Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV so với kỹ thuật đọc trình tự gen

Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) là một trong những nhiễm trùng phổ biến ở loài người và là một vấn đề y tế lớn của nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm HBV đặc hiệu nhưng tỷ lệ nhiễm virus này đến nay vẫn còn rất cao. Theo ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV, trong đó có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính, chiếm 6% dân số thế giới. Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục, viêm gan tối cấp đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư tế bào gan (UTTBG) 8, 24. Ước tính mỗi năm có hơn một triệu người chết do hậu quả của nhiễm HBV mạn tính 57. Vậy câu hỏi đặt ra là tại sao cùng nhiễm HBV mà lại gây các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau. Một trong nhiều lý do của sự khác nhau đó là do đáp ứng miễn dịch của vật chủ, đặc điểm di truyền tế bào và chính bản thân virus như sự khác biệt về kiểu gen (genotype), đột biến vùng gen S, preCore, Core của HBV cũng có liên quan nhất định đến bệnh sinh và đáp ứng điều trị của các thuốc kháng virus cũng như tiên lượng bệnh 90.

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) là một trong những

nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người và là một vấn đề y tế lớn của nhiềuquốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam Mặc dù đã có vaccine phòngnhiễm HBV đặc hiệu nhưng tỷ lệ nhiễm virus này đến nay vẫn còn rất cao.Theo ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV,trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính, chiếm 6%dân số thế giới [23] Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từngười mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục, viêm gantối cấp đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan(UTBMTBGUTTBG) [8], [243] [53], [72] Ước tính mỗi năm có hơn mộttriệu người chết do hậu quả của nhiễm HBV mạn tính [Lee57, 1997] Vậy câuhỏi đặt ra là tại sao cùng nhiễm HBV mà lại gây các bệnh cảnh lâm sàng khácnhau Một trong nhiều lý do của sự khác nhau đó là do đáp ứng miễn dịch củavật chủ, đặc điểm di truyền tế bào và chính bản thân virus như sự khác biệt vềkiểu gen (genotype), đột biến vùng gen S, preCore, Core của HBV cũng cóliên quan nhất định đến bệnh sinh và đáp ứng điều trị của các thuốc khángvirus cũng như tiên lượng bệnh [Song và CS, 200590]

Kiểu gen của HBV được mô tả lần đầu bởi Okamoto và CScs năm 1988.Các tác giả thấy rằng giữa các kiểu gen khác nhau có số lượng các nucleotidekhác nhau tối thiểu là 8% trên toàn bộ bộ gen (genome) của chúng Cho đếnnay có ít nhất là 8 kiểu gen khác nhau của HBV đã được phát hiện và ký hiệu

cứu của Suzuki và cộng sựCS (2005) thấy rằng kiểu gen B thường gặp ở bệnhnhân viêm gan mạn, trong khi kiểu gen A lại thường thấy ở trong viêm gancấp [8286] Trong khi đó nhiều nghiên cứu khác gần đây cho thấy kiểu gen Cthường gây tổn thương gan nặng nề hơn so với kiểu gen B, kiểu gen A thườnggây viêm gan mạn hơn kiểu gen D Người mang HBV mạn tính có nguy cơphát triển thành xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan thường gặp hơn ở kiểugen C so với kiểu gen B và kiểu gen C khó điều trị hơn kiểu gen B cũng đượcquan sát thấy ở nhiều nghiên cứu [3235], [46], [48], [49], [50], [52], [58],[6670].

Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của HBV đang được

áp dụng trên thế giới Như phương pháp chuẩn là đọc trình tự gen và phântích loài (Sequencing and Phylogenetic analysis) [2223],, [64]; tiếp đến làphương pháp realtime - PCR hoặc realtime - PCR kết hợp phân tích đườngcong nóng chảy (melting curve) dựa vào trên nguyên lý đếm thời gian thực vàphân tích sự khác nhau về nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm PCRDNA[8185], rồi đến các phương pháp lai đầu dò (line probe assay, LiPA) [2830],PCR đa mồi (Multiplex - PCR) [4144], [68], phản ứng dot blot ngược dòng(FT - RDB: flow through reverse dot blot ) [7478], oligonucleotidemicroarray [8692] và đặc biệt là phương pháp PCR - RFLP (PCR - restrictionfragment length polymorphism) [38], [39], [57] Ở Việt Nam phổ biến hiệnnayđang sử dụng phương pháp đọc trình tự gen, lai đầu dò và multiplex -PCR [5], [8], [19] Tuy nhiên, các phương pháp này giá thành khá cao, cầnnhiều trang thiết bị đắt tiền và mất khá nhiều thời gian

Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu genHBV có ý nghĩa quan trọng góp phần làm giảm giá thành xét nghiệm, phổbiến kỹ thuật, tiết kiệm thời gian và đầu tư trang thiết bị cũng như mang lại

lợi ích về kinh tế và tiết kiệm chi phí điều trị cho người bệnh Chính vì những

lý do đó chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:

1 Xác định điều kiện tối ưu và lựa chọn enzyme giới hạn thích hợp cchoủa kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV.

2 Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV so với kỹ t

huật đọc trình tự gen.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Tình hình nhiễm virus viêm gan B

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và Việt Nam

1.1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm virus viêm gan B (hepatitis B virus,HBV) đặc hiệu, nhưng nhiễm HBV vẫn đang là vấn đề mang tính toàn cầu.Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang viruskhông triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục đến viêm gan mạn, xơ gan

và ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBGUTTBG) [Acharya SK và CS,

200021], [23], [5357] HBV có thể lây qua đường tình dục, đường máu, từ mẹsang con Ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễmHBV, trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính.Khoảng ba phần tư số người mang HBV mạn tính đang sống ở Châu Á và khuvực Sub - Sahara của Châu pPhi với tỷ lệ cao số người mang virus trong cộngđồng Tỷ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng Ðịa Trung Hải, NhậtBản và một phần Ðông Âu Trong khi đó tỷ lệ này tương đối thấp dưới 2%dân số tại phần lớn các nước Tây Âu, Châu Úc và Bắc Mỹ Các nghiên cứugần đây cho thấy rằng những người nhiễm HBV mạn tính có nguy cơ tiến

triển UTBMTBGUTTBG cao hơn 100 lần so với người bình thường Trungbình mỗi năm có hơn 1 1 triệu người chết do nhiễm HBV gây nên [23],[5357] Sự khác nhau về tỷ lệ lưu hành toàn cầu có khả năng là do có sự khácbiệt về các đường lây truyền HBV chính, điều kiện kinh tế và khả năng chămsóc y tế Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như Châu Á và Tây Phi, lâytruyền HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỷ lệ lây truyền cho trẻ

sơ sinh cao đến 90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg (+) Người ta thấyrằng có trên 95% các trường hợp trẻ lây nhiễm HBV từ mẹ trở thành ngườimang HBV mạn tính [23], [5357]

Căn cứ vào các số liệu điều tra dịch tễ học WHO đã chia các khu vựcnhiễm HBV trên thế giới thành 3 khu vực dịch lưu hành

Bảng 1.1 Các khu vực nhiễm HBV trên thế giới [xx] (E.PILLY - 1998)

Khu vực lưu hành thấp

Khu vực lưu hành trung bình

Khu vực lưu hành cao

Địa Trung Hải, Liên Xô cũ, Đông

Âu, Trung Đông, Nam Mỹ, Nhật Bản

Trung Quốc, Đông Nam Á,

Hạ Sahara, Châu Phi

1.1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Ở Việt Nam rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV đứnghàng cao nhất thế giới Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21%

thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu ngườimang HBV mạn tính [3], [4], [16], [20], [6266] Tỷ lệ mang anti - HBs trên60% Tuy vậy, tỷ lệ nhiễm HBV ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từngtác giả cũng khác nhau [6266].

Theo Phạm Song và cộng sự CS thấy tỷ lệ nhiễm HBsAg ở 6 - 14%,anti - HBs ở 35 - 37% số người không mắc bệnh gan và tăng theo lứa tuổi.Nguyễn Anh Tuấn bằngvới kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA:Radioimmunoassay) đã phát hiện 11% số người khỏe mạnh có HBsAg (+)[3], [16] Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam được các nghiên cứu công bốgần đây tóm tắt ở bảng 1.2

B ng 1.2 T l HBsAg (+) m t s qu n th dân c nảng 1.2 Tỷ lệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta ỷ lệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta ệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta ở một số quần thể dân cư nước ta ột số quần thể dân cư nước ta ố quần thể dân cư nước ta ần thể dân cư nước ta ể dân cư nước ta ư nước ta ư nước taớc tac ta

Địa

Tỷ lệ % HBsAg(+) Năm

Miền Bắc Lê Hồng Quang Công nhân 13, 62 1993

Hà Nội Lê Vũ Anh

Trần Thị Chính Phan Thị Phi Phi và CS.

