Giáo trình Vi sinh vật học part 4 ppsx

Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không p

không đổi, nghĩa là bình môi trường đi vào đã được bù bởi dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ

Ta gọi thể tích bình là v (lít), tốc độ dòng đi vào là f (lít/giờ) Do đó tốc độ pha loãng (còn gọi là hệ số pha loãng) D = f/v (đại lượng D biểu thị

sự thay đổi thể tích sau một giờ)

Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với thể tích:

Nếu μ < D => v < 0: mật độ vi khuẩn trong bình giảm

Nếu μ = D => v = 0: mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời gian, quần thể vi khuẩn ở trong trạng thái cân bằng động học

Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì μ luôn luôn bằng D ta sẽ thu được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, thường xuyên ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc và thời gian Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào, trạng thái sinh lý của chúng mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không phụ thuộc vào thời gian Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất vi sinh vật ở qui mô công nghiệp

Chemostas và turbidostas là hai thiết bị nuôi cấy trong đó ta có thể duy trì được điều kiện μ = D

Nuôi cấy tĩnh được xem như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng phải trải qua các pha mở đầu, logarid, ổn định và tử vong Mỗi pha

sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất định Việc điều khiển tự động khó thực hiện

Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến việc thiết lập một cân bằng động học Yếu tố thời gian ở đây trong phạm

vi nhất định bị loại trừ Tế bào được cung cấp những điều kiện môi trường không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động (hình 4.3)

Turbidost Chemosta

Hình 4.3 Nuôi cấy liên tục trong chemostas (trái) và

Cơ sở của phương pháp này là làm nóng vật liệu ở nhiệt độ dưới

1000C nhằm tiêu diệt tất cả các vi sinh vật trong các môi trường dễ bị hỏng khi đun sôi như sữa, bia, rượu vang Khử trùng kiểu Pasteur có thể

ở 600C trong 30 phút hoặc 750C trong 15 phút hay 800C trong 10 phút

- Khử trùng bằng cách đun sôi

Người ta dùng nồi Koch hay nồi Arnola để khử trùng Nồi hấp được cấu tạo bằng thùng hai vỏ kim loại Nước ở thùng ngoài được đun sôi, hơi nước sẽ vào thùng trong Nhiệt độ hơi nước sôi không vượt quá 1000C Ở

nhiệt độ này tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, nhưng bào tử vẫn còn khả năng nảy mầm Ngoài phương pháp trên người ta còn có thể đun sôi trực tiếp các dụng cụ bằng kim loại, cao su, kim tiêm và xylanh trong thời gian

khoảng 10 phút

- Khử trùng bằng phương pháp hấp gián đoạn

Các môi trường dinh dưỡng, các ống bằng cao su và một số dụng cụ

dễ bị hỏng khi khử trùng ở nhiệt độ cao Vì vậy cần phải khử trùng bằng cách đun sôi lặp lại 3 lần trong 3 ngày kế tiếp nhau Lần đun thứ nhất trong 30 - 45 phút làm cho các tế bào sinh dưỡng đều bị chết, nhưng bào

tử vẫn còn sống Sau đó để môi trường, dụng cụ đã khử trùng vào tủ ấm

28 - 300C Ở nhiệt độ này trong môi trường thích hợp, các bào tử sẽ nảy mầm Trong lần khử trùng thứ hai các tế bào vừa mới nảy mầm lại bị tiêu diệt Để đảm bảo hoàn toàn vô trùng ta tiếp tục khử trùng lần thứ 3 trong ngày thứ 3 kế tiếp

- Khử trùng bằng nồi hấp áp lực (Autoclave)

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm nóng môi trường bằng hơi bão hòa ở áp suất cao hơn 1atm Nồi hấp áp lực cao làm bằng kim loại,

có hai vỏ và có khả năng giữ áp suất cao Vỏ trong là thùng khử trùng, nơi

để các dụng cụ, môi trường cần khử trùng Thùng khử trùng có nắp van thoát khí, có áp kế để xác định áp suất hơi nước, có van bảo hiểm để xì hơi khi áp suất quá mức cần thiết và để nồi khỏi bị nổ Khoảng trống giữ hai lớp vỏ là ngăn chứa hơi nước được nối với phểu Nước trong nồi phải đủ đến mức quy định đã khắc trên ống đo nước, phía trên của thùng có lỗ để đưa hơi nước vào thùng trong Nồi hấp được đậy kín bằng các khóa van xung quanh

