polyphenol và hoạt độ ức chế 1 số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang và 1 số cây thuốc khác

polyphenol và hoạt độ ức chế 1 số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang và 1 số cây thuốc khác

Đại học quốc gia hà nội

Trờng đại học khoa học tự nhiên

-Nguyễn Minh Thắng

Polyphenol và hoạt độ ức chế một số serine

proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia

sappan L.) và một số cây thuốc khác

Luận văn thạc sĩ khoa học

Hà Nội – Năm 2009

Đại học quốc gia hà nội

Trờng đại học khoa học tự nhiên

-Nguyễn Minh Thắng

Polyphenol và hoạt độ ức chế một số serine

proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia

sappan L.) và một số cây thuốc khác

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Lời cảm ơn

Để có thể hoàn thành luận văn này, trớc tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết

ơn sâu sắc tới GS TSKH Phạm Thị Trân Châu, Viện Vi sinh vật và Công nghệSinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã định hớng nghiên cứu, trực tiếp hớng dẫn

và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Tôi cũng mong muốn đợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh

đạo và cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất giúp tôi hoànthành nghiên cứu này

Qua đây, tôi muốn đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy côgiáo Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã giúp đỡ và trang bị những kiếnthức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trờng

Tôi cũng xin đợc cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, ờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Tr-Đề tài luận văn đợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài NCCB621306

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, nhữngngời đã luôn cổ vũ, động viên tôi vợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập

và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2009

Học viên

Nguyễn Minh Thắng

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

IU §¬n vÞ øc chÕ

Mục lục

Mở đầu 1

Chơng 1 Tổng quan tài liệu 2

1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh 2

1.1.1 Các hợp chất phenol 3

1.1.2 Flavonoid 5

1.1.3 Tannin 9

1.2 Proteinase và các chất ức chế proteinase 10

1.2.1 Sơ lợc về proteinase 11

1.2.2 Proteinase serine 12

1.2.2.1 Proteinase serine 12

1.2.2.2 Protease của Pseudomonas aeruginosa 13

1.4.2.3 Các chất ức chế proteinase 15

1.3 Tơng tác của flavonoid với các protein enzyme 16

1.3.1 Các lực tơng tác phân tử trong phức chất protein-flavonoid 17

1.3.2 Tính đặc hiệu của tơng tác protein-flavonoid 18

1.5.3 ảnh hởng của các flavonoid với sự thuỷ phân protein 19

1.4 Cây thuốc việt nam và khả năng chữa các bệnh viêm nhiễm mụn nhọt, mẩn ngứa 20

1.4.1 Sơ lợc về các bệnh viêm nhiễm mụn nhọt, mẩn ngứa 20

1.4.2 Cây gỗ Vang (Tô mộc) 21

1.4.2.1 Đặc điểm phân loại, phân bố, thành phần hóa học và công dụng 21

1.4.2.2 Các nghiên cứu trên thế giới 22

1.4.2.3 Các nghiên cứu tại Việt Nam 23

Chơng 2 NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 25

2.1 Nguyên liệu 25

2.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 25

2.3 Phơng pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Sử lý mẫu 25

2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần 26

2.3.3 Định lợng polyphenol theo phơng pháp Folin-Ciocalteau 26

2.3.4 Sắc ký phân chia các thành phần polyphenol 27

2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase 29

2.3.6 Điện di proteinase trên gel polyacrylamide 32

2.3.7 Sắc ký cột silicagel 33

2.3.8 Quang phổ hấp thụ tử ngoại 33

Chơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 34

3.1 Hàm lợng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase ở một số cây thuốc 34

3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu 34

3.1.2 Hàm lợng polyphenol tổng số và flavonoid trong dịch chiết ethanol 38

3.1.3 Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid 40 3.2 Định tính các thành phần polyphenol và flavonoid trong một số cây thuốc 43

3.2.1 Sắc ký dịch chiết flavonoid các mẫu nghiên cứu 43

3.2.2 Sắc ký các thành phần polyphenol mẫu Tô mộc trên bản mỏng 44

3.3 Thăm dò PIA của các băng polyphenol sau khi sắc ký bản mỏng 45

3.3.1 PIA các băng flavonoid mẫu Đại hoàng 46

3.3.2 PIA các băng flavonoid các mẫu Tô mộc 47

3.4 Hàm lợng tannin của các mẫu Tô mộc 49

3.5 Thăm dò PIA bằng phơng pháp điện di Proteinase trên gel polyacrylamide 49

3.5.1 Hoạt độ phân giải proteinase của P aeruginosa và S aureus 49

3.5.2 Nghiên cứu PIA bằng phơng pháp điện di 51

3.6 Hoạt tính kháng khuẩn các mẫu Tô mộc 52

3.7 Phân chia các thành phần flavonoid mẫu gỗ tô mộc trên cột silicagel 53

Kết luận 57

Tài Liệu Tham Khảo 60

Mở đầu

Các enzyme thủy phân protein có vai trò vô cùng quan trọng trong toàn

bộ sinh giới, hiện nay số chuỗi polypeptide có hoạt tính thuỷ phân protein đãbiết lên hơn 140.000 [50] Tuy nhiên các enzyme này cũng có liên quan đếnrất nhiều bệnh ở ngời nh các bệnh viêm nhiễm, ung th, tim mạch … Theothống kê, có tới 80 bệnh di truyền khác nhau ở ngời có nguyên nhân là do độtbiến các gene mã hóa các protease [72], sự di căn của ung th cũng có sự thamgia của các protease [51] Các enzyme thuỷ phân cũng tham gia tích cực trongquá trình viêm và sự hình thành mụn nhọt ở ngời

Khả năng phân giải protein của các proteinase rất lớn nên cần có nhữngcơ chế điều hòa chặt chẽ, trải qua quá trình tiến hóa lâu dài đã xuất hiện nhiềucơ chế kiểm soát proteinase bao gồm điều hòa biểu hiện, quá trình tiết rangoài tế bào, hoạt hóa, phân hủy proteinase hoặc kìm hãm hoạt độ thủyphân protein của chúng Nói đến các chất kìm hãm proteinase, các nhà khoahọc thờng đề cập đến các PPI là các chất ức chế proteinase có bản chấtprotein, có các cấu trúc đặc trng Các PPI có mặt rộng rãi trong sinh giới từvirus, vi khuẩn cho tới động vật [49] Thực vật tạo ra PPI khi bị côn trùng tấncông, khi bị tổn thơng hay dới các điều kiện stress [19, 49] Tuy nhiên thựcvật còn có một cơ chế khác chống lại các tác nhân gây hại trên là hệ thống cácchất trao đổi thứ sinh, trong đó có các hợp chất phenol Các phenol này khôngnhững có hoạt tính kháng sinh mạnh mà còn có khả năng ức chế nhiều loạienzyme