Dân cư

35 - 59 tuổi Người lớn khỏe mạnh

11, 35

14, 4

13, 9

1988 1993 1993

Hồ Chí

Minh

Trần Văn Bé, Trương Xuân Liên

Người lớn khỏe mạnh Công nhân viên

9, 3

16, 6

1994 1994 Tiền

Hóa

David B

Hipgrave, Nguyen Thu Van và CS

Cộng đồng (n=1579)

Sơ sinh Trẻ em Thanh niên Người lớn

18 ± 2,4 12,5 ± 2,8 18,4 ± 5 20,5 ± 5,3 16,8 ± 1,8

1995

1.1.2 Đường lây nhiễm của HBV

HBV có ở trong máu và các chế phẩm từ máu, các dịch tiết như tinhdịch, dịch âm đạo, nước bọt, nước mắt, sữa mẹ [20], [4246] Khi tiếp xúcvới các nguồn bệnh trên thì sẽ có nguy cơ cao nhiễm HBV

Có 3 con đường lây nhiễm cơ bản HBV [20], [23]

+ Lây truyền từ máu và các chế phẩm từ máu thông qua tiêm, truyền,các thủ thuật, phẫu thuật, lọc máu Hiện nay, những người sử dụng ma túyđường tiêm chích là đối tượng có nguy cơ nhiễm HBV cao nhất

+ Lây truyền từ mẹ sang con: Đây là con đường truyền bệnh nguy hiểmbởi vì có từ 90 - 95% số trẻ bị nhiễm theo con đường này có nguy cơ tiếntriển thành nhiễm HBV mạn tính Tỷ lệ lây nhiễm cho trẻ cao khi người mẹnhiễm HBV cấp ở 3 tháng cuối của thai kỳ và, xung quanhgần thời gian đẻđối với người mẹ nhiễm HBV mạn tính Nếu người mẹ có đồng thời HBsAg(+) và HBeAg (+) thì nguy cơ nhiễm cho con lên tới 90% [23]

+ Lây truyền qua đường tình dục: Sinh hoạt tình dục với người nhiễmHBV, dù khác giới hay đồng giới bằng các đường âm đạo, hậu môn hayđường miệng đều có khả năng nhiễm bệnh Khả năng lây bệnh cao khi ngườinhiễm có HBeAg (+), hoặc khi nồng độ HBV - DNA trên 105 copies/ml

1.1.3 Cấu trúc của HBV

1.1.3.1 Hình thể và cấu trúc của HBV

HBV là một thành viên thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus

hướng gan (hepatotropic) có bộ gen (genome) là chuỗi xoắn kép DNA đóngvòng không kín, có capside và quá trình nhân lên không gây tan tế bào gannhiễm virus [3639] Dưới kính hiển vi điện tử (Hình 1.1A) quan sát thấy HBVtồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau:

+ Tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm

+ Tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm dài 40 - 400nm.+ Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đâychính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp [3336]:

- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein Lớp này có cáckháng nguyên bề mặt (HBsAg)

- Lớp lõi: Capside đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõiHBcAg Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòngkhông kín, enzyme DNA phiên mã ngược- polymerase và protein kinase

Hình 1.1 (A) HBV nhìn dưới kính hiển vi điện tử (ABock CT & Zentgraf, 1992) và (B) mô hình hóa cấu trúc ( BLee, 1997 ), Tiểu thể Dane

(C)

1.1.3.2 Cấu trúc bộ gen của HBV

Bộ gen (Genome) của HBV là một phân tử DNA đóng vòng không kíngồm 2 sợi có kích thước khác nhau Sợi ngoài nằm bên ngoài mang cực tính

âm tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3200 cặp base và

mã hóa cho toàn bộ thông tin di truyền của HBV Sợi ngắn nằm bên trong cựctính dương có chiều dài thay đổi bằng 50 - 80% so với sợi âm [2], [11],[4246]

Cấu trúc vòng của DNA được đảm bảo là nhờ sự ghép nối 2 đầu 5’ của 2hai sợi DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide (Nu.), được gọi làvùng liên kết (cohesive region) Vùng này nằm giữa 2 trình tự DR1 và DR2(Directly repeated sequence) gồm có 10 - 11 Nu, trong đó DR1 nằm ở đầu 5’của sợi DNA âm và cũng hiện diện ở đoạn thừa ra (redundant) của đầu 3’, cònDR2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA dương Hai trình tự này có vai trò chủ yếutrong việc khởi phát quá trình tổng hợp của các chuỗi DNA tương ứng Thứ

tự của các Nu được đánh số bắt đầu từ 1 tương ứng ở vị trí cắt trên bộ genHBV của enzyme EcoRI (Hình 1.2) Chiều dài của bộ gen thay đổi tùy theotừng kiểu gen khác nhau, [11], [23]

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc các genbộ gen của HBV

Bộ gen của HBV được tổ chức thành 4 đơn vị sao dịch mã dưới sự điềukhiển của 4 vùng khởi động độc lập (Promoter) tạo ra 4 chuỗi mARNA thôngtin (mRNA) với kích thước tương ứng là 3.,5,; 2.,4;, 2,.1 và 0,.7 kilobase(Kb) Quá trình đọc mã bắt đầu từ bộ ba nucleotid ATG được gọi là codon mởđầu (start codon) và chấm dứt bằng codon kết thúc (stop codon) là TAG.Những phân tử mRNA này tạo thành sẽ được vận chuyển ra bào tương tế bào

và sẽ dịch mã tạo ra các protein tương ứng là (protein capside, polymerase,protein bề mặt vỏ lớn, vừa và HBx) ở trong bào tương của tế bào gan, cuốicùng các protein này được lắp ghép với pregenomic HBV - RNA và tiếp tụchoàn thành chu trình nhân lên của HBV [11], [396], [4246]

Cấu trúc bộ gen của HBV gồm 4 đoạn gen: S, P, C, X tương ứng với 4khung đọc mở (open reading frame) là các vùng mã hóa tổng hợp các proteincủa HBV Quá trình đọc mã bắt đầu từ bộ ba Nu ATG được gọi là codonkhởi đầu (start codon) và chấm dứt bằng codon kết thúc (stop codon) là TAG

* Gen S (Surface) gồm 3 vùng: Vùng S, PreS1, PreS2 có chức năng mãhóa tổng hợp phân tửprotein kháng nguyên bề mặt của HBV hay HBsAg(Hepatitis B surface Antigen) bao gồm HBsAg nhỏ, HBsAg trung bình vàHBsAg lớn

- Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 34 kD gồm

226 acid amin (aa) Protein này gồm 2 thành phần là p24 và gp27 (gp:Glycoprotein) Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số Người ta phát hiện ởvùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) củaHBsAg Tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên mà người taphân ra các phân type khác nhau Mỗi phân type đều có chung quyết địnhkháng nguyên “a” và khác nhau tùy theo sự ghép cặp của các quyết định

kháng nguyên “d” hoặc “y” ghép với “w” hoặc “r” để tạo nên các phân typenhư adw, ayw, adr, ayr Chính vùng “a” có liên quan đến tính miễn dịch vì nóquyết định cho sự tổng hợp anti - HBs.

- Đoạn gen S và preS2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài

33 kD gồm 281 aa Protein này gồm 2 loại gp33 và gp36 Người ta cho rằngvùng preS2 có vai trò giúp cho HBV bám dính và xâm nhập vào trong tế bàogan nhờ nó liên kết với 1 loại albumin được trùng hợp trong huyết thanhngười (pSHA: polymerised Human Serum Albumin), đồng thời trên các tếbào gan cũng có các thụ thể để gắn với pHSA Nếu trên tế bào gan thiếu cácthụ thể này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng kháng với sự nhiễmHBV

- Đoạn gen S, preS1 và preS2 tổng hợp nên protein L (Large) có chiềudài 39 kD gồm 2 loại p39 và gp42 Chuỗi protein pre S1 có chiều dài thay đổitùy theo phân type khác nhau Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặtcủa tế bào gan sẽ liên kết với HBV, giúp HBV xâm nhập vào trong tế bàogan Kháng thể anti - preS1 có thể trung hòa và ức chế HBV kết dính ở tế bàogan Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt củavirion, trong đó protein S chiếm đa số Protein M chiếm khoảng 5 - 10% trongcác virion và các tiểu thể có kích thước 22 nm Protein L chiếm 20% trong vỏbọc của virion và các tiểu thể dạng ống nhưng chỉ chiếm 1 - 2% trong cácprotein của tiểu thể có kích thước 22 nm

* Gen C (Core): Ở đầu 5’ của gen C có 2 codon khởi đầu cho quá trìnhđọc mã Trình tự Nu nằm giữa 2 codon này được gọi là vùng preCore Nếuquá trình đọc mã được bắt đầu từ codon ATUG thứ nhất ở vị trí 1814 và đọcsuốt chiều dài của đoạn gen preCore và C sẽ tổng hợp nên HBeAg (Hepatitis