Chuẩn bị môi trường để khử trùng: các dụng cụ chứa môi trường chỉ được chứa đến 2/3 thể tích và nút kín bằng nút bông Nút bông không được chặt quá để khỏi ngăn cản sự cung cấp ôxy cho vi sinh vật và không lỏng quá dễ bị vi sinh vật bên ngoài xâm nhập vào môi trường, đáy nút bông phải gọn tròn không dài quá hoặc ngắn quá Khi phân phối môi trường tuyệt đối không để môi trường dính vào miệng ống nghiệm, bình hay nút bông Dụng cụ xếp vào nồi khử trùng phải ngay ngắn, không xếp quá sít nhau, để cho hơi nước dễ đi qua Khi khử trùng bằng nồi áp lực cao, áp suất trong nồi tăng lên làm cho nhiệt độ tăng theo

Khi chọn chế độ khử trùng phải chú ý pH của môi trường, pH dưới 5,5 thạch bị thủy phân và khi nguội không có khả năng tạo gel Nếu môi trường kiềm, khi khử trùng sẽ gây kết tủa sắt, caramen hóa đường Để tránh các hiện tượng trên, trong khi khử trùng phải để môi trường có pH trung tính, sau khi khử trùng phải trung hòa lại môi trường đến mức pH

cần thiết Môi trường sau khi khử trùng được giữ trong tủ ấm 300C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ vô trùng

- Khử trùng bằng sức nóng khô

Cách khử trùng này tiến hành trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 1700C trong 2 - 3 giờ Ở điều kiện này các tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật đều bị tiêu diệt Cách khử trùng này được sử dụng để khử trùng các dụng cụ thủy tinh Ống nghiệm, bình tam giác trước khi khử trùng cần được nút kín bằng nút bông Các pipette, hộp petri, que gạt phải được gói

kín bằng giấy báo, trước khi sử dụng mới được mở ra

- Khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa

Cách khử trùng này dùng để khử trùng que cấy vi sinh vật, các dụng

cụ bằng sắt (kim, kẹp, gắp, dao, kéo ), một số dụng cụ thủy tinh (đũa thủy tinh, que gạt ) Muốn khử trùng ta đưa đi đưa lại nhiều lần dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, bằng cách này mọi vi sinh vật bám trên bề mặt dụng cụ đều bị tiêu diệt

1.2 Khử trùng không bằng nhiệt

- Dùng nến lọc vi khuẩn

Một số chất hữu cơ như huyết thanh, albumine trong môi trường dễ

bị biến tính khi khử trùng bằng nhiệt độ cao nên phải khử trùng bằng cách lọc qua các dụng cụ lọc vi khuẩn Các lỗ của màng lọc nhỏ hơn kích thước của tế bào vi khuẩn Loại dụng cụ thường dùng hiện nay là loại lọc seltz, loại này có 2 bộ phận Một bộ phận hình viên trụ ở phía trên, dùng để chứa dịch lọc, một bộ phận hình phễu ở phía dưới Hai bộ phận được gắn vào nhau và được cố định lại nhờ 3 đinh ốc Mỗi lần lọc, người ta đặt vào giữa

2 bộ phận một màng lọc tròn bằng amian hay bằng nitrocellulose dày

khoảng 3 - 5cm (màng lọc chỉ dùng một lần)

- Khử trùng bằng hóa chất

Hóa chất được dùng để khử trùng bảo quản nguyên vật liệu và để làm sạch phòng thí nghiệm, bệnh viện Khi sử dụng hóa chất cần lưu ý tới nồng độ thích hợp, không gây độc đối với con người Sàn nhà, bàn ghế trong phòng được lau bằng các dung dịch sát trùng như chloramine 0,5 - 3%, hoặc nước phenol 3 - 5% Sử dụng cồn sát trùng để lau các dụng cụ thủy tinh như que gạt, phiến kính, lá kính, đũa thuỷ tinh

- Khử trùng bằng tia tử ngoại, ánh sáng mặt trời

Tia tử ngoại có bước sóng 13 - 400 nm đều có tác dụng diệt khuẩn

Để khử trùng buồng nuôi cấy, phòng thí nghiệm, người ta chiếu tia tử ngoại trong khoảng 30 - 40 phút

Tia sáng mặt trời có bước sóng 330 - 400 nm cũng có tác dụng diệt khuẩn Vì thế trong một số trường hợp người ta có thể phơi nắng các dụng

cụ của phòng thí nghiệm 2 - 3 giờ sau khi đã được rửa sạch

2 Các phương pháp bảo quản

1 Cấy truyền thường xuyên trên thạch nghiêng hoặc trích sâu vào thạch Sau khi đã sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +40C Phương pháp này đơn giản nhất và thường được dùng nhưng kém hiệu quả nhất