Các chất thực vật thứ sinh có hoạt tính sinh học là thành phần chính cómặt trong các vị thuốc cổ truyền Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa các hợp chấtphenol từ thực vật và khả năng ức chế proteinase của một số cây thuốc chữa

mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Polyphenol và

hoạt độ ức chế serine-proteinase từ thân, hạt cây gỗ Vang (Caesalpinia

sappan L.) và một số cây thuốc khác

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

Các con đờng biến đổi và tổng hợp các chất dinh dỡng chủ yếu:carbohydrate, protein, chất béo và acid nucleic là thiết yếu và giống nhau ởmọi sinh vật ngoại trừ một số thay đổi rất nhỏ Quá trình thống nhất, và là nền

tảng của mọi sinh vật sống này đợc gọi là các quá trình trao đổi sơ cấp Trên

thực tế thực vật còn tổng hợp một lợng lớn các hợp chất hữu cơ không có vaitrò trực tiếp trong sinh trởng và phát triển của chúng, các hợp chất này đợc gọi

là hợp chất thứ sinh

Các hợp chất thứ sinh đợc phát hiện riêng lẻ ở từng nhóm, từng loàinhất định, thậm chí khác nhau ở từng cá thể, hàm lợng cũng thay đổi từngloài, từng cơ quan, bộ phận và điều kiện sinh thái của cây Chức năng và lợiích của các hợp chất này đối với thực vật phần lớn đã đợc chỉ ra nh: tham giabảo vệ cây, điều hòa sinh trởng, hấp dẫn côn trùng, thụ phấn, phát tán hạt tuy nhiên cũng còn có nhiều chức năng khác cha đợc biết đến [60]

Quá trình trao đổi thứ cấp này cung cấp phần lớn sản phẩm có giá trịtrong y dợc bởi vì các hợp chất thứ sinh thờng có hoạt tính sinh học nh: kíchthích hoặc ức chế sinh trởng, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kìm hãm sự pháttriển của các khối u

Trớc đây các hợp chất thứ sinh đã từng bị xem là những chất thải đơngiản trong trao đổi chất ở thực vật, ngày nay với những nghiên cứu mới ngời ta

đã xác định đợc khoảng 140.000 các hợp chất này, tìm ra con đờng trao đổichất có liên quan cũng nh các enzyme sản xuất và điều hòa các con đờng này.Tuy nhiên cho đến nay chỉ khoảng 20 - 30% tổng số các loài thực vật đợc đợcnghiên cứu về các hợp chất hóa sinh thực vật, do đó thực tế có thể có tới hơn200.000 hợp chất nh vậy [62]

Hợp chất thứ sinh có có 3 con đờng trao đổi chính [18]:

 Acid shikimic: phenol, lignin, alkaloid

 Acid mevalonic: terpen, steroid, alkaloid

 Deoxyxylulose: terpen, steroid, alkaloid

1.1.1 Các hợp chất phenol [11, 47]

Đây là nhóm hợp chất lớn nhất trong các hợp chất thứ sinh thực vật Cácnhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8.000 hợp chất phenol tự nhiên [24] Đặc

điểm cấu trúc chung của nhóm này là trong phân tử có vòng thơm (vòngbenzene) gắn trực tiếp với một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) Vì vậy chúng

là những rợu bậc bốn và đợc đặc trng bằng tính acid yếu

1.1.1.1 Phân loại

Dựa vào thành phần và cấu trúc của phenol, ngời ta chia chúng thành 3nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol Phân loại này

có 4 carbon

30]

Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chấtphenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân.Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng

Hình 1.1 Một số hợp chất phenol 1.1.1.2 Tính chất hoá học

Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhng do có nhữngthành phần cấu trúc chung nên chúng có một số tính chất chung:

 Phản ứng của nhóm hydroxyl

 Phản ứng phá vòng benzene

 Phản ứng tạo phức với kim loại

 Phản ứng este hoá

1.1.1.3 Vai trò của các hợp chất phenol trong thực vật

Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúngkhông thể lẩn trốn đợc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa họcnày Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tínhkháng khuẩn, kháng dinh dỡng của chúng

Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa

nh đỏ, xanh, tím…; đặc tính chống oxy hóa (antioxidant) hay tạo phức vớikim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữa phần ở trên cũng nh dới mặt đất,giữa các cây với các sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tửngoại (UV) từ mặt trời Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thểchuyển từ sống dới nớc lên cạn hoàn toàn

Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi các hợp chất phenol không chỉ làbảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình

điều hoà ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trởng và phát triển bình thờng [25,30]

Các flavonoid nh flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trongviệc điều chỉnh sự phân bố năng lợng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quảquang hợp Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên củahoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa

1.1.2 Flavonoid [8, 11, 47]

Flavonoid là sản phẩm của con đờng acid shikimic, chúng có khung

pyran C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman

O

B 1' 2'

3' 4'

5' 6' 2

3 4 5

6

7

8 9

10 1

1.1.2.1 Phân loại

Cấu trúc flavonoid

Trong tự nhiên, flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên kếtvới đờng (glycoside) Các glycoside khi thuỷ phân bằng acid hay enzyme sẽgiải phóng ra đờng và aglycone.

Flavonoid đợc chia thành các nhóm phụ dựa theo mức độ oxy hoá củakhung chroman hay sự có mặt của các nối đôi giữa C2, C3 và nhóm carbonyl

ở C4 của vòng C nh: flavone, flavonol, catechin, leucoanthocyanidin,anthocyanidin, chalcone và aurone

Công thức cấu tạo của một số aglycone flavonoid:

O O

Tính tan trong dung môi: khả năng hòa tan của flavonoid không giốngnhau, tùy thuộc vào số nhóm OH và các nhóm thế khác của chúng Flavonoidglycoside không tan trong ether, tan đợc trong nớc nóng, tốt nhất là cồn nóng.Các dẫn xuất 7-hydroxy thờng dễ tan trong kiềm loãng

Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là có khả năng hấp thụ tia tửngoại Nguyên nhân của sự hấp thụ này là do hệ thống nối đôi liên hợp tạo rabởi hai vòng benzene A, B và vòng pyran C Flavonoid có hai dải hấp thụ cực

đại, giải 1 ở bớc sóng > 290nm, giải 2 ở bớc sóng 220 - 280nm

Tính chất hoá học

Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học, vì vậy khả năng phản ứng hóahọc của chúng là rất lớn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: vị trí các nhóm OH,

Flavone

hệ thống nối đôi liên hợp và các nhóm thế Dới đây là các phản ứng hoá họccơ bản của flavonoid.

thành liên kết hydrogen, phản ứng este hoá

phức với kim loại Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại nh Fe,

Zn, Mg và HCl Sản phẩm có màu da cam, hồng hoặc đỏ Phản ứng này đặc

tr-ng cho các flavonoid có nhóm C=O ở vị trí C4 và nối đôi giữa C2 và C3 Điểnhình là flavonol, flavanone, flavanonol