B early Antigen) Các Nu đầu tiên của vùng preCore sẽ mã hóa một đoạnpeptide gồm 19 aa gọi là peptide tín hiệu (signal peptide) Peptide này giúp

cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào ở bào tương của tế bàogan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan được trong huyếtthanh Vì vậy, HBeAg được gọi là kháng nguyên hòa tan của HBV Đây làmột loại protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng của nócho đến nay vẫn còn nhiều điều chưa được sáng tỏ Sự xuất hiện của HBeAg

có liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạngcủa HBV đang ở tronggiai đoạn nhân lên Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ codon ATG thứ hai ở vịtrí 1901 và đi suốt đoạn gen C sẽ tổng hợp nên kháng nguyên lõi hay HBcAg(Hepatitis B core Antigen) Đây là kháng nguyên cấu trúc của phầnnucleocapside Vì HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó khôngđược bài tiết ra ngoài tế bào gan Vì vậy, HBcAg không bao giờ xuất hiệntrong huyết thanh

Một số trường hợp xảy ra đột biến ở vùng preCore tại vị trí 1896,Guanosine được thay thế bằng Adenin, tạo nên một trình tự TAG là mộtcodon kết thúc Chính codon kết thúc này đã chấm dứt quá trình dịch mã củavùng preCore, cho nên sự tổng hợp của HBeAg không thực hiện được mặc dùquá trình nhân lên của HBV vẫn tiếp diễn

* Gen P (polymerase) chiếm 80 % chiều dài toàn bộ gen của HBV Sảnphẩm của gen này là enzyme phiên mã ngược polymerase (reverttranscriptiont - polymerase) Enzyme này vừa có hoạt tính DNA polymerasephụ thuộc RNA lại vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA.Enzyme DNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiềngenome (pregenome) mà sợi RNA tiền genome này lại được tạo ra từ khuônmẫu là DNA của HBV dưới tác dụng của enzyme RNA polymerase của tếbào gan Sản phẩm enzyme P không chỉ liên quan đến cơ chế phiên mã ngược

mà còn tham gia vào việc tạo ra phần capside bao bọc bên ngoài cấu trúcRNA tiền genome

* Gen X mã hóa HBx protein có kích thước 154 aa, trọng lượng phân

tử 17 kD (Diao và CS, 2001) [3437] là một protein nhỏ nhất trong các proteincủa HBV Trong các protein của HBV, HBx được cho là một protein có vaitrò trung tâm trong quá trình nhiễm virus và bệnh sinh ung thư tế bàoganUTTBG (Paterlini P và CS, 1999) [7781] Đây là một protein điều hoà đachức năng; có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho nhiều geneđích của tế bào; làm trung gian, hoặc đối lập với nhiều chức năng khác nhaucủa tế bào, bao gồm điều hoà chu trình tế bào, quá trình sao chép, dẫn truyềntín hiệu, mã hoá tổng hợp các phân tử kết dính, hoạt hoá các gene sinh ungthư hoặc gene ức chế ung thư của tế bào (Pang R, và CS, 2006; Peng Z, và CS2005) [740], [751] Nhiều nghiên cứu cho thấy HBx có những vai trò chínhsau:

- HBx hoạt hoá sao chép (Transcriptional transactivation): Người ta đã

chứng minh rằng HBx-protein hoạt hoá biểu hiện các gen thông qua tác độngtrên các con đường điều hoà biệt hoá tế bào Tác động này phụ thuộc vào sựphân bố của HBx ở các khu vực khác nhau trong tế bào Các nghiên cứu theohướng này cho thấy HBx - protein phân bố chủ yếu ở bào tương, một số ít ởtrong nhân và màng nhân tế bào Vì thế, HBx tác động tăng cường điều hoàcác dòng tín hiệu chủ yếu ở bào tương như MAPK/ERK (Mitogen ActivatedProtein Kinasse/Extracellular-respone kinase), hoạt hoá các genegen tiền ungthư như c -– Myc và, c - Jun, hoạt hóa NF - kB, AP - 1, AP - 2, RPB5 củaRNA polymerase II, TATA binding protein, CREB (ATF/cAMP responseelemenenzymet binding protein) và các genegen tăng cường (enhancers) kháccủa chính HBV ở trong nhân tế bào (Pang R và CS, 2006) [7074]

- HBx điều hoà các dòng tín hiệu nội bào: Nghiên cứu gần đây chứng

minh rằng HBx tác động lên một số dòng tín hiệu như MAPK/ERK, proteinkinase B (AKT/PKB), PKC, SAPK/JNK (Stress Activated Protein Kinase),

Phosphatidyl Inositol 3-kinase (PI-3-K), và Janus kinase/Signal transducerand activator of transcription (JAK)/STAT), pSTAT3 và Supressor ofcytokine signaling-3 (SOCS-3) (Bock, +Toan và CS, 2008) [28] Tác độngcủa HBx đồng thời lên nhiều dòng tín hiệu khác nhau tạo ra một đáp ứng sinhhọc điển hình, đây có thể là nguyên nhân gây hoạt hoá kéo dài và thúc đẩy sựnhân lên và sống sót của tế bào

- HBx điều hoà tế bào chết theo chương trình (Apoptosis): HBx điều

hoà quá trình apoptosis liên quan đến một số protein như p53, retinoblastomaprotein (Rb), Fas associated death domain protein (FADD), tumour necrosisfactor (TNF) receptor associated death domain protein (TRADD) và NF - kB

ở bệnh nhân ung thư tế bào gan liên quan đến HBV (Peng Z, và CS, 2005)[75] HBXx phân bố ở trong mitochondri của tế bào là nguyên nhân tiềmtàng gây mất màng mitochondri, hậu quả dẫn đến tế bào chết theo con đườngphụ thuộc mitochondri (Shirakata Y, và cs, 2003) [795] Các virus viêmganHBV làm biến đổi các dòng tín hiệu chống lại quá trình chết theo chươngtrình của tế bào (antiapoptosis signals) như STAT - 3 và NF - kB thông qua

cơ chế cưỡng bức ER (Endoplasmic Reticulum Stress) và sản sinh phản ứngoxy hoá thứ phát (ROS) (Lee và CS, 2004; Waris G và CS, 2001) [5458],[960] Ngoài ra, HBx - protein còn làm biến đổi dòng canxi bởi ức chế hoạthoá Pyk2 (proline rich tyrosine kinase-2) và Src kinase hoặc dòng canxi trunggian bởi kênh canxi ở mitochondri (Bouchard và CS, 2001) [297]

- HBx điều hoà chu kỳ tế bào: Có rất nhiều yếu tố tham gia điều hoà chu

kỳ phát triển tế bào như hoạt hoá cyclin, cyclin dependent kinase (CDKs) vàCDK inhibitors (CDKIs) HBx làm tăng tỷ lệ và mức độ hoạt hoá CDK2 vàcác cyclin E, A hoặc B (Bouchard và CS, 2001) [297] và gây biểu hiện quámức cyclin D1 (Klein và CS, 2003) [551] GeneGen Rb là một genegen ức chế

quá trình tăng trưởng tế bào và có vai trò nhất định trong điều khiển sự nhânlên của tế bào.

1.1.4 Sự nhân lên của HBV trong tế bào gan

Trong chu trình nhân lên của HBV có giai đoạn sao chép ngược từ RNA

để tạo nên một DNA mới nhờ enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase).HBV có tỷ lệ đột biến rất cao vì enzyme này hay bị sai sót trong khâu saochép Quá trình nhân lên của HBV gồm nhiều giai đoạn [11], [462]

* Giai đoạn tạo ra một DNA dạng siêu xoắn (supercoiled DNA): Sau khixâm nhập vào trong tế bào gan nhờ cơ chế xâm nhập tế bào (endocytosis),HBV đã phóng thích phần vỏ chỉ còn phần lõi có chứa phân tử DNA để đivào trong nhân tế bào Ban đầu phân tử DNA vòng có chuỗi trong ngắn hơnchuỗi ngoài nhưng khi vào trong nhân tế bào gan nhờ enzyme DNApolymerase sẽ bổ sung cho chiều dài của chuỗi trong tạo nên một DNA vòngkhép kín với hai chuỗi dài bằng nhau và bị xoắn cuộn lại nhờ các liên kếtđồng hóa trị DNA này viết tắt là cccDNA (covalently closed circular DNA)

Sự xuất hiện của cccDNA trong tế bào gan bị nhiễm giữ vai trò quan trọngtrong việc duy trì tình trạng mạn tính của nhiễm HBV hay sự tái phát củabệnh

* Giai đoạn tổng hợp sợi RNA tiền genome

Sợi RNA tiền genome được tổng hợp từ sợi âm của cccDNA dưới tácdụng xúc tác của enzyme RNA polymerase II ở tế bào Sợi RNA tiền genomenày có chiều dài 3,5kb và bị dư ở hai đầu của một đoạn thừa R (R: redundant)

từ 150 - 200 Nu và bao gồm cả trình tự DR1 Sợi RNA tiền genome chứađựng toàn bộ thông tin di truyền của HBV và nó sẽ làm khuôn mẫu để tổnghợp nên sợi DNA sợi âm của bộ gen HBV sau này

Ở đầu 5’ của sợi RNA tiền genome còn có một tín hiệu “ε” rất chuyên” rất chuyênbiệt cho HBV để khởi phát quá trình bao bọc (encapsidation) cấu trúc RNA

tiền genome và enzyme polymerase bằng các protein của phần capside Cácprotein của capside và enzyme polymerase được tổng hợp từ sợi RNA thôngtin thứ hai cũng có chiều dài là 3,5kb

