Nghiên cứu khả năng cố định nấm men Saccharomyces cerevisia trên táo và ứng dụng trong sản xuất rượu vang dâu tằm

Trong giới hạn của đồ án môn học chuyên ngành đề tài này được thực hiện nhằm mục đích tổng quan tài liệu về nấm men Saccharomyces cerevisia, phương pháp cố định nấm men trên trái táo và khả năng ứng dụng trong sản xuất rượu dâu tằm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH Saccharomyces

cerevisiae TRÊN TÁO VÀ ỨNG DỤNG SẢN

XUẤT RƯỢU DÂU TẰM

GVHD: PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG SVTH: HOÀNG NGÂN HÀ

MSSV: 60600569

Tp HCM, tháng 6/2010

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự thành kính, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

Phó Giáo Sư TS Nguyễn Đức Lượng – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài và hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này

Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài

Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM –

đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Tên đề tài 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Nội dung đề tài 2

CHƯƠNG 2: NẤM MEN Saccharomyces cesrevisiae 3

2.1 Hình thái và kích thước 3

2.2 Cấu tạo nấm men 3

2.2.1 Thành tế bào 4

2.2.2 Màng nguyên sinh chất 5

2.2.3 Chất nguyên sinh 6

2.2.4 Nhân tế bào 6

2.2.5 Không bào 6

2.2.6 Ty thể 7

2.2.6 Mạng lưới nội chất 7

2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men 7

2.4 Dinh dưỡng nấm men 10

2.4.1 Dinh dưỡng cacbon 10

2.4.2 Dinh dưỡng nito 10

2.4.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ 11

2.4.4 Dinh dưỡng chất sinh trưởng 11

2.5 Hình thức sinh sản 11

2.5.1 Sinh sản bằng hình thức nảy chồi 11

2.5.2 Sinh sản bằng bào tử 13

CHƯƠNG 3: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH NẤM MEN 14

3.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 14

3.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 14

3.2.1 Chất mang hữu cơ 15

3.2.2 Chất mang vô cơ 17

3.3 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 18

3.3.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang 19

3.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel 21

3.3.3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang 21

3.4 Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do 24

3.4.1 Ưu điểm: 24

3.4.2 Nhược điểm: 25

3.5 Giới thiệu chất mang trái táo và phương pháp cố định trên chất mang táo 25

3.5.1 Trái táo 25

3.5.2 Phương pháp cố định trên táo 31

CHƯƠNG 4: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG 34

4.1 Giới thiệu về nguyên liệu dâu tằm 34

4.1.1 Nguồn gốc 34

4.1.3 Thành phần hóa học 37

4.1.4 Ứng dụng 37

4.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 38

4.2.1 Sơ lược về rượu vang 38

4.2.2 Sự lên men rượu 42

4.2.3 Hệ vi sinh vật trong sản xuất rượu vang 54

4.2.4 Quy trình công nghệ sản xuất rượu vang 60

CHƯƠNG 5: TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 69

5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 69

5.1.1 Sản xuất rượu vang từ nấm men cố định trên táo lên men gián đoạn ở nhiệt

độ phòng và nhiệt độ thấp 69

5.1.2 Lên men liên tục sử dụng nấm men cố định trên táo ở nhiều nhiệt độ khác nhau 73

5.1.3 Lên men rượu sử dụng nấm men cố định trên vật liệu trái cây khác 76

5.1.4 Ảnh hưởng của điều kiện lên men và chất mang trong lên men rượu 81

5.1.5 Lên men lactic và lên men thu sản phẩm probiotic bằng vi sinh vật cố định trên táo 84

5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 86

CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 88

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần phân tử của nấm men rượu (theo Reed Elsevier) 8

Bảng 3.1: Sản lượng táo (theo tấn) ở các quốc gia trên thế giới 27

Bảng 3.2: Thành phần các chất có trong 100g táo 27

Bảng 4.1: Thành phần của quả dâu tằm (trong 100g quả) 37

Bảng 4.2: Thành phần vitamin trong quả dâu 37

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến một số loại nấm men 52

Bảng 5.1: So sánh lượng sản phẩm phụ của phương pháp lên men liên tục và phương pháp truyền thống 76

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Saccharomyces cerevisiae 3

Hình 2.2: Cấu tạo tế bào Saccharomyces cerevisia 4

Hình 2.3: Sự sinh sản bằng hình thức nảy chồi 12

Hình 2.4: Chu kì nảy chồi của nấm men 12

Hình 2.5: Vòng đời sinh sản của Saccharomyces cerevisiae 13

Hình 3.1: Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 19

Hình 3.2: Các loại táo được dùng để sản xuất rượu vang 26

Hình 3.3: Cấu tạo thịt quả 28

Hình 3.4: Cấu trúc cellulose trong thịt quả 29

Hình 3.5: Cấu trúc của hemicelluloses 30

Hình 3.6: Cấu tạo pectin 31

Hình 4.1: Một số loại dâu tằm 34

Hình 4.3: Quả dâu tằm 36

Hình 4.4: Sản phẩm rượu vang 40

Hình 4.5: Đường cong sinh trưởng của nấm men 43

Hình 4.6: Quá trình đường phân 44

Hình 4.7: Quá trình lên men rượu 46

Hình 4.8: Sự tạo thành các sản phẩm phụ 48

Hình 5.1: a) Táo làm chất mang cố định nấm men trong lên men rượu 71

Hình 5.1: b) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử nấm men cố định trên táo 71

Hình 5.2: Sự giảm thể tích của táo theo số lần lên men 71

Hình 5.3: Phần trăm ethyl acetate và rượu bậc cao trong lượng acid tổng theo nhiệt độ 72

Hình 5.4: Sự thay đổi nồng độ đường, nhiệt độ, nhập liệu theo thời gian 75

Hình 5.5: Bề mặt vỏ cam trước và sau khi cố định nấm men 77

Hình 5.7: Chênh lêch lượng đường sau khi lên men sử dụng tế bào cố định và tự do

ở nhiệt độ 20 và 25C 77

Hình 5.8: a) Ảnh hưởng của thể tích trái mộc qua theo số lần lên men 79

Hình 5.8: b) % ethyl acetae và amyl alcohol theo nhiệt độ 79

Hình 5.9: Nấm men cố định trên mộc quả trong lên men 80

Hình 5.10: a) Nấm men cố định trên quả sung 81

Hình 5.10:b)Tế bào nấm men cố định trên trái sung dưới kính hiển vi điện tử 81

Hình 5.11: So sánh giữa phương pháp sử dụng tế bào cố định và tự do 81

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ xưa, người ta dùng từ ‘Wine’ hay ‘Rượu Vang’ để chỉ các sản phẩm lên men cồn từ dịch chiết của nho bằng nấm men Theo định nghĩa trong từ điển Oxford, rượu vang được định nghĩa ngắn gọn là thức uống lên men từ quả nho Rượu vang đóng một vai trò quan trọng trong nền văn minh của nhân loại