2 Bảo quản dưới dầu vô trùng: dầu paraffin vừa ngăn cản môi trường khô vừa làm giảm trao đổi chất gây cản trở sự xâm nhập của ôxy

3 Bảo quản trong cát hoặc đất sét vô trùng: do cấu trúc lí - hóa cát

và đất sét đều là những vật chất tốt mang các tế bào vi sinh vật, chủ yếu là các bào tử Sau khi làm khô không khí cát (hoặc đất sét) cùng với vi khuẩn

có thể bảo quản tế bào rất lâu

4 Đông khô: là phương pháp hoàn thiện và có hiệu quả nhất Vi khuẩn được trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh ) rồi làm lạnh và làm khô nhờ băng khô Sau mấy năm bảo quản tế bào vẫn giữ được khả năng sống mà không bị biến đổi về di truyền

5 Bảo quản trong glycerine (10%) và giữ trong tủ lạnh sâu (-600C hay - 800C): đây là phương pháp rất thích hợp nhưng cần mua được loại ống nhựa chịu nhiệt (khi khử trùng)

Câu hỏi ôn tập chương 4

1 Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật?

2 Các cơ chất dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật?

3 Cơ chế và tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật?

4 Các pha sinh trưởng của vi sinh vật, điểm khác biệt của phương pháp nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục?

5 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đường cong sinh trưởng, hiện tượng

sinh trưởng kép?

Chương 5

Trao đổi chất ở vi sinh vật

I Các con đường phân giải hexose

1 Con đường Embden - Meyerhof - Parnas (EMP hay đường phân)

ATP (3) ADP

(5) (4) (AlPG) Glyceraldehyd - 3P Dioxy acetone – P (DAP)

H3PO4 NAD (6)

NADH2

a 1,3 diphosphoglyceric (a 1,3DPG)

ADP (7)

A TP

Trong điều kiện có hoặc không có O2, glucose đều được chuyển thành pyruvate qua 10 phản ứng, trong đó 3 phản ứng 1, 3 và 10 là phản ứng một chiều, còn các phản ứng khác là phản ứng thuận nghịch Trừ chất

a Pyruvic

Hình 5.1: Con đường EMP

đầu và chất cuối, tất cả các chất trung gian trong chu trình đều ở dạng phosphoryl hóa Gốc phosphoryl mang 3 chức năng là giúp cho chất trung gian mang điện tích âm cao không thể thoát ra ngoài, là vị trí gắn enzyme

và là vị trí cung cấp liên kết cao năng

Phương trình chung:

Glucose 2 pyruvate + 2ATP + 2 NADH2

ATP được tạo thành từ 2 phản ứng 7 và 10 Sự tạo thành ATP ở 2 phản ứng trên gọi là phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất vì phosphate cao năng trước đó là một phần của phân tử chất trao đổi (1,3 di - P - glycerate

và PEP), khi có mặt của ADP thì chất trao đổi sẽ chuyển gốc P cho ADP tạo thành ATP

Có thể chia con đường EMP thành 4 giai đoạn:

1 Hoạt hóa glucose tạo fructose - 1,6 diphosphate (có thể xẩy ra ở nhiều monosaccharide khác)

2 Bẻ đôi phân tử fructose - 1,6 diphosphate tạo AlPG và DAP

3 Ôxy hóa AlPG thành A2PG

4 Chuyển hóa A2PG tạo acid pyruvic (hình 5.1)

1.2 Ý nghĩa của con đường EMP

- Quá trình đường phân cung cấp cho tế bào 6 trong số 12 tiền chất dùng để tổng hợp các đơn vị kiến trúc: glucose - 6-P, fructose - 6-P, 3-P-

glyceraldehyd, 3P - glycerate, PEP, pyruvate

- Cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào tuy hiệu suất không cao (khoảng 10%), nhưng đây là con đường nguyên thủy nhất gặp ở hầu hết sinh vật

2 Con đường pentosophosphate ôxy hoá (PP, HMP)

Do một đột biến nào đó (thiếu enzyme) mà một số vi sinh vật có thể chuyển hóa glucose thành pyruvate theo con đường PP (hình 5.2)

Từ glucose qua quá trình decarboxyl hóa tạo ribuloso - 5P và CO2 Các phản ứng tiếp theo là sự chuyển hóa giữa pentoso- 5P và hexoso - 6P