Ngoài ra trong giai đoạn này còn có sự phiên mã tổng hợptạo nên của cácsợi bán phần genome (subgenomic) chỉ mang một phần các thông tin ditruyền của HBV các sợi RNA thông tin với kích thước 2,4; 2,1 và 0,7kbtrong nhân tế bào sau đó được vận chuyển ra bào tương và Các RNA này cóchiều dài khác nhau như 2,4kb, 2,1kb và 0,5kb sẽ thực hiện quá trình dịch mãtổng hợp nên các protein còn lại của HBV như protein HBsAg, và proteinXHBx

* Giai đoạn tổng hợp sợi DNA chuỗi dài có cực tính âm Đây là giaiđoạn tổng hợp sợi DNA từ khuôn mẫu là RNA nên được gọi là quá trình saochép ngược Quá trình này diễn ra trong bào tương của tế bào gan

Trong lúc sợi RNA tiền genome được bao bọc bên ngoài bằng phầncapside, quá trình sao chép ngược sẽ được khởi phát nhờ việc sử dụng chấtmồi là nhóm hydroxyl của Tyrosine trên enzyme phiên mã ngược DNApolymerase của HBV Enzyme phiên mã ngược này sẽ đến tương tác với tínhiệu “ε” rất chuyên” ở đầu 5’ của sợi RNA tiền genome và nhập thêm 4 Nu đầu tiên làGTAA Tiếp theo đó phức hợp enzyme polymerase và bốn trình tự đầu tiênnày di chuyển đến vùng DR1 ở đầu 3’ của sợi RNA tiền genome và tiếp tụcnối dài ra thêm để tổng hợp nên sợi DNA mang cực tính âm

* Giai đoạn tổng hợp sợi DNA chuỗi ngắn mang cực tính dương

Sự tổng hợp chuỗi ngắn mang cực tính dương được bắt đầu tại trình tựDR2 của chuỗi dài nhờ sử dụng chất mồi là phần oligoribonucleotide ở đầu 5’của sợi RNA tiền genome và bao gồm cả trình tự DR1 Quá trình nhân lênđược tiếp tục nhờ sự khép vòng (circulation) của sợi DNA thông qua hiệntượng lai ghép (hybridation) giữa chuỗi dài với chuỗi ngắn

Trong lúc này phần lõi của HBV sẽ được lắp ghép thêm phần vỏ bọc rồiđược bài tiết qua hệ thống lưới nội bào thương để phóng thích ra khỏi tế bàogan đi vào tuần hoàn hoặc để vào lại một tế bào gan khác để hình thành mộtchu trình nhân lên mới Mặt khác, sợi RNA tiền genomic ở trong bào tương

có thể vào lại nhân tế bào để hình thành một chu trình nhân lên mới chính trên

tế bào gan đó (Hình 1.3) Chính sự vào lại chu trình nhân lên này sẽ góp phầnduy trì sự tồn tại của dạng cccDNA trong tế bào gan Khi phần capside đượcbao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của enzyme DNA polymerase, cho nên

sự tổng hợp của sợi DNA mang cực tính dương thường không hoàn toàn, do

đó chuỗi trong thường ngắn hơn chuỗi ngoài

Hì×nh 1.3 Chu trì×nh nhâ©n lêªn củña HBV ([Ganem vൠPrince, 2004)]

Hình 1.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên của HBV

1.1.5 Sinh lý bệnh trong nhiễm HBV

1.1.5.1 Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV

* Đáp ứng miễn dịch tế bào: Đây là cơ chế chính gây tổn thương tế bào

gan và thải trừ HBV ra khỏi cơ thể [8], [11], [14], [462]

+ Đại thực bào: lưu hành trong máu và tổ chức, ở các cơ quan khácnhau có tên gọi khác nhau như đại thực bào phế nang ở phổi, tế bào Kuffer ởgan, tế bào thần kinh đệm ở tổ chức thần kinh, tế bào có tua (dendritic cell) ở

tổ chức hạch lympho Đại thực bào có nhiệm vụ bắt, tiêu diệt các tế bàonhiễm HBV và trình diện kháng nguyên HBV lên bề mặt ngay cạnh phân tửHLA (Human Leucocyte Antigen) lớp II Đại thực bào sau khi được hoạt hóabởi yếu tố hoạt hóa thì khả năng bắt, tiêu diệt các tế bào nhiễm HBV tăng lênnhiều lần

+ Các tế bào Lympho: - Tế bào TCD4: Là quần thể tế bào lympho T cóthụ thể CD4 có khả năng nhận diện kháng nguyên HLA lớp II trên bề mặt tếbào đại thực bào, có thụ thể CD3 nằm ngay cạnh thụ thể CD4 làm giá đỡ cho

thụ thể dành cho quyết định kháng nguyên của HBV Kết quả của sự tươngtác: tế bào TCD4 được hoạt hóa giải phóng các cytokine như các yếu tố hoạthóa đại thực bào, các yếu tố hoạt hóa tế bào lympho T, yếu tố hỗ trợ lymphobào B để tế bào này sản xuất ra các lớp kháng thể và gia tăng trình diện khángnguyên HBcAg lên bề mặt tế bào gan bên cạnh phân tử HLA lớp I

- Tế bào TCD8: Là quần thể tế bào lympho T có thụ thể CD8 nhận diệnkháng nguyên HLA lớp I trên bề mặt tế bào gan, có thụ thể CD3 làm giá đỡcho thụ thể dành cho quyết định kháng nguyên HBcAg Kết quả của sự tươngtác này dẫn tới tế bào TCD8 hoạt hóa và chúng có khả năng giết các tế bàonhiễm virus Tế bào TCD8 bất hoạt các thành phần bên trong tế bào trước khi

tế bào bị ly giải Điều này tránh được sự lây lan của virus tới các tế bào lành.Đây là cơ chế chính gây tổn thương tế bào gan

Ngoài ra tế bào TCD8 còn tiết ra các cytokine thu hút các tế bào viêm,đại thực bào gây tăng cường phá hủy tế bào gan nhiễm HBV

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy ở bệnh nhân VGVR B cấp sốlượng tế bào Lympho TCD3, TCD4, TCD8 đều tăng cao trong giai đoạn toànphát và trở về gần như bình thường trong giai đoạn hồi phục Có mối tươngquan chặt chẽ giữa số lượng tế bào lympho với lâm sàng và hóa sinh Mức độcàng nặng, enzyme transaminase, bilirubin càng cao thì số lượng tế bàolympho càng tăng cao Tuy nhiên, ở bệnh nhân VGVR B mạn thì số lượng tếbào lympho T giảm hơn bình thường trong giai đoạn tiến triển của bệnh và có

sự hồi phục không đáng kể ở giai đoạn hồi phục [13]

+ Tế bào giết tự nhiên NK (Natural Killer): Các tế bào này trực tiếp pháhủy tế bào gan bị nhiễm HBV không thông qua quá trình mẫn cảm đặc hiệunào Trong bệnh nhân VGVR B cấp, Choong và cs thấy tỷ lệ tế bào NK ởnhóm bệnh nhân có HBsAg (+) cao hơn nhóm HBsAg (-)

* Đáp ứng miễn dịch dịch thể:

Các kháng thể đặc hiệu là: các kháng thể kháng HBV có vai trò khácnhau trong thải trừ virus ra khỏi cơ thể

+ Anti - HBs: Là kháng thể kháng lại kháng nguyên HBsAg Đây làkháng thể có khả năng giúp cơ thể bảo vệ chống lại HBV, chính nhờ có đặctính này vaccine dự phòng viêm gan B ra đời, trên cơ sở tạo miễn dịch chủđộng từ kháng nguyên HBsAg Hoàng Vũ Hùng khi nNghiên cứu sự biếnđộng các marker dấu ấn của HBV trên bệnh nhân VGVR B cấp chođã nhậnthấy: 8,2% bệnh nhân xuất hiện anti - HBs (+) sau khi ra viện, 37,3% sau 1tháng và 85,7% sau 3 tháng Tất cả bệnh nhân mang HBsAg mạn tính đều

không xuất hiện Anti - HBs [13]

+ Các cytokine: Cytokine được sinh ra trong quá trình đáp ứng miễn dịchvới HBV rất phong phú và đa dạng Mỗi cytokine có một chức năng khácnhau:

- IL1 - IL13 có chức năng điều hòa miễn dịch.

- TGF, G - CSF, erythropoietin kích thích tế bào gốc tạo máu

- Interferon, TNF có nhiều chức năng riêng biệt.