Ngành sản xuất rượu vang đã có từ lâu đời, kỹ thuật sản xuất lúsc này chủ yếu là lên men tự nhiên nước quả và sử dụng chính hệ vi sinh vật trong quả nho để lên men Đến thế kỷ thứ mười chín, ngành sản xuất rượu vang mới được đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp Hiện nay có hai phương pháp lên men rượu vang

cơ bản là: lên men tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết Theo tài liệu của tổ chức quốc tế về nghề trồng nho và làm rượu vang, nhiều quốc gia trên thế giới như Pháp, Italia, Mexico, Bồ Đào Nha,…chỉ dùng nấm men có sẵn trong nước quả để lên men Nhưng phương pháp sử dụng nấm men thuần khiết để sản xuất rượu vang có rất nhiều triển vọng: thời gian lên men nhanh, quá trình lên men không bị dừng ở giữa chừng, hàm lượng đường trong dịch quả được lên men triệt để, nồng độ cồn thu được trong vang cao hơn lên men tự nhiên từ 0,1 ÷1, vang sáng màu nhanh hơn, có thể cho hương vị thanh khiết hơn Nấm men thuần khiết được bổ sung vào lên rượu thường ở dạng tự do, nhưng hiện nay người ta rất qua tâm đến việc sử dụng nấm men cố định và đã có rất nhiều các nghiên cứu cố định nấm men thuần khiết trên các loại chất mang khác nhau và ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất rượu vang

Phần lớn các nghiên cứu theo hướng tìm ra một loại chất mang thích hợp để

cố định nấm men và có khả năng ứng dụng trong lên men rượu Đã có những chất mang được nghiên cứu như kissiris, các vật liệu polymer như polysaccharide, alginate, cellulose, carregeenan, agar, v.v…tuy nhiên không có khả năng ứng dụng

do chúng không cho chất lượng rượu vang tốt Chất mang thích hợp là nguyên liệu vừa rẻ vừa cho mùi vị thơm ngon cho rượu vang, đồng thời kỹ thuật cố định đơn giản Người ta thấy rằng chất mang từ nguyên liệu trái cây rất có tiềm năng trong

công nghiệp sản xuất rượu, trong đó trái táo vừa là nguyên liệu rẻ tiền, có sẵn trong

tự nhiên, lại đã được sử dụng để làm rượu cho hương vị thơm ngon, do đó táo có thể ứng dụng làm chất mang cố định

Dâu tằm là một loại cây được nhân dân ta nuôi trồng từ lâu đời Sỡ dĩ có tên

là dâu tằm, vì công dụng chính của chúng là để nuôi tằm, dệt lụa Ở nước ta, cây dâu tằm được trồng ở miền Bắc tại những khu cực sông Hồng, sông Đáy, sông Thái Bình Còn ở miền Nam, cây dâu tằm được trồng nhiều ở tỉnh Lâm Đồng Sản lượng dâu tằm hằng năm khá lớn Trái dâu tằm được xem là một trái cây quý, không chỉ

có hương vị thơm ngon mà còn có tốt cho sức khỏe, chữa được một số bệnh, bổ thận dưỡng huyết, tăng cường sinh lực

Từ thực trạng trên ta thấy rằng việc nghiên cứu ứng dụng táo làm chất mang

cố định nấm men và ứng dụng trong sản xuất rượu dâu tằm là rất cần thiết

1.2 Tên đề tài

Đề tài nghiên cứu khả năng cố định nấm men Saccharomyces cerevisia trên

táo và ứng dụng trong sản xuất rượu vang dâu tằm

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

Trong giới hạn của đồ án môn học chuyên ngành đề tài này được thực hiện

nhằm mục đích tổng quan tài liệu về nấm men Saccharomyces cerevisia, phương

pháp cố định nấm men trên trái táo và khả năng ứng dụng trong sản xuất rượu dâu tằm

1.4 Nội dung đề tài

Đề tài này tập trung làm rõ những nội dung sau: Nấm men Saccharomyces

cerevisia và quá trình cố định nấm men trên táo và ứng dụng của nấm men cố định

trong sản xuất rượu vang dâu tằm

CHƯƠNG 2: NẤM MEN Saccharomyces cesrevisiae

2.1 Hình thái và kích thước

Nấm men S.cerevisiae có cơ thể đơn bào Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi

Đặc biệt thấy chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Ngoài

ra thấy chúng có mặt trên trái cây chín, trong không khí, trong nhụy hoa và cả nơi sản xuất rượu vang [1]

S cerevisiae là các tế bào trong hình elip, với đường kính lớn từ 5 đến 10

m, và đường kính nhỏ từ 1-7 m Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp

5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi cấy, theo tuổi sinh lý Thể tích của tế bào là 29 m3 cho một tế bào đơn bội, và

55 m3 cho một tế bào lưỡng bội Nấm men thể hiện hầu hết các cấu trúc và chức năng của tế bào nhân chuẩn, và được sử dụng như là một mô hình chung cho các tế bào nhân chuẩn sinh học [1]

Hình 2.1: Saccharomyces cerevisiae [28]

2.2 Cấu tạo nấm men

Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như động vật, thực vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, …) ở tế bào nhân nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở nhân sơ, như ti thể, lục lạp, … [2]

Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác, được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản như sau: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan con khác

Hình 2.2: Cấu tạo tế bào Saccharomyces cerevisia [11]

2.2.1 Thành tế bào: [1]

Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong

đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ khác như kitin

Manan: Là hợp chất cao phân tử của D-manose, mỗi phân tử manan thường

chứa từ 200÷400 thành phần manose Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết α-1,6 ; α-1,2 ; β-1,3, phân tử lượng của chúng khoảng 5.104 KDa

Glucan: Là hợp chất cao phân tử của D-glucose Đó là một polysaccharide

phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3 Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành tế bào

Protit: Protit thường được liên kết với các thành phần khác, ví dụ như

manan Trong thành phần của chúng chứa nhiều acid amine khác nhau, như glycine, alanine, tyrosine, leucine, isoleucine, asparagines, glutamine, phenylalanine, và một lượng nhỏ serine, histidine, tryptophan Phức hợp protein-manan rất bền vững do đó tế bào nấm men rất khó bị phá vỡ Thường thì các polysaccharide nằm phía ngoài và protit nằm phía trong gần bào tương

Kitin: Thường nằm ở phần nảy chồi Chúng chiếm một số lượng rất nhỏ,

khoảng 3% Đây là chất rất bền vững, không bị enzyme phân hủy, vì vậy chúng có tác dụng bảo vệ chồi trong khi chồi còn non Khi tế bào con phát triển, tách khỏi tế bào mẹ, nơi tạo ra tế bào con này sẽ tạo ra vết sẹo và không bao giờ ở vị trí này tạo

ra một chồi mới Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào nấm men có lipit ở dạng phospholipit, chúng chiếm khoảng 1÷10%

2.2.2 Màng nguyên sinh chất

Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng mỏng, chiều dày không quá 0,1nm (1 nm = 10-9 m) Màng có cấu tạo từ những hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme permease Trong thời kì còn non, màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào, làm cho khả năng trao đổi chất của nấm men trở nên rất mạnh Ngược lại ở thời kì tế bào già, màng nguyên sinh chất co lại, tạo ra một khoảng trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh, vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn [1]

Màng nguyên sinh chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào, thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào), nơi khu trú một số enzyme và cơ quan của tế bào (như ribosome) Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu của màng Đặc tính này trước hết phụ thuộc vào các enzyme phospholipase và lipase [2]

