) haybẫy gel (trong alginate hoặc carrageenan) đã được dùng Mặt hạn chế chính của sự cốđịnh gel là độ bền cơ học của các hạt thấp, điều đó giới hạn thời gian làm việc Các ionhoá trị 3 đã được đưa vào và được dùng như các tác nhân gắn kết với mục đích cải tiến độbền cơ học của các hạt Mặt khác, nồng độ gel cao cũng cải thiện được sự ổn định hạtngay cả khi xuất hiện những hạn chế về khuếch tán

Việc dùng phương pháp cố định toàn bộ các tế bào vi khuẩn hoặc loại bỏ các bàoquan thường tẻ nhạt, tốn thời gian và đắt tiền cho các bước bao gồm sự phân lập và tinhsạch của các enzym nội bào Nó cũng có xu hướng tăng cường sự ổn định của các enzymbằng cách giữ lại xung quanh nó xúc tác tự nhiên trong suốt quá trình cố định và vận hànhliên tục Dễ dàng chuyển quá trình xử lý từng đợt thành kiểu liên tục và duy trì mật độ tếbào cao mà không dùng các điều kiện wash-out ngay cả khi ở tỉ lệ pha loãng rất cao, làmột vài trong nhiều lợi thế của các hệ thống tế bào được cố định Metabolically tích cực

cố định tế bào là ưu tiên đặc biệt, nơi mà các co-factor cần thiết cho các phản ứng xúc tác.Khi cơ cấu co-factor phục hồi thì chức năng của tế bào đầy đủ, nguồn cung cấp từ bênngoài không có hiệu quả

Sử dụng kỹ thuật cố định tế bào để cải tiến quá trình lên men acid lacic đã được

thử qua vài nghiên cứu Lactobacillus helveticus, Streptococcus salivarius, L delbrueckii subsp Bulgaricus, L casei, Rhizopus oryzae, và Pedioccus halophilus là

những vi sinh vật quan trọng được dùng cho việc sản sinh ra acid lactic bằng cách cố định

tế bào Giống như vi khuẩn lên men khác, bẫy trong Ca-alginate hay κ-carrageenan làphương pháp cố định được cho phép rộng rãi Khi nhiều nhà nghiên cứu báo cáo sự haohụt và giảm cường độ cơ học của các hạt alginate trong suốt quá trình lên men acid lactic.Một vài nghiên cứu đã thực hiện việc sử dụng hỗn hợp gel trên cho các vi sinh vật sảnsinh acid lactic khác nhau Khuôn hỗn hợp gel κ-carrageenan locust bean gum- cho thấy

sự ổn định đáng kể trong 3 tháng trong bồn phản ứng dạng khuyấy lên men liên tục

Trong một nghiên cứu khác đã so sánh thực hiện cố định tế bào L.casei bằng alginate

trong bồn phản ứng dạng khuấy và bồn phản ứng packed-bed Sử dụng glucose năng suấtđạt 1.6g/l/h trong bồn phản ứng dạng khuấy Một phương pháp khác chiết acid lactic lênmen cố định tế bào đã được đưa ra, vì sản phẩm cố định có thể loại trừ bằng cách dùngnhựa hấp phụ acid lactic, phương pháp này tạo năng suất cao hơn khi lên men liên tụcsinh học phân tử

2.5.2 Ích lợi của sự cố định

Quá trình cố định dường như chủ yếu ích lợi về mặt kinh tế như:

 Các quá trình liên tục và dễ kiểm soát

 Các sản phẩm được tách ra một cách dễ dàng

 Vấn đề thải và xử lý vật liệu được giảm thiểu

 Cung cấp sản phẩm tinh khiết hơn, ít sản phẩm ức chế

 Sự ổn định pH và nhiệt tốt hơn

 Vận hành liên tục

 Tính linh hoạt cao hơn trong thiết kế bồn phản ứng

Bên cạnh những lợi ích trên trong công nghiệp sản xuất còn có những hạn chế sau:

 Còn mang dáng dấp của truyền thống

 Cần đầu tư vào thiết bị mới phục vụ cho việc nuôi cấy

 Tính chất, chi phí hỗ trợ cố định và quá trình cố định (bao gồm cả thiệt hại củahoạt động.)