Cho đến nay việc nghiên cứu vai trò của các cytokine trong bệnh sinh củaHBV đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể Tuy nhiên vẫn còn nhiều vấn đềcần phải tiếp tục nghiên cứu và làm sáng tỏ

1.1.5.2 Sự liên quan giữa đáp ứng miễn dịch và bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm HBV

+ Viêm gan ác tính (fulminant hepatitis )

Khi đáp ứng miễn dịch của cơ thể quá mạnh sẽ loại trừ HBV một cáchnhanh chóng, làm cho nồng độ của HBV và HBsAg giảm thấp, đáp ứng tạoAanti - HBs xảy ra rất sớm và nhanh Đồng thời cũng gây tổn thương nặng nềcho các tế bào gan và có thể đưa đến bệnh cảnh suy gan nặng bùng phát, đedọa tử vong Nhưng nếu những bệnh nhân này may mắn sống sót hoặc đượccan thiệp ghép gan kịp thời thì sẽ không bao giờ chuyển sang viêm gan B mạntính và bệnh nhân sẽ được miễn dịch bảo vệ lâu dài [8], [14], [462]

+ Viêm gan cấp diễn tiến thuận lợi đến khỏi bệnh

Khi đáp ứng miễn dịch đủ mạnh và thích hợp đồng thời lượng HBVtrong cơ thể không nhiều quá thì HBV sẽ được loại trừ nhưng gan chỉ bị tổnthương vừa phải và hồi phục dần sau đó Bệnh nhân cũng thu được miễn dịchbảo vệ lâu dài sau khi khỏi bệnh

+ Viêm gan mạn tính

Xảy ra khi đáp ứng miễn dịch không đủ sức khống chế sự nhân lên củaHBV hoặc do HBV đã thích nghi nhờ vào hiện tượng đột biến để trốn tránhđược các phản ứng miễn dịch của cơ thể

Viêm gan mạn tính hoạt động thường diễn tiến qua 3 giai đoạn kế tiếpnhau và có thời gian thay đổi:

 Giai đoạn dung nạp miễn dịch (immuno - tolerance)

Tạo điều kiện cho HBV được nhân lên rất nhiều nhưng các tổnthương tế bào gan lại rất ít Trong giai đoạn này đáp ứng miễn dịch củaCTL (Cytotoxic T Lympho) bị suy giảm, có thể do giảm hoạt động củalympho bào TCD4+, do giảm sự biểu thị kháng nguyên của hòa hợp tổchức MHC (Major Histocapatibility Complex) lớp I trên bề mặt tế bàogan bị nhiễm, hoặc do giảm khả năng nhận diện kháng nguyên vì bị cácanti - HBc cản trở

 Giai đoạn thanh thải miễn dịch (clearance)

Biểu hiện bằng những đợt bùng phát của viêm gan và xuất hiện các tổnthương viêm gan mạn hoạt động do hoạt tính của CTL và lympho TCD4+được khôi phục để ức chế sự nhân lên của HBV và làm xuất hiện sự chuyểnđảo huyết thanh từ anti - HBe (-) sang (+)

 Giai đoạn hòa nhập (intergration)

Khi HBV hòa nhập chất liệu di truyền vào DNA của tế bào gan, lúc đóHBsAg vẫn được sản xuất mặc dù HBV không còn hoạt động nhân lên Tronggiai đoạn này, tổn thương của viêm gan hoạt động rất hạn chế, enzyme ALT

và AST không tăng tuy nhiên trên mô học có thể đã xuất hiện xơ gan

+ Người lành mang HBsAg không triệu chứng (healthy carriers)

Đây là một tình trạng khá đặc biệt, trong đó vật chủngười mang HBsAgHBV mạn tính nhưng không có các biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng vàkhông có các tổn thương gan tiến triển, enzyme ALT và AST hoàn toàn bìnhthường Cơ chế của hiện tượng này hiện nay chưa thật rõ ràng Tuy nhiên,người ta thấy rằng Ssự nhân lên của virus thường rất thấp biểu hiện bằng nồng

độ HBV - DNA nhỏ hơn 2000 IU/ml, HBeAg (-), anti - HBe (+) Tình trạngnày có thể được giải thích là do có sự dung nạp tương đối về miễn dịch giữa

vật cơ thể vật chủ đối với HBV Miễn dịch của vật chủ không đủ sức để loạitrừ HBV nhưng lại có khả năng ức chế sự nhân lên và sự biểu hiện gen củaHBV, cho nên các CTL và hệ thống miễn dịch của vật chủ không nhận diện

và không phá hủy các tế bào gan bị nhiễm Hiện tượng dung nạp miễn dịchnày có thể bị phá vỡ khi vật chủ bị giảm sức đề kháng của cơ thể, bị đồngnhiễm với các virus hướng gan khác, được sử dụng corticoide hoặc được điềutrị bằng interferon Một người mang HBV không triệu chứng có thể tiếntriển sang viêm gan mạn tính, xơ gan hoặc ung thư gan nguyên phát trong mộtthời gian tiến triển nhất định nào đó [4], [23], [762]

1.2 Sự phân bố và ảnh hưởng của kiểu gen HBV

1.2.1 Kiểu gen của HBV

Từ năm 1988 Okamoto và CS khi phân tích 18 trình tự bộ gen của HBV

đã phát hiện ra các chủng HBV có bộ gen khác nhau trên các bệnh nhânnghiên cứu chứ không phải như trước đây chúng ta vẫn nhận định [671] Cáctác giả đã qui ước gọi kiểu gen A là kiểu gen cổ điển và các kiểu gen khác cònlại có hơn 8% nucleotide (Nu.) khác so với kiểu gen A Như vậy, kiểu gen B

sẽ có hơn 8% Nu khác biệt so với kiểu gen A; kiểu gen C có hơn 8% Nu.khác so với kiểu gen A và B và tương tự như vậy cho đến hiện nay người ta

đã phát hiện được 8 kiểu gen của HBV khác nhau và được ký hiệu từ A đến H[22], [684], [7983] Như vậy, khi các bệnh nhân được phát hiện có HBsAg (+)

có nghĩa là họ đều nhiễm cùng một kiểu gen HBV, hoặc có thể nhiễm nhiềukiểu gen HBV khác nhau Từ đó đã gợi mở cho những nhà nghiên cứu hướngtới một trong những cách giải thích mới cho sự khác biệt về diễn biến lâmsàng bệnh lý gan, hiệu quả điều trị và đáp ứng với thuốc kháng virus cũngnhư hậu quả tác động mạn tính của chúng trên các bệnh nhân khác nhau

1.2.2 Sự phõn bố của cỏc kiểu gen của HBV

Người ta thấy rằng, sự phõn bố kiểu gen cú tớnh chất khu vực và cỏckiểu gen của HBV được tỡm thấy với tần suất khụng giống nhau trờn cỏc vựngđịa lý khỏc nhau (Hhỡnh 1.5) Vớ dụ: kiểu gen A được tỡm thấy chủ yếu ở TõyBắc Chõu Âu, Bắc Mỹ và Trung Phi; kiểu gen B và C chủ yếu được tỡm thấy

ở Đụng Nam Á, Trung Quốc và Nhật Bản; kiểu gen D thường thấy ở cỏcnước vựng viễn Đụng, Trung Đụng và Ấn Độ; kiểu gen E chủ yếu ở ChõuPhi; kiểu gen F được tỡm thấy ở người Mỹ gốc Phi vàà Quầần đảođảoPolynesia; kiểu gen G được ghi nhận ở Mỹ và Phỏp, kiểu gen H cho đến naymới phỏt hiện 1 trường hợp ở Trung Mỹ (Hỡình 1.5) [22], [684], [7983] Gầnđõy, Tran và CS đó chứng minh ở Việt Nam HBV cú thể tồn tại thờm mộtkiểu gene mới là kiểu gen I [Tran và cs, 200889] Thờm vào đú, sự phõn chiacỏc kiểu gene, tỏi tổ hợp giữa cỏc kiểu genegen khỏc nhau của HBV đó tạo ranhững sự khỏc biệt và đa dạng về sự di truyền của HBV [Simmonds P vàMidgley, 200580]

Hỡnh 1 45 Sự phõn bố tỷ lệ nhiễm HBV mạn và cỏc kiểu gen HBV

1.2.3 Tác động của kiểu genegen HBV trên lâm sàng bệnh lý gan

Để tìm hiểu sâu những đặc tính sinh học của các kiểu gen HBV người

ta đã khảo sát mối liên quan của chúng đối với tiến triển của bệnh do nhiễmHBV này Qua nghiên cứu trên nhiều các nhóm đối tượng, nhiều trung tâmnghiên cứu người ta thấy rằng: những kiểu gen này có ảnh hưởng tới đặc tínhsinh học của virus và diễn biến bệnh cảnh lâm sàng của nhiễm HBV Ví dụ:

So với kiểu gen B thường gặp ở bệnh nhân viêm gan mạn tính thì kiểu gen Athường tìm thấy ở bệnh nhân viêm gan B cấp tính [6456] Kiểu gen C thườnggây bệnh nặng hơn kiểu gen B ở Châu Á [3235], [4650], [4852], [49], [-