2.2.3 Chất nguyên sinh

Chất nguyên sinh thường có màu xám Nó có cấu trúc không gian không đồng nhất và ở thể keo, chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào: ti thể, ribosome, mạng lưới nội chất, và các chất dự trữ

Khi tế bào còn non hầu như không nhận thấy, càng về già ta càng thấy có sự thay đổi rõ rệt.Tế bào còn non chất nguyên sinh thường đồng nhất hơn, càng về già

tế bào chất càng không đồng nhất là do xuất hiện các không bào và hạt volutin, vì vậy chất nguyên sinh thường có dạng lổn nhổn Trong thành phần của chúng, cũng giống như của các vi sinh vật khác, chủ yếu được cấu tạo từ nước, protein, lipit, gluxit, các muối khoáng, enzyme, và các cơ quan con

Tế bào chất luôn luôn chuyển động Chúng thường chuyển động theo một chiều xung quanh thành tế bào Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của nấm men Ví dụ nấm men trong trạng thái hô hấp tế bào chất thường đồng nhất

và không chứa những chất lổn nhổn, trong khi đó ở trạng thái lên men thấy xuất hiện nhiều chất làm mất tính tính đồng nhất của không bào Độ nhớt của tế bào chất lớn hơn độ nhớt của nước 800 lần [1]

2.2.4 Nhân tế bào

Tế bào nấm men đã có nhân thật, nhân thường có hình bầu dục hay hình cầu, đường kính nhân vào khoảng 2m Nhân được bao bọc một lớp màng, bên trong là lớp dịch nhân và trong đó có một thể rắn gọi là hạch nhân hay nhân con [1] Màng nhân tham gia vào điều hòa các quy trình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm

và thông báo trực tiếp giữa nhân và tế bào chất Thành phần hòa học chủ yếu cơ bản của nhân là acid deoxyribosenucleic (DNA), ngoài ra nhân còn có protein [2]

2.2.5 Không bào

Trong mỗi tế bào nấm men có một hoặc nhiều không bào Không bào chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng hypoprotein gọi là màng không bào Hình dạng không bào có thể thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào Vị trí của không bào cũng khác nhau Không bào là nơi chứa đựng các protease Các enzyme này tham gia quá trình thủy phân rất mạnh [1]

2.2.6 Ty thể

Ty thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tế bào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào Có thể thấy chúng ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của tế bào nấm men: thời kì yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào tử…chiều dài của sợi ty thể là 0,2 -7,5 m Hình dáng của chúng có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết hợp thành chuỗi

Bình thường số lượng ty thể trong tế bào nấm men dao động rất lớn: từ 1

đến 50 Ở S cerevisiae nếu có 1 ty thể thì thể tích của nó chiếm tới 88% thể tích tế

2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tế bào nấm men là nước- khoảng 75% khối lượng chung

Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau: độ ẩm, 2-5%; protein, 46%; carbohydrate, 30-37%; nucleic acid, 6-8%; lipid, 4-5%; khoáng chất, 7-8%.[2]

42-Từ các dữ liệu trình bày trong bảng , Rosen đã cho nấm men có công thức phân tử xấp xỉ C4.02H6.5 O2.11 N0.43 P0.03 Các thành phần có chứa carbohydrate của nấm men bao chẳng hạn như thành tế bào (đa số), và các hợp chất dự trữ năng lượng, kháng thể, như glycogen và trehalose

Bảng 2.1: Thành phần phân tử của nấm men rượu (theo Reed Elsevier) [11s] Thành phần các nguyên tố Phần trăm khối lượng

tỷ lệ nước trong nội bào và phần giữa của tế bào Khi loại bỏ 85% lượng nước từ nấm men ở nhiệt độ dưới 50 C hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng

Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 ÷28% là chất hữu cơ và 5 ÷7 % chất tro [2]

 Protein: nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng

50% (tính theo chất khô) và khoảng 45% hoàn chỉnh Các dẫn xuất của acid nucleic như bazo purin và pyrimidin, các acid amine tự do đều được gọi là protein nguyên liệu

 Glycogen: Là những chất dự trữ nguồn cacbon (hydratcacbon của nấm

men) Khi môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hóa của nấm men, và giải phóng ra nước, khí cacbonic

 Tregaloza: Hợp chất thường kết hợp với hàng loạt glycogen làm nguồn

dự trữ cacbon di động Ở cùng một pH hàm lượng tregaoza tăng thì nito giảm

 Chất béo: Chất béo trong tế bào nấm men có các acid oleic, lioelic,

palmitic Trong chất béo có tới 30 40% phosphtit

 Tro: Trong nấm men thấy có các oxide sau đây (%) P2O5 khoảng 25-60, CaO 1-8, MgO 4-6, Na2O 0,5-2, SO32- 0,5-6,…

 Phospho: Trong tế bào nấm men thấy ortho-, pyro- và meta phosphate ở

dạng hữu cơ và vô cơ Chúng là thành phần của các acid nucleic, phospholipit và coenzyme của adenoziphosphat (AMP, ADP, ATP) và tiamin (vitamin B1) Trong chất nhân (nucleproteit) có chứa phosphor ở dạng orthophosphate Dạng này còn thấy ở thành phần các enzyme flavin, dạng pyrophosphate thấy nhiều coenzyme (Codehydraza KoI, KoII, cacboxylaza) Phosphate còn thấy ở các dạng khác nhau tham gia và các quá trình quan trọng trao đổi năng lượng của tế bào

 Lưu huỳnh (S): Lưu huỳnh là thành phần của nhiều hợp chất rất quan

trọng như các acid amin, các vitamin Trong thành phần enzyme lưu huỳnh ở dãng gốc sulfit và tiolovic

 Sắt: Sắt chứa trpng các xitocrom, xitocrom-oxydaxa, pydoxydaza,

catalaza, nhiều enzyme của quá trình hô hấp hoặc các enzyme khác nữa, như zimogenaza, pyrophosphataza

 Magie: có tác dụng hoạt hóa nhiều phosphataza và enolaza Ion magie

có tác dụng giữ gìn hoạt tính enzyme khi đun nóng Magie và mangan làm tăng nhu cầu về glucoza của nấm men Ảnh hưởng của Magie mạnh hơn khi nồng độ glucoza thấp trong môi trường Các môi trường dinh dưỡng thường có 0,02 0,05% Magie ở dạng sulphat

 Kali: Kali vừa là chất dinh dưỡng vừa là chất kích thích sinh trưởng của

nấm men Tác dụng kích thích được giải thích bằng vai trò của ion này trong quá trình phosphoryl-oxy hóa và quá trình đường phân Nó còn kích thích quá trình vận chuyển phosphor vô cơ vào trong tế bào Kali hoạt hóa hàng loạt các enzyme của nấm men, như aldolaza, enzyme pyruvat cacboxylaza và còn ảnh hưởng đến trao đổi chất nito, lưu huỳnh và chất béo trong tế bào nấm men

 Canxi: Canxi đóng vai trò hoạt hóa trong tế bào vi sinh nói chúng, cũng

như tế bào nấm men Canxi được tìm thấy trong sinh vật nhân chuẩn ở dạng tự do, nhưng chủ yếu ở dạng liên kết với protein, hydratcacbonn và lipit