1.1.2.3 Tác dụng sinh học của flavonoid

Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú Các cơchế hóa học của chúng có nhiều điểm còn cha sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóngvai trò quyết định là tác dụng chống oxy hóa Nhờ đó flavonoid có thể triệttiêu gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con ngời phòngchống bệnh tật

Tác dụng chống oxy hoá

Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hoá dây chuyền sinh

ra bởi gốc tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếuphụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng chất flavonoid cụ thể Dobản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc trongcơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hoá khử, bị oxy hoá từngbớc và tồn tại ở dạng hydroxyl, semiquinone, quinone Semiquinone hoặc

Chúng có thể nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạnghydroquinone Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt

động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng

Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng

nh các polyphenol làm cho chúng có khả năng tơng tác với các protein Tơngtác này có thể làm hoạt hoá hay ức chế hoạt động của enzyme Tác dụng củaflavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hoá sinh để định hớng choviệc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh

Tác dụng chống ung th

Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khảnăng chống ung th Các flavonoid có tác dụng kìm hãm các enzyme oxy hóa,kìm hãm quá trình đờng phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân,hạn chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thờng trong tếbào

Tác dụng làm bền thành mạch

Nhiều flavonoid có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm tăng sứcbền và tính đàn hồi của thành mao mạch Củng cố và làm giảm tính thấmthành mạch, bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thànhmạch nh đái đờng, trĩ, giãn tĩnh mạch

1.1.3.1 Phân loại tannin

Về phân loại có thể chia tannin thành 2 nhóm là tannin thủy phân đợc(pyrogallic tannin) và tannin ngng tụ (condensed tannin)

Tannin thủy phân là dẫn xuất của acid gallic và acid protocatechic.

Hai acid gallic kết hợp với nhau tạo thành acid digallic Acid này có vai tròtrong việc tạo thành tannin

Khi thủy phân bằng acid hoặc bằng tannase thì giải phóng ra phần ờng, thờng là glucose, đôi khi gặp đờng hamamelose Phần không phải đờng

đ-là các acid trên

Tannin ngng tụ đợc tạo thành do sự ngng tụ của các đơn vị flavan-3ol

hoặc flavan 3,4-diol Tannin loại này còn đợc gọi là proanthocyanidin Dới tácdụng của acid hoặc enzyme dễ tạo thành chất đỏ tannin hay phlobaphen.Phlobaphen rất ít tan trong nớc, là sản phẩm của sự trùng hợp kèm theo oxyhóa, do đó tannin pyrocatechic còn đợc gọi là phlobatannin Phlobaphen là

đặc trng của một số dợc liệu nh vỏ canh ki na, vỏ quế Tannin ngng tụ khó tantrong nớc hơn tannin thủy phân

Tannin có ảnh hởng đa dạng đến các hệ thống sinh học Chúng là cácyếu tố tạo phức với ion kim loại, các chất làm tủa protein và chất chống oxyhóa sinh học tiềm năng Do tannin có thể giữ các vai trò sinh học khác nhau,

và do sự biến đổi lớn về cấu trúc giữa các tannin, nên rất khó để phát triển cácmô hình cho phép dự đoán chính xác ảnh hởng của tannin trong bất kỳ hệ nào

Các loại tannin có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn Các tanninmonomer có khả năng kháng khuẩn khác nhau, giảm dần theo thứ tự: catechin

> ellagetannin > tannic acid > epi-catechin > gallotannin [39] Nhiều tácgiả cho thấy tannin ngng tụ có khả năng tơng tác làm giảm khả năng sống sótcủa giun sán ký sinh trong dạ dày động vật ăn cỏ Ngoài ra tannin còn gắn vớiprotein trong thức ăn làm giảm bớt sự phân hủy bởi vi khuẩn trong dạ cỏ [40,44]

1.2 Proteinase và các chất ức chế proteinase

1.2.1 Sơ lợc về proteinase

Protease là các enzyme xúc tác cho các quá trình thủy phân các liên kếtpeptide của phân tử protein hay chuỗi polypeptide Các protease thủy phân cácliên kết peptide bên trong chuỗi polypeptide đợc gọi là các endoprotease (haycòn gọi là các proteinase) và đợc chia thành 5 loại trên cơ sở các nhóm hóahọc tham gia vào quá trình xúc tác: proteinase serine (EC3.4.21), proteinase

cystein (EC3.4.22), proteinase aspartic (EC3.4.23), proteinase kim loại(EC3.4.24) và endopeptidase threonine (EC3.4.25).

Trong cơ thể, các proteinase đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý nh:hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giảiphóng hormone và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vậnchuyển protein qua màng Ngoài ra, các proteinase có thể hoạt động nh cácyếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thờng, tăng sự phân chia

tế bào, sinh tổng hợp ADN Ví dụ nh điều khiển quá trình appotosis là mộtloạt các cystein proteinase quan trọng có tên là caspase Caspase đợc Yuan vàtập thể tìm ra năm 1993 [66], hiện nay đã phát hiện đợc 12 loại caspase ở ngời[31] ức chế quá trình appotosis giúp các tế bào ung th thoát khỏi sự kiểm soátcủa cơ thể, tuy nhiên thúc đẩy appotosis góp phần vào sự bất thờng của các tếbào gan, tim, phổi, thần kinh trong các bệnh có liên quan Do đó ức chếcaspase có thể là phơng pháp trị liệu cho nhiều bệnh hiểm nghèo

Proteinase serine: là những proteinase có nhóm OH của gốc amino

acid serine trong trung tâm hoạt động, và có vai trò xúc tác trong phản ứngthuỷ phân protein Nhóm này có các enzyme quan trọng nh trypsin,

chymotrypsin, subtilisin, proteinase của P aeruginosa và nhiều loài vi khuẩn

khác

Các proteinase serine thờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm và có tính đặchiệu tơng đối rộng Tính đặc hiệu của chúng thể hiện về phía gốc amino acidchứa nhóm -CO- của liên kết bị phân giải Ví dụ nh trypsin thuỷ phân các liênkết peptide chứa nhóm -CO- của các amino acid kiềm (Lys, Arg),chymotrypsin thuỷ phân các liên kết peptide có nhóm -CO- của các aminoacid thơm

Proteinase cystein: Các proteinase của nhóm này có nhóm -SH trong

trung tâm hoạt động Nhóm -SH có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tửenzyme vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều loạt biến đổi hoá học

nh acid hoá, phosphoryl hoá, oxy hoá, ankyl hoá Vai trò của nhóm -SH trongphân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt: tạo thành phức chất enzyme-cơ chất, sựkết hợp với cơ chất và cofactor, duy trì các cấu dạng hoạt động của enzyme.Thuộc nhóm này có các enzyme nh papain, chymopapain, bromelain,calpain Các proteinase cystein thờng hoạt động ở pH trung tính, có tính đặchiệu rộng Enzyme chỉ hoạt động khi nhóm -SH trong trung tâm hoạt độngcủa nó không bị bao vây