Hiệu suất của hệ thống

2.5.3 Các loại chất mang dùng cố định vi sinh vật

Chất mang dùng cố định tế bào chia làm hai loại: chất mang hữu cơ và chất mang

vô cơ

2.5.3.1 Phân loại chất mang

Chất mang hữu cơ: gồm chất mang hữu cơ tự nhiên và tổng hợp

Chất mang hữu cơ tự nhiên

Chất mang là polysaccharide: là nhóm chất mang đang được sử dụng rộng rãi

hiện nay, bao gồm cellulose, agarose, alginate, carrageenan, chitin, chitosan và các dẫnxuất của chúng

Carrageenan

Được lấy từ tảo biển đỏ Nó sẽ bị chảy ra khi đốt nóng và đông lại khi làm lạnh.Vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 để nhốt tế bào Tuy nhiên vật liệu này

có nhược điểm là gel không ổn định trong môi trường có phosphate

Chitin và dẫn xuất của chitin (chitosan)

Chitin là polymer rất phổ biến trong tự nhiên, có cấu tạo tương tự cellulose Chitin

và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo mạng, tạo hạt, có khả năng hấp phụ tốt, tính chất cơ

lý bền vững, dùng để nhốt tế bào trong khuôn gel khi xử lý với glutaraldehyde haysodiumtripolyphosphate… Tuy nhiên chúng có nhược điểm là độ trương kém, diện tích

bề mặt tiếp xúc nhỏ Để khăc phục nhược điểm này, người ta ghép các copolymer với cácmonomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid, hydroxyethylacrylate nhằm cải thiệnnhững nhược điểm trên

Chất mang là protein: các chất thường dùng là collagen, gelatin, keratin… Vật

liệu này sử dụng tạo khuôn gel nhốt tế bào với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde.Nhưng nhóm chất mang này thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn

Chất mang hữu cơ tổng hợp

Có các loại polymer tổng hợp được sử dụng như polyacrylamide, polyester,polyvinylacetate, polyacrylic… Ưu điểm của loại này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàntrơ với sự tấn công của vi sinh vật, độ trương tốt và đặc biệt có thể điều chỉnh được kíchthước chất mang để nâng cao hiệu quả quá trình cố định Bên cạnh đó, còn có nhữngnhược điểm như giá thành vật liệu cao, sự tương hợp sinh học kém, và vì là tổng hợp hữu

cơ nên khó phân hủy trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường, nhất là trong công nghệ sảnxuất polymer

Chất mang vô cơ

Chất mang vô cơ tự nhiên: than hoạt tính, cát, zeolit, silicat.

Chất mang vô cơ tổng hợp: silicat, silicagel, Al2O3, TiO2, ceramic, sợi bông thủytinh

Các loại chất mang này có cấu trúc lỗ xốp và có thể điều chỉnh đuợc, khả năng hấpphụ tốt Nhưng một số chất mang vô cơ như thủy tinh xốp, silicagel, silochrom đều phảitrải qua giai đoạn xử lý bề mặt trước khi đưa vào cố định tế bào để đảm bảo độ bền, độchọn lọc và độ hấp thu tốt

Mỗi loại chất mang đều có ưu nhược điểm nhất định Vì vậy, tùy thuộc vàophương pháp cố định mà ta sẽ chọn loại chất mang phù hợp để cho hiệu quả tốt nhất

Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển tạo ra nhiều loại vật liệu mới làm chất mang thíchhợp trong việc cố định tế bào vi sinh vật cũng như chất xúc tác sinh học khác.