 Các nguyên tố vi lượng: Các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng

đối với sinh sản và hoạt động sống của nấm men Chúng tham gia vào thành phần của nhiều enzyme, vitamin và nhiều hợp chất khác nữa trong quá sinh tổng hợp các sản phẩm của tế bào

 Vitamin và nhân tố sinh trưởng: Để cho nấm men được phát triển và

lên men bình thường cần phải có các vitamin làm cofactor trong các enzyme của tế bào nấm men Nấm men có thể tổng hợp tất cả vitamin trong chừng mực nào đó, ngoại trừ biotin (vitamin H) Vì vậy, trong môi trường dinh dưỡng nhất định phải

có vitamin Hàm lượng protein trong tế bào nấm men khô như sau (g/g men khô): Inozit: 6000÷15000, biotin (vitamin H): 0,6÷0,7, riboflavin (vitamin B2): 30 ÷60, acid pantotenic (vitamin B3): 2÷19, tiamin (vitamin B1): 24÷50, pyridoxine (vitamin B6): 14 ÷39, nicotamin (vitamin B5): 370÷750

Thành phần hóa học của tế bào nấm men có thể thay đổi phụ thuộc thành phần môi trường dinh dưỡng, mức độ tăng trưởng của giống nấm men và điều kiện nuôi cấy Quan hệ của nấm men với các chất có trong môi trường chính là mối tương tác vào nhu cầu dinh dưỡng và các enzyme do tế bào tiết ra, sinh ra trong quá trình nuôi cấy [2]

2.4 Dinh dưỡng nấm men

2.4.1 Dinh dưỡng cacbon

Các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các loại rượu, axit hữu cơ, các axit amin… có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men Nấm men không sử dụng trực tiếp tinh bột cũng như cellulose vì không chứa enzyme polyhydrolase

Nguồn C dinh dưỡng trước hết là các loại đường, gồm các loại đường C6 như glucose, …và một số loại đường pentose Các giống Saccharomyces lên men rượu thì sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose và galactose [2]

2.4.2 Dinh dưỡng nito

Nguồn nito cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nito của tế bào là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường

Hợp chất chứa nito của tế bào là các axit amin, các nucleotide purin và pyrimidine, protein, và một số vitamin Nấm men có khả năng tổng hợp các axit amin… thành phần protein trực tiếp từ các chất vô cơ trong khi sử dụng nguồn cacbon là các hợp chất hữu cơ-sản phẩm trung gian của quá trình dị hóa trong hô hấp và lên men

Nguồn nito nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của các axit hữu cơ và

vô cơ, đó là muối amoni sulfat, phosphat [2]

2.4.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men P là nguyên tố được quan tâm trước, sau đó là K, Mg, S,…Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào như acid nucleoproteit, acid nucleic, phospholipid, Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin và là nhóm phụ của (-SH) của một số enzyme CoA Môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn lưu huỳnh và amon Các ion kali, canxi, magie cũng cấn có trong môi trường nuôi cây, thông thường được bổ sung cùng với muối phosphate hoặc sulphate, còn ion Ca2+ và Mg2+ có trong nước sinh hoạt [2]

2.4.4 Dinh dưỡng chất sinh trưởng

Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazo purin và pyrimidin Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B, ngoài ra còn cần các sắc tố đỏ là tiamin, và còn có cả axit paraaminobenzic

Hàm lượng tối thiểu của vitamin cần cho sự phát triển bình thường của nấm men trong môi trường tổng hợp là: vitamin H 0,0001; vitamin B8 5; vitamin B30,25; vitamin B1 1; vitamin B5 0,5 (g/ml) [2]

2.5 Hình thức sinh sản

2.5.1 Sinh sản bằng hình thức nảy chồi

Đầu tiên hạch dày ra rồi bắt đầu thắt lại ở chính giữa Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ đồng thời một phần nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con Chồi con lớn dần,

khi chồi con gần bằng chồi mẹ, nó được tách ra và sống độc lập Một tế bào mẹ tạo một lúc được một, hai hay nhiều chồi con Sự sắp xếp chồi con trên tế bào cung không nhất thiết ở một nơi nhất định Ở nơi chồi con đã được tách ra khỏi tế bào

mẹ sẽ không bao giờ tạo thành một chồi con mới mà nó sẽ tạo ra một vết sẹo Thời gian cần thiết kể từ lúc chồi mới hình thành tới lúc tế bào này phát triển và bắt đầu tạo chồi mới gọi là chu kì phát triển của nấm men

Hình 2.3: Sự sinh sản bằng hình thức nảy chồi [11]

Hình 2.4: Chu kì nảy chồi của nấm men [11]

Đối với nấm men, cũng như đối với tất cả các sinh vật nhân chuẩn khác, chu

kỳ tế bào có thể được chia thành bốn pha: G1, S, G2 và M Pha S và M là thời kỳ khi DNA sao chép và phân chia hạt nhân, và kiểm soát toàn bộ quá trình phân chia

tế bào Xen giữa pha DNA sao chép và phân chia hạt nhân là hai pha G1 và G2, có

chiều dài biến đổi, trong đó các bào quan tế bào phát triển bình thường Pha G1 đại diện cho thời kỳ sau khi tế bào đơn đã tách ra tế bào mẹ, và ngay trước khi bắt đầu quá trình phân chia Ngay sau khi sự tổng hợp DNA đã được hoàn thành, theo định nghĩa, tế bào bước vào giai đoạn G2 Việc kiểm soát trong chu kỳ tế bào, gọi là 'START', diễn ra vào cuối giai đoạn G1, và buộc một tế bào để trải qua phân chia Sau khi bắt đầu START, yếu tố môi trường, chẳng hạn như áp lực bên ngoài và môi trường nghèo chất dinh dưỡng, làm cho tế bào phân chia Sau khi hoàn thành giai đoạn START, tế bào phát triển vượt quá mức kích thước tối thiểu, tế bào sẽ tiến hành tổng hợp DNA và sự chuyển sang pha S Sau khi hoàn thành DNA đã được tổng hợp và tế bào chuyển sang pha S, chồi bắt đầu phát triển , nhân của tế bào cũng nhân lên trong pha M Giai đoạn cuối cùng là tế bào phân chia, chồi tách ra, tạo thành tế bào mẹ và tế bào con [11]

2.5.2 Sinh sản bằng bào tử

Đối với giống nấm men Saccharomyces cerevisia, tế bào sinh dưỡng đơn bội

sinh sản theo cách nảy chồi Sau đó hai tế bào kết hợp với nhau xảy ra quá trình giao chất và giao nhân tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội Tế bào này chuyển thành bào tử túi Nhân phân cắt giảm nhiễm sinh ra bốn bào tử túi rồi chuyển thành

tế bào dinh dưỡng và tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chồi [1]

Hình 2.5: Vòng đời sinh sản của Saccharomyces cerevisiae

CHƯƠNG 3: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH NẤM MEN

3.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật được định nghĩa là kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào nguyên vẹn vào một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn Hiện tượng cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên khi các tế bào có thể phát triển trên bề mặt và bên trong các cấu trúc tự nhiên [22]

Cố định tế bào còn được định nghĩa là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan trong nước, tế bào sau khi sử dụng có thể được tái sử dụng nhiều lần, không bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong muốn [2]