Proteinase aspartic: là những proteinase có chứa gốc aspartic trong

trung tâm hoạt động Các proteinase aspartic thờng hoạt động mạnh ở pH acid.Chúng có tính đặc hiệu đối với các amino acid ở gần và xa vị trí cắt trên phân

tử protein cơ chất Các amino acid này thờng là các amino acid thơm hoặcamino acid kị nớc

Proteinase kim loại: là những proteinase cần có kim loại cho hoạt

động xúc tác của chúng Hầu hết các proteinase kim loại có chứa kẽm trongtrung tâm hoạt động, một số sử dụng coban Các enzyme này thờng bị bất hoạtbởi EDTA do EDTA tạo phức với kim loại

Các proteinase kim loại thờng hoạt đông mạnh nhất ở vùng pH trungtính và có tính đặt hiệu về phía gốc amino acid chứa nhóm -NH- của liên kếtpeptide

1.2.2 Proteinase serine

1.2.2.1 Proteinase serine

Proteinase serine là proteinase đã đợc nghiên cứu kĩ nhất trong 5 loạiproteinase, cho đến nay đã biết đến hơn 50.000 chuỗi polypeptide có hoạt tínhthuỷ phân protein thuộc loại peptidase serine và đợc xếp vào 40 họ (family)trong 12 phân nhánh (clan) [50]

Hầu hết các peptidase serine là các endopeptidase tuy nhiên cũng có vài

họ là các exopeptidase Nhóm serine của các peptidase có đặc điểm chung là

có gốc amino acid serine ái nhân trong trung tâm hoạt động của phân tửenzyme, gốc serine này sẽ tấn công nhóm carboxyl trong liên kết peptide củacơ chất để tạo thành dạng trung gian acyl-enzyme Tính ái nhân mạnh của gốcserine đợc hỗ trợ bởi nhóm bộ ba tạo thành từ gốc serine với aspartic vàhistidine trong trung tâm hoạt động Nhóm bộ ba các gốc tơng tự tạo thànhkhu vực ái nhân mạnh cũng có trong trung tâm hoạt động của nhiều nhómenzyme khác nh asparaginase, esterase, acylase, và -lactamase Một vàinhóm peptidase serine khác chỉ có serine cùng với lysine hoặc histidine, sốkhác lại có nhóm bộ ba mới là hai gốc histidine và serine Tuy nhiên trongmọi trờng hợp, gốc serine hầu hết bị bất hoạt bởi propylfluorophosphate vàphenylmethanesulfonyl fluorid [49]

Subtilisin, một proteinase serine đợc sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa,

đợc sản xuất hàng tấn trên năm và chiếm tới 40% lợng enzyme bán ra trêntoàn thế giới Ngoài ra, các protease còn có các ứng dụng khác nh thực phẩm,giày da, dợc phẩm, phân tích, quản lý chất thải, công nghiệp thu hồi bạc [73]

1.2.2.2 Protease của Pseudomonas aeruginosa

Chi Pseudomonas là thủ phạm gây nên các bệnh viêm nhiễm có mủxanh ở các vết thơng đặc biệt là vết thơng do bỏng, nó có thể gây ra viêm đ-ờng hô hấp, viêm tai, viêm giác mạc, viêm tiết niệu, viêm ruột, và có thể gâynhiễm trùng huyết dẫn tới tử vong Một khả năng nổi bật của loài vi khuẩnnày là chúng có khả năng sinh trởng mạnh trong các môi trờng khác nhau, vikhuẩn này dễ dàng xâm nhập vào cơ thể ngời có bị các bệnh suy nhợc và cácbệnh thiếu hụt miễn dịch Nghiên cứu các chủng vi khuẩn phân lập từ cácbệnh nhân xơ nang (cystic fibrosis), bệnh di truyền khởi phát ở trẻ em và đợcbiết dới tên gọi "sinh chất nhầy", cho thấy có những sự tái tổ hợp gene lớn bên

cạnh những thành phần bảo thủ trong hệ gene Pseudomonas aeruginosa [37].

Các loài thuộc chi Pseudomonas có khả năng sản xuất mạnh cácenzyme thuỷ phân trong đó có các proteinase Proteinase của Pseudomonaselần đầu tiên đợc Zant phát hiện vào năm 1957 [13] So với các vi khuẩn khác

thì P aeruginosa là một trong những nguồn vi khuẩn giàu proteinase ngoại bào Theo Morihara, P aeruginosa có ít nhất 3 loại proteinase khác nhau:

proteinase trung tính, elastase và proteinase kiềm

Các proteinase kiềm của P aeruginosa đã đợc nghiên cứu khá nhiều.

thể thay thế bằng St

Một protease của P aeruginosa đợc nghiên cứu khá kĩ là protease IV

(thuộc nhóm serine protease), protease này đợc cho là góp phần rất lớn trongcác nhiễm khuẩn màng sừng, nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân xơ nang [20, 54].Protease IV cũng có khả năng phân hủy nhiều protein quan trọng nh: cáckháng thể, bổ thể, fibrinogen, plasminogen ở các động vật có vú cũng nh cácprotein ở côn trùng [12]

Nghiên cứu in vitro, elastase của P aeruginosa có thể phân cắt dạng

proenzyme của các proteinase kim loại trong chất nền (matrixmetalloproteinase, MMP-2) trong nguyên bào sợi màng sừng để trở thànhdạng hoạt động phân hủy nhiều loại collagen, do đó có thể thấy vai trò củaelastase trong sự phát sinh các nhiễm khuẩn màng sừng, viêm và sự hìnhthành ung nhọt [38] Tuy nhiên các nghiên cứu mới trên động vật cho thấyelastase và cả proteinase kiềm không thực sự cần thiết cho sự hình thành vàduy trì các nhiễm khuẩn màng sừng [27]

ở Việt Nam nghiên cứu cũng cho thấy dịch nuôi cấy Pseudomonas có ítnhất 5 protein (polypeptide) có hoạt tính phân giải protein ở pH kiềm, trong đó

có 4 băng PA bị ức chế bởi các chất ức chế proteinase serine nh PMSF, McoTI(chất ức chế trypsin từ hạt gấc), TI đậu tơng [5]

1.2.2.3 Các chất ức chế proteinase

Các chất ức chế enzyme là các chất làm giảm tốc độ phản ứng doenzyme xúc tác Các chất này có thể tác dụng theo nhiều cách khác nhau, đặchiệu hay không đặc hiệu, có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuậnnghịch Các chất kìm hãm có bản chất rất khác nhau, tuy nhiên có thể phânthành hai loại là các chất kìm hãm có bản chất là protein và các chất phân tửnhỏ tự nhiên hay nhân tạo

Các chất kìm hãm có bản chất protein (PPI) đã đợc nghiên cứu từ rất

lâu, nghiên cứu về PPI xuất hiện đồng thời với các nghiên cứu về proteinase.Hiện nay đã xác định đợc hàng nghìn PPI và đợc nghiên cứu rộng rãi trên toànthế giới Theo định nghĩa, PPI là những protein có tác dụng làm giảm thuậnnghịch hoạt độ của các proteinase [1]