bó liên kết lại thành các dải Các dải có chiều dày 3-4 nm, chiều rộng 70-80 nm

Trong khi kích thước của cellulose vi khuẩn nhỏ rất nhiều so với cellulose thực vật(khoảng 1/100 lần) Ngoài ra BC còn khác PC về chỉ số kết chặt, mức độ polymer hóa(thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000-6000); có vài trường hợp đạt tới 16000-

20000, trong khi PC là 13000-14000

Cấu trúc cellulose vi khuẩn thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy: nuôi cấy tĩnh hay lắc Khi nuôi cấy tĩnh, cellulose vi khuẩn thu được ở dạng màng keo có độ kết lớp chặt chẽ Khi nuôi cấy lắc, cellulose vi khuẩn thu được ở dạng huyền phù phân tán tạo thành dạng hạt nhỏ, hình sao, sợi dài Bên cạnh điều kiện nuôi cấy thì cấu trúc BC còn phụ thuộc vào từng dòng vi khuẩn

Hình: so sánh đường kính sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và nhân tạo

b Tính chất

 BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao so với các dạng cellulose khác, khôngchứa lignin và hemicellulose BC có thể bị phân hủy hoàn toàn

 Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao

 Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt: trong điều kiện ngậpnước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose

 Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

 Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt

 Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản phẩmmong muốn không cần qua bước trung gian Chẳng hạn như sản xuất giấy khôngcần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ Đặc biệt là vi khuẩn cóthể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ Trong cấu trúc BC thuđược trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng tạonên chặt chẽ hơn

2.5.4 Các phương pháp cố định vi sinh vật

2.5.4.1 Khái niệm

Cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị lạitrong một khu vực không gian nhất định sao cho các tế bào đó giữ được tính chất xúc tácsinh học của chúng và có thể sử dụng lại nhiều lần.

Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn tế bàovào chất mang không hòa tan trong nước Tế bào sau khi được cố định có thể sử dụngđược nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và ta có thể chủ động ngừng phản ứng theo ýmuốn

Người ta phân biệt các phương pháp cố định tế bào cơ thể vi sinh vật theo 3 dạng:hoá học, vật lý và cơ học Phương pháp hoá học dựa trên sự tạo thành các liên kết hoá trịgiữa các chất mang được hoạt hoá thông qua các nhóm hoạt động của amino acid và cácchất khác có mặt trong vách tế bào với các chất hai chức năng như glutaradehyde Phươngpháp vật ký bao gồm các quá trình sắp xếp phân đoạn hay hấp thụ Còn quá trình gắn tếbào vào các gel, màng sợi… thì được coi là phương pháp cơ học, mặc dầu bản chất của

nó cũng chính là tương tác vật lý và hoá học

2.5.4.2 Phân loại các phương pháp

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều ngànhnhư các ngành công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp, xử lý môi trường… Vì vậy córất nhiều phương pháp khác nhau và vật mang khác nhau được sử dụng để cố định tế bào

Phân loại các phương pháp cố định tế bào dựa trên sơ đồ sau:

Tất cả các phương pháp trên đều có cùng mục đích: giữ được mật độ tế bào caotrong vùng không gian nhất định cũng như trong bình phản ứng sinh học để làm gia tăngkhối lượng sản phẩm.

2.5.4.3 Chuyển hóa vật chất của tế bào cố định

Chất mang có gắn tế bào vi sinh vật được đưa vào bình phản ứng sinh học Cơ chấtđược đưa vào từ đỉnh bình phản ứng, trong bình phản ứng sinh học xảy ra quá trình traođổi chất của vi sinh vật và cơ chất tạo sản phẩm Sản phẩm được lấy ra ở đáy bình là sảnphẩm sạch Quá trình này được thực hiện liên tục

So với tế bào tự do, tế bào cố định có những thuận lợi như: mật độ tế bào cao, khốilượng sản phẩm tăng, rút ngắn thời gian phản ứng, kích thước thiết bị nhỏ gọn, khả năngtái sử dụng nhiều lần