3.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất mang có nguồn gốc vô cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng Chất mang có nguồn gốc thiên nhiên thích hợp chất đối với các ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, vừa sạch, không cần phải xử lý như gỗ, mạt cưa, miếng trái cây,…Mặt khác các vật liệu hữu cơ được tổng hợp hay chiết xuất từ các nguồn vật liệu gốc thiên nhiên thì không cần chú ý tới vấn đề tinh sạch không [3]

 Điều kiện lựa chọn chất mang:

 Lựa chọn chất mang phải rẽ

 Có tính chất cơ lý bền vững nên chịu được khuấy trộn, áp lực

 Hóa học: chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng

 Kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

 Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học

 Cố định vi sinh vật dễ dàng

 Có thể sử dụng nhiều lần

 An toàn cho môi trường sống

 Độ trương tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Làm tăng khả năng cố định

vi sinh vật vừa tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme và số lần tái sử dụng

 Chất mang có cấu trúc siêu lỗ

3.2.1 Chất mang hữu cơ [3]

3.2.1.1 Chất mang hữu cơ tự nhiên

Chất mang là polysaccharide: là nhóm chất mang đang rất thịnh hành và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran và các dẫn xuất của chúng

 Cellulose

Cellulose được sử dụng rất rộng rãi làm chất mang để cố định tế bào

Cellulose là thành phần cấu tạo chủ yếu của các vật liệu như sau: rơm, bã mía, dăm bào, trấu, mạt cưa,… Đây là nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền ở Việt Nam

Các cellucose là một loại homopolyme của glucose Các gốc glucose được nối kết với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan Mức độ polymer hóa của phân tử cellulose thay đổi nhiều, trung bình là 3000 Tùy theo từng loại thực vật mà các phân tữ cellulose có khối lượng phân tử khác nhau rất nhiều ( từ 50000 đến 2500000) Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Ronghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo sợi Các sợi này liên kết thành các bó nhỏ người ta gọi là microfibrin co cấu trúc không đồng nhất Chúng có những phần đặc ( phần kết tinh)

β-D-và những phần xốp hơn ( phần vô định hình) Cellulose là một trong các hợp chất

tự nhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ bị phồng lên do hấp thụ nước Cellulose bị phân hủy khi đốt nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao

Cellulose cũng bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc ở nhiệt độ 40-50C nhờ các enzyme phân hủy cellulose gọi là cellulose

Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM-cellulose, DEAE- cellulose có tính chất cơ lý khá bền vững nhưng lại không đồng nhất nên thường chỉ sử dụng ở dạng sợi và vi hạt

 Collagen

Collagen là chất mang thích hợp cho quá trình cố định tế bào ở điều kiện

“nhẹ nhàng” Collagen là protein sợi do các mô liên kết ở cơ thể động vật Collagen

ưa nước, do vậy trong dung dịch nước nó nở rất mạnh và khi ấy nó dễ bị cải biến

do sự thay đổi tương quan tỷ lệ giữa các gốc ưa nước và kỵ nước, chính các tính chất này đã làm nó trở thành chất mang thuận tiện cho quá trình cố định

 Agarose

Agarose được thu nhận từ rong biển, nó cũng có thể đóng vai trò làm chất mang cho tế bào cố định do nó là vật liệu đồng nhất, ổn định và dễ tạo hạt Tuy nhiên nó rất ít được sử dụng trong thực tế vì độ bền cơ học thấp ngoài ra còn vấn đề giá cả do đó agarose thường chỉ được sử dụng trong phòng thí nghiệm

 Agrinate, carrageenan

Là hai vật liệu khá mới mẻ Cả hai vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào và enzyme Tuy nhiên hai loại vật liệu này có một nhược điểm chung là không ổn định trong môi trường có phosphate

 Chitin và chitosan

Là một vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định tế bào và cả enzyme Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ hai sau cellulose, là một polymer của 2-acetomido-deoxy-β-D-glucose Chitin tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật Chitosan là dẫn xuất củ chitin khi xử lý bằng kiềm đặc Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tố, tính chất cơ lý bền vững, ổn định

3.2.1.2 Chất mang hữu cơ tổng hợp

Hiện nay có rất nhiểu polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định như polyacrylamide , polyester, polyhydroxyethylmethacrylate, … ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ…Tuy nhiên polymer tổng hợp cũng bộc lộ những nhược điểm nhất định như một số có giá thành cao như polyacrylamide, polyhydroxyethylacrylate có

khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm nữa là do quá bền vững, không thể phân hủy trong tự nhiên vì vậy gây ô nhiễm môi trường Đây là một vấn

đề quan trọng đặt ra đòi hỏi con người cần quan tâm và giải quyết

 Polyacrylamide

Là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước của lỗ gel có thể điều chỉnh được và diện tích tiếp xúc bể mặt lớn Đây cũng là đối tượng đầu tiên được sử dụng làm chất mang cố định tế bào vi sinh vật

 Polyhydroethylmethacrylate (PHEMA)

PHEMA là một loại vật liệu hydrogel, nó được chế tạo từ monomer hydroethylmethacrylate (HEMA) Ngoài phương pháp polymer hóa thông thường dùng chất khơi mào hóa học, nó còn được polymer hóa bằng phương pháp polymer hóa bức xạ

PHEMA có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như trong y học, làm giá thể thải chậm dược phẩm, nội tiết tố trong điều trị làm contact lens, làm vật liệu sụn,

mô nhân tạo,…Nhưng để làm giá thể trong việc cố định thì PHEMA được chế tạo bằng kỹ thuật polymer hóa bức xạ nhiệt độ thấp ( -78C)

PHEMA khi được điều chế bằng phương pháp này thì có cấu trúc mạng lưới, mềm xốp, màu trắng đục, với nồng độ HEMA <80% ( nồng độ monomer càng nhỏ thì kích thước lỗ cảng lớn) Nếu trên nồng độ này thì vật liệu cứng, màu trong suốt như thủy tinh nhưng trở thành trạng thái mềm dẻo hơn khi trương trong nước

Độ trương nước bão hòa của PHEMA giảm dần khi tăng nồng độ HEMA

3.2.2 Chất mang vô cơ [3]

3.2.2.1 Chất mang vô cơ tự nhiên

Zeolit: Là các Aluminosilicate có cấu trúc tinh thể theo không gian 3 chiều, hình thành các cửa sổ và các lỗ xốp có kích cỡ phân tử

Yếu tố quyết định hiệu quả hấp phụ của vi sinh vật trên các chất mang

silicate và zeolit là mật độ các nhóm hoạt hóa ở trên bề mặt cao cho phép gắn các phân tử protein thông qua các liên kết hydrogen hoặc các tương tác tĩnh điện

3.2.2.2 Chất mang vô cơ tổng hợp

Các chất mang vô cơ có nguồn gốc là đất kiềm thổ, Al2O3, TiO2, cũng được

sử dụng để gắn vi sinh vật, ví dụ như thủy tinh xốp, silicagel và silochrom Các vật liệu này có ưu điểm là chúng có khả năng thay đổi độ xốp lớn và có khả năng hấp phụ cao đối với phần lớn protein Một trong những chất mang phổ biến nhất hiện nay là silochrom đã được amine hóa Ngoài ra, ceramic có độ xốp điều chỉnh được

và có chứa các ion kim loại trong thành phần của nó cũng có một triển vọng to lớn