Theo cơ sở dữ liệu MEROPS, hiện nay có hơn 1.600 PPI thuộc 67 họtrong 34 phân nhánh [50]

Các PPI rất phổ biến trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng trong hạtthực vật, sự có mặt của chúng trong hạt là các tác nhân chống tiêu hoá đối vớinhiều loại động vật đặc biệt là đối với côn trùng (ức chế các proteinase ở ruộtgiữa) Rất nhiều loài vi khuẩn cũng tạo ra các chất ức chế proteinase giúp

chúng tồn tại trong ống tiêu hoá ví dụ nh ecotin của E coli có thể ức chế một

vài loại proteinase tuyến tuỵ

Các PPI có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong nôngnghiệp, đã có nhiều nghiên cứu chuyển gene mã hoá PPI vào thực vật nhằmnâng cao sức đề kháng của cây trồng với các loài côn trùng và sâu hại PPIcũng góp phần vào khả năng chống nấm và virus ở Việt Nam, công trìnhnghiên cứu của GS TSKH Phạm Thị Trân Châu và tập thể đã cho ra đời chếphẩm thuốc trừ sâu sinh học Momorsetatin từ hạt gấc (đề tài cấp nhà nớcKHCN-02-08B)

Một ứng dụng quan trọng và có nhiều triển vọng của PPI là trong lĩnhvực y học Hoạt tính protease không bình thờng có liên quan tới rất nhiều bệnhhiểm nghèo nh tim mạch, ung th, AIDS, do đó PPI là một hớng nghiên cứumới có nhiều triển vọng

Các chất ức chế protease phân tử nhỏ là hợp chất hoá học nhân tạo

hoặc có trong tự nhiên Các chất này cũng đợc chia thành hai loại là các chấtkìm hãm thuận nghịch và chất kìm hãm không thuận nghịch

Các chất kìm hãm không thuận nghịch thờng đợc sử dụng để nghiêncứu trung tâm hoạt động của enzyme, ví dụ nh sử dụng DFP (di-isopropylphosphofluoridate) và TPCK (tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone) đãxác định đợc Ser-195 và His-57 của chymotrypsin [2]

Các hợp chất polyphenol nói chung cũng có các tơng tác với protein,

đặc biệt là các enzyme, trong đó có các proteinase, chúng có khả năng ức chếcác enzyme theo nhiều cách khác nhau

1.3 Tơng tác của flavonoid với các protein enzyme [11]

Ngoài vai trò sinh hóa ở thực vật, tơng tác của thực vật với côn trùng,flavonoid đã đợc nghiên cứu trong suốt các thập kỷ qua vì chúng có thể có cáctác động tới sức khỏe của con ngời qua bữa ăn Flavonoid, đặc biệt là cácflavanol, flavonol, anthocyanin, những chất dồi dào trong bữa ăn rất có giá trịsinh học, và là một cơ chế chống ung th, các bệnh tim mạch, thoái hóa thầnkinh mà cha hoàn toàn đợc hiểu rõ Tuy nhiên tất cả các cơ chế đều có liênquan đến một trong hai đặt tính cơ bản của flavonoid là khả năng khử (tínhchống oxy hóa bởi sự cho điện tử hoặc proton) và khả năng tơng tác vớiprotein Tơng tác flavonoid-protein rất quan trọng trong thực vật nh quá trìnhtổng hợp flavonoid, cơ chế bảo vệ qua trung gian hóa học là flavonoid, tuynhiên phần này chủ yếu đề cập tới tơng tác flavonoid-protein ở động vật vàngời liên quan đến khả năng chữa trị bệnh Các nghiên cứu hóa sinh tập trungtheo hai hớng là giá trị dinh dỡng nhằm ngăn ngừa các bệnh lão hóa và khảnăng chữa bệnh để phát triển các loại thuốc mới

Tơng tác flavonoid-protein có liên quan đến tác dụng sinh học của cácflavonoid, ngoài ra còn có tơng tác xảy ra trớc khi đợc hấp thụ ở ruột Tuynhiên cho đến nay, các nghiên cứu sự vận chuyển của flavonoid tới các môcòn rất sơ lợc

1.3.1 Các lực tơng tác phân tử trong phức chất protein-flavonoid

Nhân phenol là cấu trúc cơ bản tơng tác với protein (liên kết không

cộng hóa trị) Các tơng tác này có thể chia thành hai nhóm: tơng tác van der

Waals, tơng tác tĩnh điện.

Thêm vào các liên kết không cộng hóa trị và các liên kết thuận nghịch

còn có các liên kết tạo thành do các phản ứng oxy hóa khử giữa protein và

flavonoid Các điện tử oxy hóa của flavonoid có thể đợc tạo ra do sự tự oxy

hóa (sự oxy hóa do các dioxygen đợc xúc tác bởi các ion kim loại ở nồng độrất thấp, dạng vết), sự hấp thụ (quét dọn) các dạng gốc tự do (hoạt tính chốngoxy hóa) và sự oxy hóa do enzyme Với khả năng a điện tử và khả năng oxyhóa, các sản phẩm của sự oxy hóa flavonoid (các gốc aryloxyl, các quinone vàcác hợp chất quinonoid) có thể phản ứng với các gốc amino acid có tính áinhân và có khả năng oxy hóa, do đó biến đổi protein không thuận nghịch bởicác liên kết cộng hóa trị hay sự oxy hóa

Hình 1.3 Sơ đồ tơng tác phân tử của flavonoid với protein

Hinh 1.4 Mạng lới các liên kết hydrogen trong phức chất của

(S)-4’,7-dihydroxyflavanone và enzyme chalcone isomerase 1.3.2 Tính đặc hiệu của tơng tác protein-flavonoid

Khả năng tơng tác của flavonoid là do tính chất của nhân phenol, phứchợp protein-polyphenol đợc tìm thấy rất nhiều, tuy nhiên tính đặc hiệu cần đợctập trung nghiên cứu

Các protein cuộn tự do có nhiều vị trí tơng tác với polyphenol, ví dụ nhcác protein tuyến nớc bọt giàu gốc proline, khả năng tơng tác với cácpolyphenol nhỏ (gallate, catechin) khá yếu nhng tăng lên rất nhanh khi số l-ợng nhân phenol tăng lên (flavanol-3-O-gallate, oligomeric procyanidin,polygalloylglucose), do có nhiều tơng tác phân tử dọc theo chuỗi protein cócác gốc kị nớc là proline Tơng tự nh vậy, các catechin polymer hoá oxy hoáhay các aldehyde ngng tụ tạo nên ái lực cao hơn với xanthine oxidase Xu h-ớng này phản ánh tính chất của các liên kết hydrogen và các tơng tác van derWaal, đây là các tơng tác không đặc hiệu dọc theo phân tử protein hay trên bềmặt các phân tử protein hình cầu