5054], [52], [5862], [6670], và kiểu gen A thường gây bệnh mạn tính hơnkiểu gen D ở Châu Âu [8084], hay gần đây ở Ấn Độ người ta cũng thấy kiểugen A thường gây bệnh nặng hơn kiểu gen D [5256] Đi sâu phân tích sâu hơnnữa vai trò của kiểu gen trong sinh lý bệnh người ta đã tiến hành nhữngnghiên cứu dọc với số lượng bệnh nhân lớn thì thấy rằng trên những quần thể

có tỷ lệ người nhiễm HBV cao như Đài Loan nơi phân bố chủ yếu của 2 kiểugen B và C nguy cơ tiến triển thành xơ gan và ung thư gan ở bệnh nhânnhiễm HBV kiểu gen C thường cao hơn so với kiểu gen B Thêm vào đóngười ta cũng thấy rằng, trên bệnh nhân mang kiểu gen C tỷ lệ dương tính củaHBeAg cũng như mức độ nhân lên của HBV cũng cao hơn là nhóm mangkiểu gen B Thời gian chuyển đảo huyết thanh ở nhóm có kiểu gen C lâu hơn

so với kiểu gen B, tỷ lệ đột biến điểm ở vùng tiền nhân (preCcore) ở nhóm cókiểu gen C cũng cao hơn là nhóm có kiểu gen B Những đột biến này thườngthấy ở nhóm bệnh nặng như xơ gan và ung thư gan hơn là nhóm bệnh nhânviêm gan cấp và viêm gan mạn tính Trong khi đó những bệnh nhân trẻ dưới

50 tuổi mang kiểu gen B thường tiến triển thành ung thư gan nhanh hơn làkiểu gen C ở cùng độ tuổi [3235], [4650], [4851], [4952], [5054], [5862],[6670]

1.2.4 Mối liên quan của kiểu gen và hiệu quả điều trị kháng virus

Những nghiên cứu về mối liên quan của kiểu gen của HBV trong đápứng điều trị với interferon alpha đã được tiến hành tại CHLB Đức vào năm

2000 Trong nghiên cứu đó các tác giả đã thấy rằng tỷ lệ chuyển đảo huyếtthanh (HBeAg  anti - HBeAb) cao hơn có ý nghĩa ở nhóm có kiểu gen A sovới nhóm mang kiểu gen D [7377] Trong một nghiên cứu khác tại Châu Á,nơi chủ yếu có kiểu gen B và C người ta thấy rằng tỷ lệ đáp ứng điều trị vớiInterferon cao hơn ở nhóm mang kiểu gen B so với nhóm mang kiểu gen C[4953] Ngay cả trong điều trị interferon ở bệnh nhân có HBeAg âm tínhngười ta cũng thấy có những kết quả tương tự [4650] Ngược lại trong điều trịviêm gan mạn tính bằng lamivudine Thakur và CScs lại thấy rằng mặc dù tầnsuất xuất hiện kiểu gen A và D là như nhau trên 2 nhóm đáp ứng điều trị vànhóm không đáp ứng điều trị Tuy nhiên, trong theo dõi người ta thấy rằngbệnh nhân mang kiểu gen D thường thu được đáp ứng bền vững hơn kiểu gen

A [6973] Một thông báo gần đây nhất khi điều trị viêm gan B mạn tính bằngPyg-intron và lamivudine người ta thấy rằng tỷ lệ chuyển đảo huyết thanh ởcác nhóm bệnh nhân như sau: kiểu gen A (47%), B (44%), C (28%) và D(25%) [4650] Ngược lại, nghiên cứu của Yuen MF và CScs (2003) [93] trênbệnh nhân điều trị bằng lamivudine các tác giả thấy không có sự khác biệt về

tỷ lệ đáp ứng điều trị, tần suất xuất hiện đột biến YMDD (Tyrosine (Y) -–Methionine (M) -– Asparagine (D) - Asparagine (D)) trên 2 nhóm mang kiểugen B và C [8793]

1.2.5 Tình hình nghiên cứu về kiểu gen của HBV trên bệnh nhân là người Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thếgiới, ước tính khoảng từ 15 - 26% quần thể người khỏe mạnh có HBsAgdương tính Tỷ lệ có dấu ấn HBV tăng dần trên bệnh nhân viêm gan cấp, mạn

tính và có thể tới 80 - 90% trên nhóm bệnh nhân xơ gan và ung thưganUTTBG [6223] Mặc dù vậy, cho đến hiện nay vẫn chưa có một nghiêncứu nào tiến hành khảo sát một cách hệ thống về sự phân bố kiểu gen củaHBV ở nước ta Một số nghiên cứu trước đây của các tác giả nước ngoài ởThụy Điển cho thấy trên số lượng bệnh nhân hạn chế gốc Việt kiểu gen B và

C là chủ yếu và một số công bố khác thêm các kiểu gen A, D và tái tổ hợphoặc đồng/bội nhiễm các kiểu gen B và C với các kiểu gen A, D, E và G[8840]; [xx] Gần đây, Trần T Tuấn Huy và cs (2004) đã tiến hành nghiêncứu trên 115 bệnh nhân là người miền Nam Việt Nam bao gồm 39 bệnh nhânviêm gan cấp và 76 bệnh nhân viêm gan mạn tính Các tác giả thấy rằng, ởnhóm viêm gan cấp chủ yếu là kiểu gen B chiếm 74,3% Trong khi đó trênnhóm viêm gan mạn tính kiểu gen C là chủ yếu chiếm 81% [4347] Mộtnghiên cứu khác ở Huế của Trần Xuân Chương trên 80 bệnh nhân viêm ganvirus B cấp cho thấy có 56 trường hợp mang kiểu gen B, 22 trường hợp mangkiểu gan C, 1 trường hợp mang kiểu gen A và 1 trường hợp mang kiểu genhỗn hợp B và C [5] Ở khu vực mMiền Bắc, nghiên cứu của Bùi Xuân Trườngtrên các nhóm bệnh nhân khác nhau cũng cho kết quả tương tự là kiểu gen Bchiếm tỷ lệ 71,9%, kiểu gen C là 29,1%, trong đó kiểu gen B phổ biến hơnhẳn kiểu gen C ở nhóm người mang virus và nhóm bệnh nhân viêm gan mạn[18] Người nhiễm HBV kiểu gen C có nguy cơ bị các bệnh gan mạn tính nóichung cao hơn so với người nhiễm HBV kiểu gen B [18] Một nghiên cứukhác gần đây trên 375 bệnh nhân khá đầy đủ các nhóm bệnh nhân như nhómngười mang HBV không triệu chứng, viêm gan B cấp, viêm gan B mạn, xơgan và UTTBG liên quan HBV cho thấy các kiểu genegen của HBV phổ biếnđược tìm thấy là kiểu genegen A, B, C và D Đi sâu phân tích cho thấy kiểugenegen A thường gặp hơn ở nhóm người mang HBV không triệu chứng sovới nhóm có triệu chứng và ở nhóm không ung thư so với nhóm UTTBG

Ngược lại, kiểu genegen C tìm thấy nhiều ở nhóm UTTBG hơn là ở nhómkhông UTTBG Ngoài ra, ở nhóm ung thư kiểu genegen C cũng được tìmthấy nhiều hơn kiểu genegen B và A [Song Le H, Toan NL và cs, 200688].Như vậy, với những nghiên cứu gần đây nêu trên chúng ta có thể thấy rằngHBV lưu hành ở Việt Nam không chỉ có các kiểu genegen B và C như nhữngthông báo trước đây mà còn có các kiểu genegen khác đã biếtMột số tác giảcũng nhận thấy có sự tái tổ hợp giữa hai kiểu gen B và C ở nước ta [40] Nhưvậy, chúng ta có thể thấy rằng HBV lưu hành ở Việt Nam chủ yếu là mangcác kiểu gen B và C [1], [9], [18] Đây là một hạn chế mà trong thời gian gầnchúng ta cần phải đánh giá để góp phần tiên lượng, lựa chọn điều trị bệnhnhân.

1.3 Các phương pháp xác định kiểu gen HBV

1.3.1 Phương pháp đọc trình tự và phân tích loài

Đây là phương pháp chính xác nhất cho phép xác định kiểu gen củaHBV dựa trên sự khuyếch đại các đoạn gen của HBV và đọc trình tự toàn bộ

bộ gen của HBV sau đó sử dụng phân tích loài cũng như sử dụng công cụBlast và viral genotyping để so sánh với các kiểu gen đã được công bố trênGenBank

Phân tích loài là phương pháp đánh giá và sự liên quan về tiến hóa củacác trình tự với loài khác và trình tự chuẩn Sự xác thực của phương phápdựng cây phân tích loài và phân tích thống kê phải được thực hiện bằng phântích dữ liệu của khoảng 1000 các trình tự Đọc trình tự và phân tích loài cũngđược thực hiện đối với từng gen riêng biệt, đặc biệt là gen S

Phuơng pháp đọc trình tự và phân tích loài đã được Okamoto và CS sửdụng năm 1988 khi phân tích 18 trình tự bộ gen của HBV đã phát hiện hiện ra

4 kiểu gen đầu tiên và được ký hiệu từ A - D Năm 1994, Norder và CS khiphân tích 6 trình tự bộ gen HBV phát hiện thêm hai kiểu gen mới là E và F