Đôi khi, người ta sử dụng các hydroxide kim loại Ở đây, tương tác giữa tế bào và chất mang là nhỏ nhất, do vậy làm tăng khả năng sống sót của tế bào Trong

số các hydroxide thì loại hydroxide titanium và zirconium là được nghiên cứu kỹ lưỡng hơn cả

3.3 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật

Việc ứng dụng kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật cho các quy trình sinh học rất thuận lợi, do đó nhiều kỹ thuật và vật liệu cố định đã được đề xuất Những kỹ thuật này có thể được chia thành bốn nhóm chính, dựa trên cơ chế vật lý của việc gắn tế bào vi sinh vật với chất mang [22]

Hình 3.1: Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật [22]

3.3.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang

Tế bào cố định trên chất mang rắn được thực hiện bởi hiện tượng hấp phụ vật lý dựa trên lực tương tác tĩnh điện hoặc bằng liên kết cộng hóa trị giữa màng tế bào và chất mang Chiều dày hấp phụ chỉ khoảng một lớp tế bào đến 1mm hoặc hơn nữa Phương pháp sử dụng tế bào nấm men cố định trên bề mặt khá phổ biến

do tương đối dễ thực hiện phương pháp cố định này Do không có rào cản giữa các

tế bào và môi trường, do đó tế bào có thể tách rời và di chuyển vào môi trường

3.3.1.1 Gắn tế bào bằng phương pháp cộng hóa trị

 Định nghĩa: Bản chất của liên kết cộng hóa trị là nối giữa tế bào vi sinh

vật thông qua “cầu nối” Cầu nối này có kích thước không lớn lắm, và có hai đầu, một đầu nối polymer và một đầu nối tế bào

 Cách tiến hành:

Theo một giai đoạn: Chất mang có khả năng liên kết trực tiếp với tế bào Việc gắn sẽ hiệu quả hơn nếu diện tích tiếp xúc của tế bào và chất mang có dấu ngược nhau

Theo hai giai đoạn: Trước tiên là hoạt hóa chất mang, sau đó thực hiện liên kết giống trên

 Chất mang: sử dụng để cố định tế bào vi sinh vật đối với phương pháp

3.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel

Trong phương pháp cố định này, các tế bào đi vào trong cấu trúc của vật liệu làm chất mang Polymer tạo thành màng bao bọc xung quanh tế bào Mạng lưới này

có lỗ nhỏ tới múc đủ để tế bào không chui ra ngoài, nhưng vẫn đủ lớn để vận chuyển cơ chất và sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra vào

Ví dụ đặc trưng phương pháp cố định này là nhốt trong gel polysaccharide như alginates, k-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid hoặc các polymer khác như gelatin, collagen, polyvinyl ethnol Tế bào phát triển trong chất mang cũng có những hạn chế về khả năng khuếch tán của vật liệu

 Các loại gel cơ bản:

- Ion gel: là một loại gel mà mạng lưới được tạo thành từ những phân tử polymer gắn với nhau bằng liên kết ion Để tạo gel chứa tê 1 bào vi sinh vật

- Covalent gel: loại gel này cũng do các phân tử polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

- Non-covalent gel: các phân tử polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị và liên kết hydro

- Cryogel: là cấu trúc gel polymer mới được tạo ra bằng phương pháp lạnh đông các tiền polymer có phân tử lượng thấp và cao

Để gói tế bào vi sinh vật vào trong khuôn gel, người ta tiến hành thanh trùng, hợp hóa trong gel khi có mặt đồng thời tế bào vi sinh vật Sau khi hoàn thành, tế bào vi sinh vật bị giữ chắc trong gel Các tế bào vi sinh vật được gói theo kiểu này thường phân bố không đều Thông thường chỉ những tế bào vi sinh vật ở gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất

3.3.3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang

 Phương pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật:

 Định nghĩa: Các tế bào liên kết với nhau thành một khối tế bào Sự liên

kết giữa các tế bào được xem như một phương pháp cố định tế bào do sự kết tụ lại của các tế bào làm cho chúng có thể được sử dụng trong các thiết bị phản ứng Phương pháp này được xem xét là có thể xảy ra ở các loại nấm men, nấm mốc và tế

bào thực vật Sự kết tụ của các tế bào nấm men là một ứng dụng quan trọng trong ngành sản xuất rượu vang do sự ảnh hưởng tới quá trình lên men và tách tế bào nấm men ra khỏi sản phẩm Sự liên kết giữa các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisia có ứng dụng quan trọng vào ngành công nghiệp sản xuất thức uống có

cồn

 Tác nhân liên kết:glutaraldehyde, toluene diisocyanate, hexamethylence

 Vai trò của tác nhân:

- Có tính thẩm thấu nhanh chóng vào tế bào vi sinh vật

- Nước được liên kết với thành tế bào vi sinh vật

 Phương pháp cố định bằng màng chắn membrane (màng lọc)

 Định nghĩa: Tế bào được chứa trong một lớp màng lọc hoặc trong vi

bao Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật này thích hợp khi hoạt động trao đổi chất ít xảy ra Kỹ thuật cố định vi sinh vật bằng vi bao đã được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là vào ngành sản xuất rượu, một ví dụ là sản phẩm “Milispark”, được nâng cao từ “Milipore” Một nhược điểm của phương pháp cố định tế bào bằng phương pháp vi bao là sự hạn chế của hoạt động trao đổi chất và có thể bị tắc ngẻn do tế bào tăng trưởng Ngoài ra còn có nhược điểm là chuyên biệt đối với mỗi loại vi sinh vật

 Yêu cầu của tế bào vi sinh vật cố định:

- Các chất mang thích hợp cho cố định tế bào được sử dụng trong ngành sản xuất thức uống có cồn cần phải đạt những yêu cầu sau:

- Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn, và phải có vị trí cho tế bào vi sinh vật bám vào

- Chất mang phải dễ dàng xử lý và có thể tái sử dụng được

- Số tế bào còn sống và sự ổn định của chất xúc tác sinh học phải cao và duy trì trong thời gian dài

- Các hoạt động sinh học của tế bào cố định không bị ảnh hưởng bất lợi bởi quá trình cố định tế bào Các lỗ xốp của chất mang phải thống nhất và kiểm soát, cho phép sự tự do trao đổi các cơ chất, sản phẩm, cofactor và khí Vật liệu làm chất mang phải ổn định, không dễ dàng bị phân hủy bởi các tác nhân hóa học,

nhiệt, sinh học, không bị xúc tác bởi các enzyme, dung môi, áp lực Chất mang và phương pháp cố định phải đơn giản, dễ dàng, hiệu quả về chi phí

- Chất mang phải an toàn về mặt thực phẩm, không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm nếu như còn sót lại

 Ưu nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào [5] 1- Hấp phụ lên bề mặt rắn:

 Ưu điểm:

- Quá trình thực hiện đơn giản

- Điều kiện nhẹ nhàng nên đảm bảo khả năng sống của tế bào

 Nhược điểm:

- Tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hoặc khi thay đổi môi trường