Ngoài ra, trong quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi Ta

có thể sử dụng được nhiều loại cơ chất, quy trình thiết kế đơn giản hơn, chất lượng sảnphẩm đồng đều Hơn nữa, tế bào cố định được bảo vệ không bị ức chế bởi cơ chất và sảnphẩm cuối

Với những thuận lợi trên, ta thấy quá trình lên men sử dụng tế bào cố định xảy ranhanh hơn so với lên men sử dụng tế bào tự do

2.5.4.4 Yêu cầu đối với tế bào vi sinh vật cố định

Tế bào vi sinh vật cố định giống như một tác nhân xúc tác bao gồm: sự mất hoạttính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp nhất, tế bào vi sinh vật cốđịnh phải có khả năng chiếm thể tích riêng của reactor nhiều nhất nhằm làm tăng năngsuất thể tích

Ngoài ra, cơ chất và sản phẩm tạo trong quá trình trao đổi chất của tế bào phải cókhả năng khắc phục được hàng rào cản khuếch tán, đó là chất mang và thành tế bào Tếbào cố định phải bền về mặt cơ học để có thể dễ dàng khuấy trộn trong bình phản ứng

Chất xúc tác (tế bào cố định) phải ổn định trong khoảng nhiệt độ hoạt động của

công nghệ Phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào quá trình trao đổi chấtđặc thù đối với từng cơ thể vi sinh vật

2.5.4.5 Các phương pháp cố định

a Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật lên bề mặt chất mang

Hình: Tế bào vi sinh vật cố định trên bề mặt chất mang.

Phương pháp này dựa trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và chất mangkhông tan trong nước thông qua các liên kết như liên kết cộng hóa trị, liên kết ion, hấpphụ vật lý Vật liệu làm bằng chất mang có chức năng phù hợp để liên kết được với tế bào

vi sinh vật, có độ bền cơ học tốt, ổn định trạng thái lý hóa tốt, không tạo độc tố, ngoài racòn dễ dàng tạo hình dạng phù hợp với loại thiết bị phản ứng

Sau đây là một vài phương pháp hay được dùng nhiều trong thực tế

Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật theo phương pháp này dựa trên liên kết cộnghóa trị giữa bề mặt chất mang đã được hoạt hóa và tế bào vi sinh vật

Lúc này trên bề mặt tế bào tồn tại một số nhóm chức hoạt động như amino,cacboxyl, thiol, hydroxyl, unidazole, phenol của protein đều có khả năng tham gia tạophản ứng liên kết với chất mang

Phương pháp hấp phụ

Đây là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về sự cố định tế bào Hai nhà khoa học

Hattori và Furusaka đã báo cáo về việc gắn những tế bào Escherichia coli lên một cột

nhựa trao đổi ion Tiếp sau đó, nhiều loại tế bào vi sinh vật khác đã được cố định bằngphương pháp hấp phụ trên những giá thể khác như gỗ, đất sét, thủy tinh, chất dẻo…

Phương pháp này tạo nên dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế bào và bềmặt chất mang So với phương pháp liên kết cộng hóa trị, ở phương pháp hấp phụ, tế bào

và chất mang ngoài liên kết cộng hóa trị ra, chúng còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kếtkhác

b Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel

Hình: Tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc gel Các loại gel cơ bản

Có nhiều loại cấu trúc gel cơ bản

Ion gel: khuôn gel được tạo nên bằng cách liên kết ion giữa chất mang đa diện tích

và dung dịch đa diện tích trái dấu Hay nói cách khác ion gel là một loại gel có cấu trúcmạng lưới được hình thành từ những liên kết ion có khả năng phân hủy sinh học, dễ tìmnhưng độ bền cơ học và hóa học kém Loại vật liệu này đòi hỏi phải là chất đa diện tíchnhư chitosan, alginate

Covalent gel: là một loại gel mà cấu trúc mạng lưới của nó được hình thành từ

những phân tử polymer gắn kết với nhau bằng các liên kết cộng hóa trị Một số chất tạocovalent gel là polyacrylamide (polymer tổng hợp được hình thành từ monomeracrylamide) và một số chất vô cơ (gel vô cơ hình thành từ một số oxide như (SiO2)x,(TiO2)x.)

giữa các phân tử polymer, thường là liên kết hydro Các loại chất mang như agar-agar,agarose, carrageenan.