Ý nghĩa của chu trình: Xét về mặt năng lượng, từ 1 phân tử glucose khi phân giải tạo 35 ATP nhưng qua con đường này tạo riboso - 5P tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, tạo các loại đường C4, C7 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin Con đường này tạo NADPH2 cần thiết cho các phản ứng sinh tổng hợp trong tế bào Đây là con đường phân giải đường thường gặp ở vi khuẩn thuộc giống

Pseudomonas

Xilulose Ribose

Ribose

Hình 5.2 Con đường pentosophosphate

3 Con đường KDPG (2keto - 3deoxy - 6Pgluconate)

Phương trình tổng quát như sau:

Glucose 2 Pyruvate + ATP + NADH2 + NADPH2 Con đường KDPG giúp cho nhiều vi khuẩn sử dụng gluconate và chỉ

gặp ở một số vi khuẩn Ở E coli và nhiều loài của Clostridium chuyển hóa

glucose qua con đường EMP nhưng phân giải gluconate qua con đường KDPG Qua các con đường phân giải glucose, pyruvate được tạo thành Nếu trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật sẽ ôxy hoá pyruvate tạo CO2 và nước Nếu điều kiện kị khí các vi sinh vật sẽ tiến hành quá trình lên men hoặc hô hấp kị khí (hình 5.3)

1,3

3-phosphoglycerat 2-phosphoglycerate

Phosphoenol-pyruvate

Hình 5.3 Con đường KDPG

4 Ôxy hoá pyruvate

Pyruvate chiếm vị trí trung tâm trong trao đổi chất trung gian và là tiền chất của nhiều sản phẩm Nhiều vi sinh vật ôxy hóa pyruvate thành acetyl - CoA chủ yếu qua 3 phản ứng sau (hình 5.4):

Pyruvate +CoA+NAD+ Acetyl - CoA + NADH2 + CO2 (1) Pyruvate + CoA + 2Fd Acetyl - CoA + 2FdH + CO2 (2) Pyruvate + CoA + NAD+ Acetyl - CoA + formate (3)

Hình 5.4 Quá trình ôxy hóa pyruvate

Pyruvate- carboxylase

Acid dihydrolipoic

Enzyme Acid lipoic

Dihydrolipoid

- dehydrogenas

Enzyme Enzyme

Enzyme Pyruvate

Phản ứng (1) do phức hệ pyruvate - dehydrogenase (PDH) xúc tác PDH gặp ở hầu hết vi sinh vật hiếu khí (không gặp ở vi khuẩn kị khí bắt buộc) PDH gồm 3 enzyme, ngoài CoA và NAD+ còn cần TPP (thiamine -pyrophosphate) và acid lipoic Phản ứng (2) xúc tác bởi pyruvate - Fd -

oxidoreductase, enzyme này gặp nhiều ở vi khuẩn kị khí như Clostridium

Phản ứng (3) do pyruvate - formate - liase xúc tác, enzyme này gặp nhiều

ở vi khuẩn kị khí tiết acid formic (thuộc họ Enterobacteriaceae) và vi

khuẩn quang năng

II Chu trình tricarboxylic (Krebs)

Trong quá trình ôxy hóa hoàn toàn, pyruvate sẽ được ôxy hoá triệt

để thông qua chu trình Krebs (chu trình acid tricarboxylic = ATC)

Cơ chế được trình bày ở hình 5.5

Hình 5.5 Chu trình Krebs (theo Lehninger)

Trong chuỗi phản ứng vòng của chu trình ATC, acid pyruvic bị phân huỷ triệt để tạo CO2, coezyme dạng khử và các hợp chất trung gian Các coezyme thông qua chuỗi hô hấp vận chuyển H và electron đến cho O2 phân tử tạo nước đồng thời giải phóng năng lượng ATP

Ý nghĩa của chu trình: Ngoài chức năng ôxy hóa tận cùng, chu trình ATC còn cung cấp cho tế bào 3 tiền chất là oxalacetate (tổng hợp aspactate), α - ketoglutarate và succinyl - CoA (tổng hợp nhân hem) Về năng lượng, chu trình cung cấp 1ATP ở mức độ phosphoryl hóa cơ chất nhưng sản sinh NADH2 để đi vào chuỗi vận chuyển electron tạo ATP Trong điều kiện kị khí chu trình TCA không có chức năng sinh năng lượng nhưng cũng phải cung cấp cho tế bào 3 tiền chất trên Tế bào phải

sử dụng phần lớn pyruvate để lên men thu năng lượng, còn phần nhỏ chuyển thành acetyl - CoA nhờ pyruvate - ferredoxin - oxidoreductase Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí ôxy hóa chất dinh dưỡng hữu cơ thành CO2 và H2O (vì carbon trong phân tử CO2 đạt mức độ ôxy hóa cao nhất nên người ta gọi là quá trình ôxy hóa hoàn toàn) Một số vi sinh vật

có khả năng ôxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí nhưng lại sinh ra các sản phẩm chưa được ôxy hóa hoàn toàn (ketoacid, acid gluconic, acid malic, acid fumaric ) Nhiều quá trình ôxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm có giá trị