Ngợc lại, các tơng tác với các protein có hoạt tính (enzyme, receptor) làcác tơng tác đặc hiệu của một số flavonoid (flavone, isoflavone, flavonol dạngaglycone) Nguồn gốc của các tơng tác đặc hiệu flavonoid-protein là do cấutrúc tơng tự của chúng với các hợp chất có hoạt tính sinh học nh coenzyme,hormone dạng steroid hay các chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter)

1.3.3 ảnh hởng của các flavonoid đối với sự thuỷ phân protein

Sự hình thành các phức chất không hoà tan của tannin với protein và sự

ức chế các enzyme tiêu hoá của tannin đã đợc nghiên cứu từ lâu, tuy nhiênnghiên cứu về cấu trúc và tính bền vững của phức chất này còn hiếm Tơngtác của các flavonoid khác không phải là tannin với các protein trong thựcphẩm cũng rất hiếm Với các enzyme tiêu hoá, một số flavone hydroxyl hoá

và các flavonol dạng aglycone (ví dụ nh quercetin) có khả năng ức chế trypsin

Nghiên cứu mới đây cho thấy một isoflavonoid là

7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman và broussonin A từ cây Tri mẫu (Anemarrhena

asphodeloides) có khả năng ức chế khá tốt protease tơng tự chymotrypsin

(chymotrypsin-like protease) của proteasome [57] Proteasome là phức hệprotease đa xúc tác đợc tìm thấy trong các tế bào prokaryote cũng nh trongnhân và bào tơng của tất cả các sinh vật eukaryote, proteasome cũng có mặt ở

cổ khuẩn, là hệ thống phân hủy protein của con đờng ubiquitine hóa phụ thuộc

gia vào việc phân hủy các protein nội bào cuộn gập sai, các protein không còn

cần thiết, có đời sống ngắn ví dụ nh các cyclin điều hòa chu trình tế bào Cácrối loạn của proteasome có thể dẫn tới nhiều bệnh tật, sự suy yếu hệ thống hệthống proteasome xuất hiện ở các bệnh nhân Huntington, Alzheimer [58].

Các chất ức chế proteasome đợc sử dụng trong điều trị nhiều loại ung

th đa u (multiple myeloma cancer), ung th bạch cầu… Bortezomib là một chất

ức chế proteasome tìm ra năm 1995 và đợc chứng nhận bởi Cơ quan kiểmsoát thực phẩm và dợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) trong chữa trị đa u tuỷ (multiple

lymphoma) vào năm 2006 [71] Tuy nhiên cũng có nhiều tác dụng phụ nguyhiểm đã đợc ghi nhận [16, 48] Vì vậy các hợp chất flavonoid có khả năng ứcchế proteasome là một hớng mới có nhiều tiềm năng nhằm điều trị các bệnhung th [14, 15]

1.4 Cây thuốc việt nam và khả năng chữa các bệnh viêmnhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa

1.4.1 Sơ lợc về các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa

Viêm là một đáp ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trớc sự tấn côngcủa một tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý) hoặc của tác nhânbên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn) Đây là một đáp ứngmiễn dịch tự nhiên (innate immune) Quá trình viêm thờng kèm theo các triệuchứng sng, nóng, đỏ và đau, do các mạch máu giãn nở, đa nhiều máu đến nơitổn thơng Các bạch cầu cũng theo mạch máu xâm nhập vào mô, tiết các chấtprostaglandin, cytokine nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn th-

ơng Phản ứng viêm điển hình thờng thấy là các bệnh mụn nhọt ngoài da Khiviêm không lành sẽ có thể trở thành viêm mạn tính

Phản ứng viêm chia thành nhiều giai đoạn tuy nhiên không thể phânbiệt một các rõ ràng, chúng xen kẽ nhau và chuyển biến rất từ từ Tham giavào phản ứng viêm có nhiều loại tế bào nh các đại thực bào, bạch cầu; cácchất môi giới (mediator) nh histamine, serotonin, các kinin, prostaglandins(PG)… và hệ thống các enzyme đặc biệt là các enzyme thủy phân protein nhcollagenase, elastase, hyaluronidase, chymotrypsin

Đối với các quá trình viêm do nhiễm khuẩn nh trong các bệnh mụnnhọt, viêm da…vai trò của các enzyme phân hủy protein là rất quan trọng, đặcbiệt là các proteinase ngoại bào do các vi khuẩn tiết ra Proteinase ngoại bào

của Staphylococcuss aureus, một loài vi khuẩn là thủ phạm gây ra mụn nhọt ở

ngời, nhất là trẻ em, bao gồm các proteinase serine, proteinase cystein khôngnhững có vai giúp vi khuẩn thâm nhập vào cơ thể mà còn có vai trò giúp nóthoát khỏi các cơ chế đáp ứng miễn dịch trong phản ứng viêm [52, 53]

Theo Đông y, điều trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thờng

sử dụng các vị thuốc thanh nhiệt, giải độc nh Đơn tớng quân, Cam thảo, Raumá Trong dân gian, các loại cây thuốc có tác dụng kháng khuẩn mạnh cũng

đợc sử dụng chữa các bệnh này nh Tô mộc, Sắn thuyền… [3, 9] Ngày nay,các nghiên cứu cho thấy rất nhiều các hợp chất polyphenol từ thực vật cũngkhả năng chống viêm, chúng cũng có khả năng ức chế các enzyme trong phảnứng viêm [65]

Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và khảnăng chữa trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi đã thuthập và chọn lọc các mẫu nghiên cứu là những cây thuốc nam thờng dùngchữa các bệnh này đợc ghi trong nhiều tài liệu [3, 9]

1.4.2 Cây gỗ Vang (Tô mộc)

1.4.2.1 Đặc điểm phân loại, phân bố, thành phần hóa học và công dụng

sappan L.) là cây mọc hoang hay

đợc trồng nhiều nơi ở Việt Nam,

Trung Quốc cũng nh nhiều nớc

Đông Nam á, và đợc dùng làm

thuốc với tên gọi Tô mộc… Theo

Đỗ Tất Lợi, nớc sắc Tô mộc có tác

dụng kháng sinh mạnh đối với

nhiều vi sinh vật: Staphylococcus

209P, Samonella typhi, Shiga

flexneri, Shigella sonnei, Shigella

dyseteria Shiga, Bacillus subtilis.

làm thuốc săn da và cầm máu, chữa lị ra máu, chảy máu trong ruột, ho Tômộc cũng đợc dùng kết hợp trong các bài thuốc Đông y.