- Số lượng tế bào cố định thường thấp

- Quá trình cố định thụ động khó điều khiển

2- Liên kết cộng hóa trị với chất mang

 Ưu điểm:

- Khả năng trao đổi chất cao

- Độ bền liên kết giữa tế bào và chất mang tốt

 Nhược điểm:

- Thường ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào

- Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù

3- Liên kết giữa các tế bào

- Cản trở sự trao đổi chất của tế bào

- Có thể ảnh hưởng đến hoạt tính tế bào

3.4 Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do

- Tăng hấp thu cơ chất và cải thiện năng suất

- Có khả năng lên men liên tục

- Tăng sức chịu đựng với nồng độ cơ chất cao, giảm sự ức chế của sản phẩm cuối

- Có khả năng lên men nhiệt độ thấp nâng cao chất lượng sản phẩm

- Sản phẩm được thu hồi dễ dàng hơn do giảm bớt quá trình tách chiết và lọc do đó làm giảm chi phí yêu cầu về thiết bị và năng lượng

- Có khả năng tái sử dụng trong quá trình lên men mà không cần loại bỏ khỏi môi trường

- Giảm khả năng nhiểm vi khuẩn do mật độ tế bào cao và quá trình lên men

- Có khả năng sử dụng các thiết bị phản ứng đơn giản, nhỏ do đó làm giảm chi phí

- Giảm thời gian tạo thành sản phẩm

Những ưu điểm ở trên được rút ra từ những nghiên cứu về các phương pháp

cố định và ứng dụng của nó vào sản xuất các thức uống có cồn như rượu vang, bia,

và cồn uống được [5]

3.4.2 Nhược điểm:

- Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do

- Trong môi trường phản ứng, không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào

ra khỏi chất mang

- Cơ chất muốn vào trong tế bào để trao đổi chất tạo thành sản phẩm phải qua chất mang Vì thế phải lựa chọn chất mang phù hợp với kỹ thuật cố định để làm giảm trở lực của quá trình thẩm thấu vào ra của sản phẩm [5]

3.5 Giới thiệu chất mang trái táo và phương pháp cố định trên chất mang táo

3.5.1 Trái táo

3.5.1.1 Giới thiệu

Trái táo, tên khoa học Malus domestica, là một loại trái cây khá phổ biến,

được trồng ở các vùng địa lý giữa vĩ độ 30 và 60 ở cả bắc bán câu và nam bán cầu Táo thuộc họ Rosacea Chúng thích nghi tốt với khí hậu ôn đới, những nơi mà có ít nhất 2 tháng khí hậu lạnh Việc ra quả bắt đầu vào cuối mùa xuân, khi cây bắt đầu

ra hoa nhìn giống như bông hồng nhỏ Hoa tạo thành phấn hoa và mật hoa hấp hẫn ong và những loại côn trùng khác thụ phấn cho hoa, trái chin trong khoảng 140-170 ngày Một cây táo có thể cho trái từ 6-8 năm Do những thuận lợi trong sản xuất, bảo quản, phát triển sản phẩm, giá trị thương mại nên trái táo được sử dụng phổ biến vào công nghiệp sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp sản xuất rượu

Cây táo cao khoảng 3-12 m, tán rộng và rậm Đến thu cây rụng lá Lá táo

hình bầu dục, rộng 3-6 cm, dài 5-12 cm; đầu lá thắt nhọn với cuống lá (petiole)

khoảng 2-5 cm Rìa lá dạng răng cưa

Hoa táo nở vào mùa xuân cùng lúc khi mầm lá nhú Hoa sắc trắng, có khi pha chút màu hồng rồi phai dần Hoa có năm cánh, đường kính 2,5-3,5 cm Trái chín vào mùa thu và thường có đường kính cỡ 5-9 cm.Ruột táo bổ ra có năm "múi" (carpel) chia thành ngôi sao năm cánh Mỗi múi có 1-3 hột [26]

Braeburn Golden Delicious Granny Smith

Hình 3.2: Các loại táo được dùng để sản xuất rượu vang

Mặc dù nhiều giống táo đều có thể được thu hoạch trong tháng 8 và đầu tháng 9, nhưng phần lớn táo ở Mỹ đều được thu hoạch vào cuối tháng 9 và suốt tháng 10 Táo phải được bảo quản ở nhiệt độ 0C hoặc -1C với độ ẩm từ 92-95% thì giữ được trong một thời gian ngắn Với điều kiện bảo quản thích hợp, sau khi thu hoạch táo có thể để được 12 tháng

Táo được trồng nhiều ở các nước ôn đới, khả năng thích nghi của chúng khá cao, từ những nới có khí hậu khắc nghiệt như Siberia, bắc Trung Quốc cho đến những vùng có khí hậu ấm như Columbia và Indonesia Có trên 60 quốc gia trên thế giới sản xuất trên 1000 tấn mỗi năm như Trung Quốc, Mỹ, Thổ Nhĩ Kỳ, Iran, Pháp, Ý, Ba Lan và Nga, …Trái táo là một trong những loại trái cây có sản lượng dẫn đầu trên thế giới Theo Food and Agriculture Organization (FAO), tổng sản lượng của trái táo trên thế giới vào năm 2004 ước tính khoảng 57 triệu tấn, và Hoa

Kì và Trung Quốc dẫn đầu về sản lượng vào khoảng 36% và 7% sản lượng của thế giới

Bảng 3.1: Sản lượng táo (theo tấn) ở các quốc gia trên thế giới [25]

Táo chứa khoảng 85% nước, 12-14% carbohydrate, khoảng 0,3% protein, chất béo < 0,1%, chất khoáng và vitamin Thành phần này còn thay đổi tùy theo giống, vị trí trồng trọt, điều kiện khí hậu, thời điểm thu hoạch [25]

Mùi thơm và vị ngon của từng loại táo rất khác nhau, còn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu trồng trọt, các biến đổi, chuyển hóa trong quá trình chín, bảo quản,…Các chất tạo mùi có trong trái táo chủ yếu là ethyl acetate, ethyl propionate, propyl acetate , 2-methyl butyl acetate, butyl isomyl, hexyl hexanoates,…

3.5.1.3 Cấu tạo tế bào thịt quả

Trong các thành phần của trái táo đã kể trên thì carbohydrate đóng vai trò là quan trọng, chiếm khoảng 15% hàm lượng chất khô, gồm tinh bột, các loại đường, pectin, cellulose và hemicelluloses Khoảng 80% lượng carbohydrate trong trái táo

là đường sucrose (khoảng 2%), glucose (2,4%), và fructose ( 6,0%) Tổng chất xơ khoảng 2%, và 0,2% sorbitol có trong nước táo Hàm lượng acid malic có trong táo

là 0,3-1,0% [26] Còn pectin chiếm khoảng 0,5- 1,6% [13] Các hàm lượng này khác nhau tùy thuộc vào giống táo

Hình 3.3: Cấu tạo thịt quả [30]

Thành tế bào của trái táo gồm có các thành phần sau: bộ khung cellulose và hemicelluloses được bao bọc bởi pectin Chúng được mô tả bởi mô hình của Carpital và Gibeaut: thành tế bào thực vật gồm 3 cấu trúc chính độc lập nhưng tương tác lẫn nhau Cấu trúc 1: bộ khung cellulose và xyloglucan (chiếm 50% trọng lượng khô) được bao bọc xung quanh bởi lớp cấu trúc thứ 2 là polysaccharide peptin (chiếm 25-40% trọng lượng khô Cấu trúc 3 là cấu trúc độc lập của protein