III Chuỗi hô hấp (respiratory chain) và phosphororyl hóa ôxy hóa (oxidative phosphorylation)

Khác với vi khuẩn kị khí, vi khuẩn hiếu khí có thể tổng hợp ATP mạnh mẽ hơn nhiều nhờ có chuỗi hô hấp và ATP - synthetase Hai hệ thống này nằm ở màng tế bào Prokaryota hoặc màng trong ti thể của tế bào Eukaryota Năng lượng thoát ra được chuyển thành ATP, một phần nhỏ giải phóng ra ở dạng nhiệt Các thành phần của chuỗi nằm trong lớp lipid kép, gồm nhiều enzyme vận chuyển electron và hydro, các coenzyme và nhóm thêm, các dehydrogenase và

hệ thống vận chuyển Các thành phần quan trọng nhất tham gia vào ôxy hóa hydro là :

- Flavoprotein là các enzyme chứa nhóm thêm là FMN hoặc FAD - vận chuyển hydro

- Protein Fe-S vận chuyển electron, chứa nguyên tử Fe, vừa liên kết với S của cysteine vừa liên kết với S của H2S Cysteine là một phần của chuỗi polypeptide, có thể coi trung tâm Fe - S là nhóm thêm của chuỗi polypeptide Các protein Fe - S cũng tham gia vào sự cố định N, khử

sulphite, khử nitrite, quang hợp

- Quinol: nằm ở màng trong của ti thể, ở vi khuẩn G- là ubiquinol (CoQ), vi khuẩn G+ là naphtoquinol và ở lục lạp là plastoquinol Quinol, đặc biệt là CoQ có đặc tính ưa lipid do đó lắp vào lớp lipid kép của màng, vận chuyển hydro hoặc enzyme

- Cytochrome: vận chuyển electron, không vận chuyển hydrogen Cytochrome nhận electron từ quinol, trong quá trình vận chuyển một số lượng H+ tương đương với số lượng electron bị tách vào môi trường (hình 5.6)

Cyt Cyt Cyt Cyt

Hình 5.6 Sơ đồ chuỗi hô hấp

Trong quá trình vận chuyển 2[H] từ NADH2 đến O2 có 3 bước chuyền electron liên quan đến tạo thành ATP và được biểu thị bằng hệ số P/O (mol ATP/mol nguyên tử O) Hệ số P/O = 3 khi 2[H] được chuyền qua NAD+ và P/O = 2 khi 2[H] từ succinate qua FAD đến O2 Do đó 1mol glucose khi phân giải qua chu trình EMP và TCA với tất cả [H] tách ra được chuyển vào chuỗi hô hấp để tạo thành nước sẽ tạo 38 ATP Sự tính toán trên đúng với ti thể và một số vi khuẩn Tuy nhiên, ở một số vi khuẩn

do chỉ có 2 vị trí phosphoryl hóa nên sự hô hấp hiếu khí glucose chỉ cho

26 ATP (như ở E coli không có NAD, Proteus vulgaris không có

cytochrome C)

Cơ chế phosphoryl hoá ôxy hoá (sự tạo thành ATP trong chuỗi hô hấp) được giải thích theo thuyết hoá thẩm thấu của Mitchell (1979) Theo thuyết này, màng tế bào vi khuẩn và màng trong ti thể không thấm các ion

kể cả H+ và OH- và kém dẫn điện Sự sắp xếp các protein của màng (các thành phần vận chuyển electron, permease, ATP - sinthetase ) khiến màng mang tính chất không đối xứng Sự định hướng không gian của các phân tử enzyme dẫn đến trao đổi chất có đặc tính vectơ Chuỗi hô hấp bao gồm một dãy các chất vận chuyển hidro và electron sắp xếp luân phiên trong màng Do sự ôxy hoá cơ chất mà phía trong màng có sự tiêu thụ H+

và phía màng ngoài giải phóng H+ Trong sự ôxy hoá NADH2, 6H+ đã