Các công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy hợp chất brazilin vàbrazilein có trong Tô mộc có tác dụng kháng histamin, tác dụng làm mạnh vàkéo dài tác dụng của hormone tuyến thợng thận, ức chế histidine carboxyl-lyase, và nhiều tác dụng sinh lý khác [9]

Tài liệu cho thấy gỗ vang có các loại polyphenol nh tannin, acid gallic,saponin, brazilin, ngoài ra còn có tinh dầu Brazilin là chất có tinh thể màuvàng, trong môi trờng kiềm chuyển màu đỏ, khi bị oxy hóa cho brazilein [9]

1.4.2.2 Các nghiên cứu về gỗ Vang trên thế giới

Các hợp chất hóa học trong Tô mộc đã đợc nghiên cứu khá kĩ trên thếgiới Năm 1985, hai hợp chất vòng thơm là dẫn xuất của brazilin đã đợc cácnhà khoa học Nhật Bản chiết xuất từ gỗ Vang [17] Năm 1986, các nhà khoahọc Nhật Bản khác đã phát hiện đợc protosappanin, một hợp chất biphenyl từlõi gỗ Tô mộc [41] Năm 1987 một số homoisoflavonoid mới cũng đợc tìmthấy trong cây gỗ Vang [42, 43] Năm 2008, các nhà khoa học Trung Quốccũng phát hiện đợc một homoisoflavonoid mới trong cây Tô mộc thu thập tạitỉnh Vân Nam, Trung Quốc [67]

Gần đây các nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt tính sinh học, đặcbiệt là khả năng chống oxy hóa, khả năng ức chế tế bào ung th, chức năng bảovệ…Các nghiên cứu tập trung vào khả năng chống oxy hóa, chống viêm, tác

động tới cơ tim của brazilein và các chất khác trong gỗ Vang [64, 68] Cácnhà nghiên cứu Trung Quốc cho thấy dịch chiết ethanol từ gỗ Vang có thể cótác dụng ức chế miễn dịch, ức chế tế bào lympho T, brazilein cảm ứcapoptosis các lympho lách chuột [63] Brazilin và caesalpine J từ cây Tô mộccòn có khả năng kích thích phân cắt sợi DNA, một quá trình có thể chống ung

Năm 2004, nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy dịch chiết n-butanol,methanol, nớc, chloroform gỗ Vang có khả năng ức chế sự phát triển của

nhiều chủng Staphylococcus aureus kháng kháng sinh [33] Các nghiên cứu

khác cũng cho thấy dịch chiết gỗ Vang cũng nh các chất đợc chiết xuất từ gỗVang có khả năng ức chế nhiều vi sinh vật khác [34]

Brazilin cũng có khả năng ức chế cảm ứng caspase-3, một proteinase

có vai trọng quan trọng trong hệ thống miễn dịch và quá trình apoptosis [32].Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết nớc và dịch chiết cồn cây gỗ Vang cũng

nh một số loài thực vật khác trong họ Caesalpiniaceae đều có khả năng ức chếHIV-1 protease Đây là một protease thuộc về nhóm protease aspartic có vaitrò quan trọng trong sự nhân lên của HIV [55]

1.4.2.3 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Cũng nh các nghiên cứu ngoài nớc, các nghiên cứu ở Việt nam cũng tậptrung vào khả năng chống oxy hóa của gỗ Vang Nghiên cứu của các tác giảViệt Nam cho thấy dịch chiết gỗ Vang có khả năng ức chế mạnh xanthineoxidase là một enzyme có liên quan đến hình thành bệnh gout trong đósappanchalcone có khả năng ức chế mạnh nhất Các tác giả cũng tìm đợc 3hợp chất mới trong cây gỗ Vang và đặt tên là neoprotosappanin, neosappanone

A và protosappanin A dimethyl acetal [45] Các nghiên cứu khác cũng đã xác

định đợc nhiều hợp chất có mặt trong cây gỗ Vang tại Việt Nam [4]

Nhìn chung, những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các thành phầnhóa học trong Tô mộc đã đợc tiến hành rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên nhữngnghiên cứu về khả năng ức chế proteinase (PIA) vẫn còn rất sơ lợc Công trìnhnghiên cứu gần đây đã phát hiện đợc dịch chiết từ gỗ, vỏ thân, vỏ hạt cây Tômộc có tác dụng ức chế trypsin (TIA), chymotrypsin (ChIA), proteinase của

Pseudomonas aeruginosa (PsIA) và cho rằng hoạt tính ức chế này có thể do

các chất không phải protein mà có thể là do các hợp chất có khối lợng phân tửnhỏ [6]

Polyphenol là các hợp chất có khối lợng phân tử thấp hơn protein và cónhiều hoạt tính sinh học, chúng có thể tơng tác với các protein nói chung vàcác proteinase nói riêng, vì vậy công trình này chủ yếu nhằm làm sáng tỏ khảnăng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách

từ P aeruginosa và Stalphylococcus aureus) của polyphenol và flavonoid

trong các bộ phận cây gỗ Vang

Mục tiêu của đề tài luận văn

1 Nghiên cứu điều tra hoạt tính ức chế proteinase, polyphenol của một sốcây thuốc chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa

2 Xác định hàm lợng polyphenol, flavonoid và hoạt độ ức chế của dịchchiết một số cây thuốc giàu các chất ức chế proteinase

3 Định tính các thành phần flavonoid và PIA trên bản mỏng và đi sâunghiên cứu PIA của flavonoid một số cây thuốc

4 Nghiên cứu flavonoid các bộ phận cây Tô mộc và khả năng ức chếproteinase serine của chúng

Chơng 2 NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU

2.1 Nguyên liệu

Các mẫu nghiên cứu là các bộ phận cây thuốc nam do Trung tâm Trồng

và chế biến cây thuốc, Viện Dợc liệu cung cấp

2.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

2.2.1 Dụng cụ

Máy cô quay chân không Kaki (Đức)

Proteinase tách từ vi khuẩn P aeruginosa và S aureus

Các hóa chất điện di của Fluka, A.G (Thụy Sĩ)

Các hóa chất khác đạt độ tinh sạch phân tích

2.3 Phơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị dịch nghiên cứu

Mẫu tơi: cây thuốc đợc thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận,nghiền nhỏ, chiết trong nớc, li tâm thu dịch trong

Mẫu khô: cây thuốc đợc thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, xử lý

chiết, lại thêm ethanol, quá trình ngâm chiết lặp lại 3 lần, trộn dịch chiết của 3

2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần các mẫu nghiên cứu theo phơng pháp B C Talli [trích theo tài liệu 10] (theo sơ đồ dới)

2.3.3 Định lợng polyphenol theo phơng pháp Folin-Ciocalteau [61]

Nguyên tắc dựa vào phản ứng oxy hoá của các polyphenol với thuốc thửFolin-Ciocalteau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam So màu ở bớc sóng 765

nm Hàm lợng polyphenol đợc tính toán theo đờng chuẩn acid gallic

a Hóa chất:

 Thuốc thử Folin-Ciocalteau

n-ớc cất rồi đun sôi Sau khi dung dịch nguội, thêm một vài tinh

1000 ml

b Đờng chuẩn acid gallic:

 Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau:

0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,25, 0,5 mg/ml

 Cho 20 l mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 1,58 ml

n-ớc cất, sau đó cho 100 l thuốc thử Folin-Ciocalteau vào, trộn

đều Sau khoảng 30 giây đến 8 phút cho vào 300 l dung dịch

Mẫu nghiờn cứu

Dịch chiết EtOH

DC1

Xử lý mẫu, Ngõm chiết trong EtOH 96 o C

Chỉnh pH 3-4 bằng HCl 1%

Chiết với ethyl acetate (3 lần)

Hình 2.1 Sơ đồ tách chiết flavonoid toàn phần

Đuổi dung mụi, hũa tan vào nước

Cặn khụng tan

Na2CO3 20%, lắc đều Hỗn hợp phản ứng đợc giữ ở 40oC trongvòng 30 phút So màu ở bớc sóng 765 nm

Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chấtnghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đờng chuẩn)rồi làm thí nghiệm nh trên, hàm lợng polyphenol đợc tính toán dựa theo đờngchuẩn acid gallic trên

2.3.4 Sắc ký phân chia các thành phần polyphenol, trên bản mỏng silicagel [theo tài liệu 22]

Sắc ký là phơng pháp phân tích khi một pha di động triển khai trên mộtpha tĩnh mà từ đó một hỗn hợp các chất khác nhau đợc phân tách thành từngthành phần Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography), là một ph-

ơng pháp đợc biết đến từ lâu, đợc E Stahl giới thiệu vào năm 1957 Tuy nhiênhiện nay vẫn đợc sử dụng do có nhiều u điểm nh thời gian khai triển ngắn (20

đến 30 phút), đờng khai triển ngắn, khả năng phân tách cao, có thể dùng cácthuốc hiện màu mạnh nh acid, kiềm mạnh, nhiệt độ cao Chủ yếu phơng phápnày dựa trên phơng pháp sắc ký hấp phụ nhng có tính chất riêng biệt để táchmột lợng nhỏ các chất Sắc ký lớp mỏng có thể vừa là sắc ký hấp thụ vừa làsắc ký phân tách

Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia của hai pha: mộtpha tĩnh (có thể là silicagel, aluminum oxide, cellulose, Kieselguhr ), đợctrải trên bản kính, thủy tinh hay nhựa, một pha động là hệ dung môi khai triển

đựng trong bình có nắp kín, bản mỏng có lớp hấp phụ đợc nhúng và lớp dungmôi, dung môi di chuyển lên trên làm chuyển dịch hỗn hợp mẫu từ vị trí chấm

0 0,2 0,4 0,6 0,8

lên trên bản mỏng ở đây có mối liên quan chặt chẽ giữa chất hấp phụ, hệdung môi triển khai và chất để phân tích.

Để phát hiện các vết dịch chuyển có thể soi dới ánh sáng tử ngoại, hiệnmàu bằng các thuốc thử thích hợp Có thể cạo các vết, rửa giải, tinh chế đểtiếp tục nghiên cứu

Trong công trình này, chúng tôi sử dụng bản mỏng Silicagel 25 DC

thành phần polyphenol trong các cây mẫu nghiên cứu

Các hệ dung môi triển khai sắc ký đã dùng:

TEAF (Toluene: Ethyl acetate: Acetone : acid Formic): (5:2:2:1)TEAF: (5:3:1:1)

Chloroform:methanol: (9:1)Chloroform:ethyacetate: acid formic: (5:3:0,4)Hiện màu:

Hơi Amoniac bão hòa

2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase: dịch chiết mẫu đợc pha loãng nhiều

lần để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng

độ không ảnh hởng tới hoạt tính enzyme

 Phơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch (điều tra sơ bộ PIA)

Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, hoạt độ enzyme

tỷ lệ thuận với đờng kính và độ sáng của vòng phân giải trên đĩathạch [70]

 Phơng pháp Anson cải tiến [69]

Nguyên tắc dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzyme.Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein cha bị thủy phân bằng acidtricloroaxetic (TCA) Định lợng sản phẩm tạo thành sau phản ứng với thuốcthử Folin-Ciocalteau, khả năng ức chế proteinase của mẫu nghiên cứu tỉ lệ vớihiệu số giữa sản phẩm tạo thành của ống thí nghiệm không có mẫu nghiên cứu

và ống nghiệm có chất nghiên cứu Một đơn vị ức chế (IU) là lợng chất ức chếlàm giảm 50% hoạt độ của 2 mg enzyme

 Hóa chất thí nghiệm

Thuốc thử Folin-Ciocalteau

Đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15MCơ chất casein 1% trong đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M

Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa tách từ Pseudomonas

aeruginosa

TCA 5%

 Tiến hành thí nghiệm

ống thí nghiệm: lấy hai ống nghiệm, một ống cho vào 400 l

đệm, ống còn lại cho vào 300 l đệm cùng với 100 l mẫunghiên cứu có độ pha loãng thích hợp Sau đó cho vào mỗi ống

ống 2,5 ml TCA 5%, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm phản ứngmàu với thuốc thử Folin-Ciocalteau

ống kiểm tra: làm tơng tự với ống thí nghiệm, nhng sau khi ủ 10

cơ chất casein

Phản ứng màu: cho 250 l dịch lọc vào 1ml Na2CO3 6%, trộn

đều rồi cho tiếp vào 250 l thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần.Sau 30 phút so màu ở bớc sóng 750 nm

n: độ pha loãng mẫu nghiên cứux: hàm lợng enzyme (g/ml) tơng ứng với hoạt độ E

I : hoạt độ ức chếThí nghiệm xác định PIA đợc tiến hành với nhiều độ pha loãng mẫunghiên cứu khác nhau đến khi tìm đợc độ pha loãng thích hợp Độ pha loãngthích hợp là độ pha loãng mẫu nghiên cứu mà ở đó hoạt độ enzyme khi cóchất kìm hãm (dung dịch mẫu nghiên cứu) bằng khoảng một nửa so với hoạt

độ enzyme khi có đối chứng là nớc

Xác định hoạt độ phân giải protein theo phơng pháp Anson cải tiến

Đơn vị hoạt độ phân giải protein là lợng enzyme mà trong 1 phút ở 35,5

cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tơng đơng với phản ứngmàu của 1 mol tyrosine với thuốc thử Folin-Ciocalteau

Hình 2.3 Đờng chuẩn tyrosine

Hoạt độ phân giải protein (HP/ml) của 1 ml dung dịch enzyme đợc tính

theo công thức:

HP/ml = (mol tyrosine x a x b)/t

a: Toàn bộ thể tích hỗn hợp sau phản ứng (4 ml)b: Tính trên 1 ml enzyme xác định (nhân với 10 nếulợng enzyme xác định là 100 l)

t: Thời gian ủ enzyme với cơ chất (20 phút)

2.3.6 Điện di PA trên gel polyacryamide theo phơng pháp của Heussen và Dowdle [26]

Các bớc thực hiện kỹ thuật điện di phát hiện proteinase trên gelpolyacrylamide có SDS nh sau:

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

OD

750

μmol/ml