(extension_chiếm khoảng 1%) Đối với thành của trái táo, chủ yếu là cellulose chiếm 25-30% trọng lượng khô), pectin chiếm 25-30% và fucogalactoxyloglucan chiếm 15-20%, còn protein ước tính khoảng < 2% [9, 10]

 Cellulose:

Cellulose là một polymer mạch thẳng, gồm nhiều phân tử đường D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid Liên kết glucoside giúp sợi khó cắt,

và vì phân tử glucose định hướng thành dạng trans với phân tử glucose bên cạnh

nên không tạo liên kết với nước, không tan trong nước

Ngoài ra có sự hình thành liên kết hydro nội phân tử, làm cellulose cứng và dai Và chính liên kết hydro giữa các mạch cellulose cạnh nhau giúp định hình thành bó sợi song song

Hình 3.4: Cấu trúc cellulose trong thịt quả [31]

Cấu trúc cellulose không đồng nhất nên tồn tại vùng vô định hình và vùng kết tinh Vùng vô định hình ít hơn vùng kết tinh Vùng kết tinh có trật tự cao, khó

bị phá hủy bởi enzym cellulase, hóa chất dung môi, đây là vùng mà các vi sợi được định hướng Vùng vô định hình thì cấu trúc hỗn độn, nằm lẫn với vùng kết tinh, dễ

bị thủy phân

Các vi sợi trong tế bào tập trung thành phiến mỏng, giữ các vi sợi là lignin

và glycan liên kết ngang với nhau gọi là hemicellulose

 Hemicelluloses:

Là một polusaccharide có thể tan trong kiềm và acid Công thức phân tử (C5H8O4)n , có cấu tạo phức tạp do 50 – 200 phân tử đường tạo nên Các đường tạo nên hemicellulose là pentose (arabinose, xylose), hexose (galactose, glucose, mannose) Trong đó nhiều nhất là xylose Xylan được cấu tạo từ D – glucose liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 glycoside

Hemicellulose là một polymer phân nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên, vô định hình Mạch nhánh có cấu trúc đơn giản là disaccharide hoặc trisaccharide Hemicellulose liên kết với các polysaccharide khác và lignin nhờ các nhánh này

Hình 3.5: Cấu trúc của hemicelluloses [32]

 Pectin:

Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin

Pectin là hợp chất cao phân tử polygalactoronic có đơn phân tử là galactoronic và rượu metylic Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC Hàm lượng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60 % đường và điều chỉnh pH môi trường từ 3,1-3,4 sản phẩm sẽ tạo đông

Cấu tạo phân tử pectin là một dẫn suất của acid pectic, acid pectic là một polymer của acid D-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết 1-4-glycozide

Hình 3.6: Cấu tạo pectin [33]

3.5.2 Phương pháp cố định trên táo

Sử dụng tế bào cố định trong lên men rượu là lãnh vực nghiên cứu hấp dẫn,

và được mở rộng nhanh chóng bởi kỹ thuật dễ và những ưu điểm về kinh tế so sánh với sử dụng tế bào tự do Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp sản xuất rượu, vấn

đề nghiên cứu tế bào cố định cần phải tiến hành trên các chất mang an toàn trong thực phẩm, rẻ, có sẳn trong tự nhiên, thích hợp cho quá trình lên men nhiệt độ thấp

và cải thiện được mùi vị của sản phẩm Trong sản xuất rượu, quá trình lên men ở nhiệt độ thấp cho chất lượng sản phẩm cao hơn Nhiều nghiên cứu đã đề nghị nhiều chất mang cho tế bào cố định trong công nghiệp sản xuất rượu Tuy nhiên, những chất mang này không thuận tiện trong sản xuất rượu bởi chúng là các vật liệu vô

cơ Alginate và cellulose là các chất mang thay thế mới, được cho là hữu hiệu cho quá trình lên men cồn nhiệt độ thấp

Rượu táo được sản xuất từ nước ép táo Loại thức uống này có hương vị thơm ngon Do đó, việc ứng dụng táo làm chất mang cố định rất có tiềm năng Đây

là chất mang an toàn trong thực phẩm, có sẵn trong tự nhiên, sản lượng táo hằng năm rất lớn, do đó việc sử dung táo như là một chất mang cố định sẽ tạo ra các sản phẩm có mùi vị ngon do có sự tách các cấu tử thơm trong táo vào rượu

Một số nghiên cứu về việc cố định nấm men trong sản xuất rượu vang đã tiến hành trong những năm gần đây Và đưa ra phương pháp cố định như sau:

 Chuẩn bị nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần chủng sau khi được phân lập

được nuôi trong môi trường: 4% glucose, 0,1% (NH4)2SO4, 0,15% KH2PO4 và 0,5% MgSO4 Sau đó ly tâm thu sinh khối nấm men [20s]

 Chuẩn bị chất mang

Để cố định tế bào vi sinh vật với chất mang là táo, đầu tiên táo sẽ được cắt thành miếng nhỏ (có thể hình khối lập phương 1cm) Các miếng táo nhỏ sẽ được đặt trong một cốc thủy tinh hình trụ 1l [20]

Miếng táo sau khi được cắt sẽ được đem đi tiệt trùng trước khi cố định nấm men, có 2 phương pháp:

- Xử lý nhiệt

- Hóa học: cồn, H2O2 hoặc SO2, …

Trong trường hợp này ta không sử dụng phương pháp nhiệt được để tránh làm phá hủy bộ khung cấu trúc cellulose của miếng táo Do đó áp dụng phương pháp tiệt trùng bằng hóa chất Mục đích là đảm bảo chất mang an toàn, không nhiểm các vi khuẩn gây ức chế sự sinh trưởng của nấm men

 Phương pháp cố định

Bổ sung môi trường lên men vào cốc thủy tinh có chứa táo Môi trường lên men gồm 12% glucose, 0,4 % cao nấm men, 0,1% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4 trong nước cất và pH đạt 5,6 Không cần điều chỉnh pH

Sau đó sinh khối nấm men đã qua xử lý như trên sẽ được bổ sung vào cốc thủy tinh và cho lên men, thời gian lên men khoảng 8-12 giờ Hỗn hợp lên men đó

sẽ được lọc gạn và chất mang sẽ được rửa hai lần với dịch nho đã được chuẩn bị cho quá trình lên men rượu

Phương pháp cố định nấm men trên miếng táo chủ yếu là do lực hấp phụ của

tế bào nấm men lên bề mặt miếng táo Các liên kết hình thành chủ yếu như sau:

- Liên kết hydro

- Liên kết Van der Waals

Ngoài tạo liên kết và hấp phụ trên bề mặt miếng táo, tế bào nấm men còn có khả năng cố định trên miếng táo bằng cách chui vào mạng cellulose, cấu trúc của tế bào táo [20] Do bản chất chất mang táo có chứa hàm lượng glucose, là thành phần dinh dưỡng của nấm men, nên ngoài việc sử dụng nguồn glucose trong môi trường,