Cũng bằng phương pháp đọc trình tự và phân tích loài năm 2000, Stuyverphát hiện thêm kiểu gen G Arauz-Ruiz và cộng sự CS (2002) đã phát hiệnthêm kiểu gen H và đề nghị có 8 kiểu gen từ A - H của HBV được phát hiệncho đến nay Chính vì vậy phương pháp đọc trình tự và phân tích loài đượccoi là phương pháp chuẩn khi xác định một kiểu gen của HBV cũng như xácchẩn một phương pháp khác [232]

Phương pháp đọc trình tự và phân tích loài có ưu điểm là phương phápchính xác nhất cho phép xác định được sự khác biệt của các trình tự Nu., rấtphù hợp cho xác định các kiểu gen mới hay xác định sự tái tổ hợp của cáckiểu gen khác nhau Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải có các trangthiết bị đồng bộ hiện đại, khi tiến hành tốn khá nhiều thời gian, chi phí caocũng như nhân viên được đào tạo chuyên sâu Bên cạnh đó phương pháp này

có hạn chế là không xác định được sự pha trộnđồng/bội nhiễm của nhiều kiểugen khác nhau, do đó độ nhạy sẽ không cao Kỹ thuật PCR cloning cũng chỉ

có thể xác định được kiểu gen trội và chiếm ưu thế hơn và phải sàng lọc nhiềuclones, mất nhiều thời gian và chi phí rất khá tốn kém không thể dùng chochẩn đoán thường qui được

1.3.2 Phương pháp Multiplex - PCR và PCR với các cặp mồi đặc hiệu

PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay được sử dụngtrong nghiên cứu và đã được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán Tuy nhiênkhi phải chẩn đoán nhiều tác nhân thì cùng một lúc phải thực hiện nhiều phảnứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu, do đó dẫn đến chi phí cho một xét nghiệmcao Để tăng cường hiệu quả chẩn đoán và vượt qua những thiếu sót của PCR,Chamberlin và cộng sự CS là những người đầu tiên mô tả và phát triển kỹthuật multiplex - PCR vào năm 1988, tiếp đến là Ballabio và cộng sự CS(1990) cũng phát triển kỹ thuật này cho việc xác định nhiều căn nguyên gây

bệnh cùng một lúc Trong kỹ thuật multiplex - PCR, nhiều gen đích đượckhuyếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng Kỹthuật multiplex - PCR tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất quantrọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hìnhDNA, phân tích định lượng, phân tích đột biếntính và phát hiện RNA Tronglĩnh vực bệnh truyền nhiễm kỹ thuật này rất có giá trị cao trong chẩn đoán xácđịnh virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng Ngoài ra kỹ thuật này còn được sửdụng trong phân tích các sinh vật chuyển gen, phân tích microsatelite và xácđịnh kiểu gen Naito và cộng sựCS (2001) đã phát triển kỹ thuật multiplex -PCR xác định 6 kiểu gen từ A - F của HBV nhưng lại chia thành 2 hỗn hợpphản ứng là hỗn hợp A cho các kiểu gen A, B và C; hỗn hợp B cho các kiểugen D, E và F [441] Kirschberg và cộng sựCS (2003) đã ứng dụng kỹ thuậtnày cho phép phân biệt 6 kiểu gen từ A - F nhưng chỉ thực hiện trong cùngmột phản ứng với độ nhạy là từ 103 - 105 copies/ml [7268] Năm 2006, JinsongChen và cộng sựCS [47] đã phát triển thêm kỹ thuật này cho phép xác địnhđược cả các dưới kiểu gen B1, B2 và C1, C2 Ở nước ta các tác giả như ĐôngThị Hoài An, Trần Xuân Chươngmột số tác giả cũng đã ứng dụng kỹ thuậtnày xác định kiểu gen HBV ở các nhóm bệnh nhân khác nhau [5].

Phương pháp multiplex - PCR và PCR với các cặp mồi đặc hiệu có ưuđiểm là tiết kiệm thời gian, chi phí thấp và dễ thực hiện Cho đến nay cũng đã

có một số thông báo phương pháp này có thể phát hiện được sự đồng bộinhiễm của nhiều kiểu gen khác nhau Tuy nhiên với multiplex - PCR việc tối

ưu hóa phản ứng cũng mất nhiều công đoạn, độ nhạy không cao chỉ đạt 83%

so với đọc trình tự gen (Ren Zhang và CS, 2007) [74] và khi HBV đột biến thìphương pháp này không thể xác định được

1.3.3 Phương pháp sử dụng kỹ thuật lai đầu dò (INNO - LiPA)

Phương pháp xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật lai đầu dò trênthanh INNO - LiPA được phát triển bởi Innogenegentics N.V., Ghent,

Belgium (Bỉ) Các mẫu HBV - DNA của bệnh nhân được khuyếch đại bằngcác cặp mồi bổ sung với vùng có tính bảo tồn cao trong vùng preS1 củagenome HBV Sau đó sản phẩm PCR được lai với các vạch dò đặc hiệu củatừng kiểu gen mà đã được gắn trên thanh INNO - LiPA Trong nghiên cứucủa Teles và cộng sựCS thì chỉ có kiểu gen A, D và F được xác định CarlaOsiowy và cộng sựCS (2003) cũng sử dụng kỹ thuật này cho xác định các 7kiểu gen của HBV trên 188 mẫu đã phát hiện được 7 kiểu gen bệnh phẩm và

sự phù hợp giữa phương pháp lai đầu dò vàso với đọc trình tự gen và phântích loài là 81% Ngoài ra, Pphương pháp lai đầu dò còn xác định được 19trường hợp nhiễm kiểu gen hỗn hợp mà phương pháp giải trình tự phân tíchloài không xác định được Có 4 mẫu cho kết qủa trái ngược nhau giữa 2phương pháp và 5 mẫu cho kết quả không rõ ràng khi sử dụng phương pháplai đầu dò [3028] Ở nước ta phương pháp lai đầu dò cũng được tác giả PhạmHùng Vân ứng dụng cho xác định kiểu gen của HCV [19]

Phương pháp lai đầu dò có ưu điểm là đơn giản dễ thực hiện và đã pháttriển thành bộ kit thương mại Tuy nhiên giá thành còn caođắt và khi HBVđột biến sẽ ảnh hưởng tới quá trình gắn và kết quả lai

1.3.4 Phương pháp Realtime - PCR kết hợp với phân tích Tm

Phương pháp realtime - PCR và realtime - PCR kết hợp phân tíchđường cong nóng chảy (melting curve) dựa trên nguyên lý đếm thời gian thực(realtime) Chúng ta biết rằng có sự khác nhau rõ rệt về nhiệt độ nóng chảycủa các sản phẩm PCR khác nhau vì vậy thời điểm xuất hiện nhiệt độ nóngchảy tối ưu của các sản phẩm PCR khác nhau là không giống nhau Đây lànguyên lý chính của phương pháp này Năm 2004, S Payungporn và cộng sự

CS ứng dụng cho xác định kiểu gen của HBV trên 52 mẫu lâm sàng phát hiệnđược 11 mẫu là kiểu B và 41 mẫu là kiểu gen C Khi so sánh với phương phápPCR - RFLP thì có 3 mẫu là kiểu gen A, 11 mẫu kiểu gen B và 37 mẫu kiểugen C Kết quả đọc trình tự và phân tích loài cho thấy chỉ có 1 mẫu là kiểugen A, 14 mẫu kiểu gen B và 37 mẫu kiểu gen C Như vậy độ chính xác củaphương pháp này theo tác giả là 92,31% [851].

1.3.5 Phương pháp dot blot ngược dòng (FT - RDB)

Phương pháp dot blot ngược dòng là kỹ thuật lai phân tử dựa trên việcthiết kế các probe cho từng kiểu gen dựa vào việc phân tích trình tự các bộgen thu được từ GenBank sau đó gắn lên một màng lai chuyên biệt Tiếp theo

là tìm nhiệt độ lai tối ưu bằng việc lai với sản phẩm PCR nhân đoạn gen củatất cả các kiểu gen HBV đã được miễn dịch hóa Cuối cùng kiểm tra trênHBV - DNA các plasmide tái tổ hợp của các kiểu gen HBV khác nhau.Phương pháp này đã được Ren Zhang và cộng sự CS (2007) phát triển xácđịnh kiểu gen HBV trên 101 mẫu lâm sàng cho kết quả phù hợp với đọc trình

tự là 96% (97/101) [784]

Phương pháp này có ưu điểm là tiến hành nhanh, không cần đòi hỏi cáctrang thiết bị hiện đại và cho phép xác định khá chính xác các kiểu gen đãbiết Tuy nhiên, để thực hiện được phương pháp này đòi hỏi nhân viên phải cóhiểu biết nhất định về thiết kế các probe, việc tối ưu hóa xác định nhiệt độ lai

và không xác định được các kiểu gen mới cũng như khi có đột biến xảy ra

1.3.6 Phương pháp sử dụng oligonucleotide microassay

Kỹ thuật DNA microassay là kỹ thuật lai các đoạn DNA mạch đơnngắn đã được đánh dấu huỳnh quang, với tập hợp (mảng - assay) các đoạnoligonucleotide đã biết trình tự được gắn ở các vị trí xác định trêngenegenchip, để kiểm tra và phát hiện một trình tự nào đó

Kỹ thuật DNA miroassay dựa trên cơ sở các đoạn DNA mạch đơn cầnnghiên cứu có thể bắt cặp với các mẫu dò có trình tự tương đồng nhau theonguyên lý Shargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên các phân tử lai.