Cryogel: là cấu trúc polymer mới, được tạo nên bằng phương pháp lạnh đông các

tiền polymer có phân tử lượng thấp hoặc cao Dưới điều kiện nhiệt độ thấp, mẫu nguyênliệu sẽ biến đổi và hình thành cấu trúc mới Loại chất mang này khắc phục được tính chấtkém bền nhiệt và không bền trong dung dịch nước so với các loại chất mang khác Việc

cố định tế bào trong cryogel là phương pháp mới nên vật liệu sử dụng chưa nhiều, điểnhình là polyvilyl alcohol

Tóm lại, các chất dùng tạo gel đòi hỏi phải có khả năng tạo gel tốt, đa dạng phù

hợp với kỹ thuật cố định tế bào

Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc ion-gel

Phương pháp này được sử dụng rộng rãi nhất Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinhvật và chất mang đa diện tích được nhỏ vào dung dịch đa diện tích trái dấu để thực hiệnphản ứng tạo mạng lưới gel Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thốngmạng lưới vừa được hình thành Phương pháp này có ưu điểm là lượng tế bào cố định lớn,khả năng sống của tế bào được duy trì, đặc biệt phương pháp này tiến hành trong điềukiện phản ứng ôn hòa, đơn giản, rẻ tiền Tuy nhiên nhược điểm của nó là độ bền hóa học,

cơ học chất mang không cao

Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc covalent gel

Có 2 cách

- Cách 1

Monomer + tế bào vi sinh vật gel polymer chứa tế bào vi sinh vật

- Cách 2

Polymer + tế bào vi sinh vật gel polymer chứa tế bào vi sinh vật

Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non-covalent gel

Polymer hóa

Tạo liên kết giữa

các sợi polymer

Phương pháp này giống phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúccovalent gel nhưng mạng lưới trong cấu trúc gel này được hình thành từ những liên kếtkhác liên kết cộng hóa trị, thường là liên kết hydro.

Trong phương pháp này chất mang carrageenan là chất mang hay được sử dụngnhất, đó là một loại polysaccharide thu từ tảo đỏ, có thể hình thành nhiều loại gel khácnhau ở nhiệt độ thường

Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc cryogel

Cryogel được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp lạnh đông Ở điều kiệnnhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi cứng lại và hình thành cấu trúc mới

Polyvinyl alcohol là loại polymer được sử dụng trong việc tạo gel cryogel có khảnăng cố định tế bào tốt, có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng, bền chắc, lượng tế bào bị rửa trôikhông nhiều sau chu kì lên men và đặc biệt giữ được hoạt tính trong thời gian dài vìkhông tiếp xúc với dung môi hữu cơ Tuy nhiên có hạn chế là các hạt cryogel sau khi đã

cố định tế bào vi sinh vật chỉ thích hợp đưa vào sản xuất liên tục trong điều kiện nhiệt độthấp

c Cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang

Ở các phương pháp cố định trên, tế bào vi sinh vật được gắn trên bề mặt chất manghay nhốt trong lòng chất mang Ở một số phương pháp khác, tế bào vi sinh vật không có

sự liên kết với chất mang nhưng ta vẫn gọi là tế bào cố định mà ta sẽ tìm hiểu sau này

Phương pháp liên kết chéo

Là phương pháp liên kết các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành một khối tế bào cốđịnh nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không sử dụng chất mang