Dựa vào kỹ thuật phát hiện huỳnh quang, với các máy quét scannerchuyên dụng có thể xác định được vị trí các phân tử lai, từ đó xác định đượctrình tự của các đoạn DNA mạch đơn, hoặc trình tự gen

Phương pháp này đã được Yajun Song và cộng sự CS (2005) ứng dụngxác định kiểu gen của HBV trên 96 mẫu lâm sàng cho kết quả phù hợp 100 %

so với đọc trình tự [9286]

Phương pháp này có ưu điểm là cho phép xác định chính xác các kiểugen của HBV đã biết dựa trên các probe đặc hiệu cho từng kiểu gen Tuynhiên phương pháp này đòi hỏi phải có các trang thiết bị hiện đại và đội ngũnhân viên được đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật cũng như chi phí cho một xétnghiệm rất cao và không xác định được các kiểu gen mới

1.3.7 Phương pháp huyết thanh học (ELISA)

Để phân biệt các kiểu gen khác nhau, xét nghiệm huyết thanh học vớicác kháng thể đơn clone đã được phát triển [22] Trong nghiên cứu của Usuda

và cộng sự CS (1999) một panel các kháng thể đơn clone của vùng preS2 vàvùng S đã được phát triển cho phép phân biệt các kiểu gen HBV từ A - F Cáckháng thể đơn clone đó cũng có thể được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọcdịch tễ lớn Xác định kiểu gen bằng phương pháp huyết thanh học được khẳngđịnh bằng phân tích trình tự Nu của gen S với panel của 68 chủng HBV đãchỉ ra 100% phù hợp giữa hai phương pháp

Phương pháp này có ưu điểm là dễ thực hiện, giá thành không cao do

đó rất hữu ích cho các nghiên cứu dịch tễ với số lượng mẫu lớn Tuy nhiên nócũng có hạn chế là không phân biệt được các kiểu gen mới và khi HBV đột

biến hay sự tái tổ hợp với các kiểu gen khác thì phương pháp này không pháthiện được Cũng như độ đặc hiệu không cao nên có thể xẩy ra dương tính giả

1.3.8 Phương pháp PCR - RFLP (PCR - restriction fragment length polymorphism)

Phương pháp PCR - RFLP dựa trên sự khuyếch đại một đoạn gen bằngphản ứng PCR, sau đó tiến hành phản ứng RFLP bằng việc sử dụng cácenzyme giới hạn, cuối cùng điện di phân tích tính đa hình dựa vào kích thướccủa các đoạn giới hạn Sự lựa chọn các enzyme giới hạn bằng việc dựa vàophân tích trình tự của các kiểu gen khác nhau đã được công bố trên GenBank.Phương pháp này đã được Mizokami và cộng sự CS (1999) phát triển cho

phép phân biệt các kiểu gen của HBV bằng bốn enzyme là NciI, AlwI, EarI và NlaIV [2281 ] Lindh và cộng sựCS (1998) cũng ứng dụng kỹ thuật này nhưng chỉ sử dụng hai emzyme là AvaII và DpnII cho phép xác định các kiểu gen từ

A - F trên 99 mẫu lâm sàng thì 95 mẫu xác định được kiểu gen trong đó kiểugen A: 23, kiểu gen B: 20, kiểu gen C: 20, kiểu gen D: 22 và kiểu gen E: 3,kiểu gen F là 5 Khi so sánh với đọc trình tự và phân tích loài thì chỉ có 1trường hợp là không phù hợp [57] Hannoun và cộng sựCS (2002) đã phát

triển kỹ thuật này nhưng chỉ sử dụng một enzyme là TasI cho phép phân biệt

các kiểu gen khác nhau Tuy nhiên đoạn khuyếch đại lại nằm trên vùng

preCore [4239] Ở nước ta Bùi Xuân Trường và cộng sựCS (2008) cũng ứngdụng phương pháp PCR - RFLP xác định kiểu gen của HBV trên 182 đốitượng của 16 tỉnh phía Bắc bao gồm 76 người lành mang virus và 106 bệnhnhân mắc bệnh gan mạn tính Kết quả cho thấy chỉ có 2 kiểu gen B và C đượcphát hiện với tỷ lệ lần lượt là 129/182 (70,9%) và 53/182 (29,1%) [18]

Phương pháp PCR - RFLP có nhiều ưu điểm như không cần nhiều cáctrang thiết bị đắt tiền, tiến hành đơn giản và không mất nhiều thời gian do đóchi phí cho một xét nghiệm không cao Ở Việt Nam phổ biến hiện nay sử

dụng phương pháp giải trình tự gen, phương pháp lai đầu dò và multiplex PCR [5], [15], [19] Trong nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu phát triển

-phương pháp PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV có ý nghĩa góp phần làmgiảm giá thành xét nghiệm, phổ biến rộng kỹ thuật, tiết kiệm thời gian, chi phíxét nghiệm và điều trị cho người bệnh

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứuĐối tượng nghiên cứu

Trình tự bộ gen (Genome) HBV chủng hoang dại đại diện cho 8 kiểu genHBV thu được trên Genbank (70 chủng) được sử dụng để thiết kế mồi và lựachọn enzyme giới hạn Ngoài ra còn sử dụng 46 chủng HBV phân lập từ bệnhnhân người Việt Nam đã công bố trên Ngân hàng gen [1], [651] Các chủngHBV hoang dại được sử dụng nghiên cứu có ký hiệu quốc tế là V00866 – A,M57663 – A, X02763 – A, X51970 – A, Z35717 – A, E00010 – A, X70185 –

A, Z72478 – A, L13994 – A, S50225 – A, D23677 – B, D23678 – B, D23679– B, D00330 – B, D00331 – B, D50521 – B, D50522 – B, D54923 – B,D00329 – B, X98077 – B, X97850 – B, X97851 – B, D00630 – C, D12980 –

C, D16665 – C, D16666 – C, D16667 – C, D23680 – C, D23681 – C, D23682– C, D23683 – C, D23684 – C, D28880 – C, D54089 – C, D50517 – C,D50519 – C, D50520 – C, L08805 – C, M12906 – C, M38454 – C, V00867 –

C, X01587 – C, X04615 – C, X14193 – C, X75665 – C, X52939 – C, V01460– D, L27106 – D, U95551 – D, M32138 – D, X02496 – D, X59975 – D,X68292 – D, X72702 – D, Z35716 – D, X97848 – D, X97849 – D, X80924 –

D, X80925 – D, X80926 – D, Y07587 – D, X65257 – D, X65258 – D,X65259 – D, X75657 – E, X75664 – E, X75658 – F, X75663 – F, X69798 –G

Ngoài ra, 95 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg và HBV - DNAdương tính tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học thuộc Trung tâm

Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y được dùng đánh giá độ nhạy, sự phùhợp của hai kỹ thuật PCR-RFLP với đọc trình tự gen

Các mẫu plasmide tái tổ hợp mang toàn bộ bộ gen HBV chủng hoang dại

thuộc các kiểu gen A, B, C, D [15] được sử dụng để đánh giá độ nhạy của

phương pháp, ngưỡng phát hiên và tính chính xác của kỹ thuật PCR -RFLP Thêm vào đó, nghiên cứu sử dụng 30 mẫu DNA tách chiết từ huyếtthanh của các bệnh nhân có HCV -RNA (+) (6 mẫu) và HIV -– DNA (+) (24mẫu) xét nghiệm tại Phòng Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học, Trung tâm

Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y được dùng đánh giá độ đặc hiệu của

kỹ thuật PCR- RFLP

2.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Các sinh phẩm hoá chất chính

1 Hoá chất dùng tách triết DNA, phản ứng

PCR , và điện di gel agarose

HBV - Realtime PCR kits PG Qiagen (Trung Quốc)

2 Hoá chất phục vụdùng cho đọc trình tự

gen

Big Dye Terminator V3.1 Applied BioSystems (Mỹ)

Máy PCR (Thermo cycler)

Máy Realtime - PCR LightCycler 2.0

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)_

Máy lắc ngang reciprocating

Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Specord

Máy phân tích trình tự ADN ABI 3130 XL

Sanyo (Nhật Bản)Applied BioSystems Bio-rad (Pháp)

Roche (Thụy Sỹ)Haeraus (Đức)Thommas Scientitic Bio - Rad (Mỹ)Nuaire (Mỹ)Sanyo (Nhật Bản)Shelab (Mỹ)Memmert (Đức)Amerex Instrument (Đức)Jeio -– Tech (Hàn Quốc)Analytika (Đức)

Applied BioSystems

2.2.3 Trình tự Cc ác cặp mồi dùng trong nghiên cứu

+ Các primer đặc hiệu cho nhân đoạn genegen vùng preCcore của HBV

có trình tự tương ứng là: