xác định thành phần hóa học của các phân đoạn siêu lọc

xác định thành phần hóa học của các phân đoạn siêu lọc

Ph 'an Nghien Cau -Chuang III

"-CU A CA C PHAN DO~N SIE U L()C

Ill.I M\lc tiell ciia nghien CUll.

Cac nghi0n CUllcua cac Lac gia trudc ail xac ainh dich trich cua hil h()t h6ng c6 ho~lt Hnh 1(.1isua 1251 17XI Chung t{)i ti6p tl!c nghi0n cU'Uh~ng cach suOdl!ng plllfdng phap si0u Iqc a~ tach cha't aC>ngd) chan kh()ng cua dich trich nudc cua hi! h(}t h()ng thanh cac phan ao(;ln si0u IQc c6 trqng lu'Qngphan hi khac nhau (ml!c 1.4)

K6 a6, cac ph an ao(;ln si0u Iqc nay au'Qc thli nghi<;m sinh hQc v€ ho(;lt Hnh IQi sua Cac ktt qua 0 ml!c 11.4 cho hitt :

- Cac ph an ao(;ln sieu IQc co trQng luejng phan tli < 5 KD va > 100 KD kh6ng co hO(;ltHnh IQi sua

- Cac ph an ao(;ln sieu IQc 5 - 50 KD va 50 - 100 KD co ho(;lt Hnh leji sua, trong ao ph an ao(;ln 50 - 100 KD co ho(;lttlnh can

Chung Wi tlm hieu thanh ph'an hoa hQc cua cac phan ao(;ln sieu IQc neu tren vdi ml!c akh tlm m()t ho~c vai phu(1ng phap hoa hQc lam chuftn ae d,! aoan trudc xem phan ao(;ln nao co kha Hang co hO(;ltHnh leji sua trudc khi thli nghi<%mCl! the tren aQng v~t (Muon a(;lt k6t qua t6t, s'! thli nghi<;m tren aQng v~t phai thii' tren truu rill tan kern)

Cac phudng pilar hoa hQc g6m co :

S'! ainh ph an ham lu(Jng au(Jng t<ing quat

S'! ainh phan auong a(1n

S'! ainh phan acid uronic

S'! ainh phan ham luejng nitrogen

S'! ainh phan ham luQng protein Loan ph'an

Stf ainh phan amino acid

lIJ.2 Hjnh philn ham h{(Jng duong t6ng qmit b~ng phuong phap so mall, su -d\lng antron

111.2.1.Nguyen Hiecua phuong phap

Antron trong rnoi truong acid Hong ke't hejp vdi san phftrn giam dlp cua auong cho chill mall xanh duc1ng ll!c , co aQ hilp tho ctfc d(;li0 585 nm (Ph'an t6ng quaIl 111.3.)

IlI.2.2 TWu ChUaHh6a cac v~t liQ!lu~lidl!ng

Ph{jn Nghien Cltu -Chu:cmg III

-54 XU'Iy mllu trong nhung 6ng nghi~m di.iebi~t , co th~ tieh ehinh xae vi nhi~t

dO va thai gian dun n6ng giu vai tro quye't dinh trong vi~e hi~n mau

- Dun n6ng cae 6ng nghi~m tren be'p each thuy e6 th~ ehinh nhi~t dO vdi sai

A' + 1oc

so - ,

- Dinh phan m6i mftu 3 fan M6i fan thi nghi~m phai dung dung dieh mftu

chuiin d~ thie't l~p duong bi~u di€n chuiin.

111.2.3 Tae chit sU'dung.

a) H2SO4 d~m di.ie, d =1,84

h) Dung dich thu6c thu' antron : antron (100 mg), them H2SO4 d~ c6 50 ml

( Dung dieh du(jc ban quaIl trong tu I~nh kh6ng qua I thang.)

c) Dung dich de thie't l~p duong bieu di€n ehuiin : glucoz (100 mg) them nude eftt cho du 100 mJ Pha thanh cae dung djch co n6ng dO khac nhau: 20f.!g/ml, 50f.!g/ml ,

100f.!g/ml , 150 f.!g/ml va 200 f.!g/ml

d) Mftu din phan tieh : s6 luQng mftu la I mg, pha thanh dung dich 1 mg/ml nude cftt, gQi la n6ng dO D N6ng dO D thuong rit d~m Pha loang d~ co D/IO, 0/100, 1)/1000 f-)o dO hip thu quang d 585 nm cua cae dung dieh nay Ltfa ehqn 3 n()ng

dO thlch h(jp d~ dinh ph an cae mftu e':1nphan tieh, thi dl;l 20110, 4D/10, 60/10

III.2.4, Thue nghiem

t)anh s6 cae 6ng nghi~m theo Bang 15

"

BANG 15 : t)inh phan duong

s6 thli tt! 6ngII

nghii;:m

mliudinh philo

2

nfJllg di) dung 120 ~lg/llIl

dich

Cho Cae dung dieh da ehuiin bi (0,5 ml) vao m6i 6ng nghi~m nhu da ghi d bang 15 Ngam cae 6ng nghi~m trong nude da 5 phut Cho vao m6i 6ng dung dich thu6e thU' antron (I ml) uk d~u f)~y kin b~ng 1 to giiy nh6m va d~t vao n6i each

h" 1\2 oC+l oC 8 h' L' 1 h ~ K

d"

t uy 7 - trong p ut. am ~n cae ong ng l{(m trong nude a e ngung phan dug f)~ yen trong b6ng t6i, 30 phut f)o dO hftp thu quang d 585 nm t)o mlH6ng 3 l':1n,lfty ke't qua trung binh

Tir dung dich glueoz ehuiin, ve du'ong bieu di€n ehuiin ,

200 Ig/ml

Phf1n Nghien Cau - Chtl(1flg III

-55-Vdi cae mftu din phan tich, nho so do A 585 suy ra n6ng dQ duong (qui ra glueoz) e6 trong dung dich, suy ra ham luQngph'an tram duong t6ng quat trong mJu kh6 c'an ph an itch La'y ke'tqua trung binh cua 3 n6ng dQ 2D/10, 4D/10, 6D/I0 III.2.5 Ke't qua

Ap dl}ng phuclng phap neu tr~n do ham luQng ph'an tram duong t6ng quat eua cae phan do~n sieu lQCva cae phan do~n s~c ky .Vdi m6i mftu tht!c hit%n3 l'an vao cae ngay khae nhau .

Kef qua: Ham lu(Jngph'an tram du(Jng, qui ra glucoz du(Jc ghi d bang] 6.

111.2.6.Hi0n Juan k0t gua

- St! phan tich ham luQng duong t6ng quat cho bie't la phuong phap sieu lQc 0 nhii;t de) ph()ng ho~c d phong l~nh cho ke't qua tuong it!

- Qua thti nghi~m sinh hQc , ke't hQp vdi ke't qua phan tich duong cho tha'y :

cae phan do~n c6 ho~t Huh lQi sua nhu cha't trich ly tho, phan do~n sieu lQe

50 KD - ] 00 KD, co ham luQng duong t6ng quat eao (27,2 % - 32,8 %) so vdi

cae phan do~n kh6ng co ho~t Hnh I(Ji sua nhu phan do~n sieu IQe < 5 KD va phan do~n > 100 KD (14,1 % - 21,2 %)

- Phan do~n sieu lQe 5 KD - 50 KD , c6 ho~t Hnh lQi sua nhung khong eao

Mm , ke't qua phan Heh duong eho tha'y phan do~n nay c6 ham luQng duong khong

eao (24,5% -26%) so vdi cac phan do~n e6 ho~t tinh lQi sua eao.

111.3 Blnh philo ham h)\in~ acid llronic hiin~ phddn~ phap so mall, sit d\ln~ carhazol

111.3.] Nguyen t~e

Trong moi truong acid n6ng, earbazol ke't hQp vdi acid uronic cho san phdm mall Hm, e6 dQ ha'p thu et!c d~i 0 530 nm (ph'an t6ng quan 11.5)

III.3.2 Tae eha't sti dl.lI1g

a) H2SO4 d~m d~c d =1,84

b) Dung dieh carbazol :earbazol( 50 mg) trong etanol tuyt%tdoi(50ml) ( bao quan dung dich trong tll l~nh kh6ng qua 1 thang)

c) Cae dung dich d€ thie't I~p duong bi€u di€n ehudn Acid glicuronic (50 fig) them nude ca't eho du 100 mI Pha cac dung dich c6 n6ng dQ 20 f.lg / ml ;

40 f.lg/ ml ; 60 f.lg/ ml; 80 f.lg/ ml va 100 f.lg/ ml

d) Mftu e'an phan tich : s6 luQng mftu la I mg va pha thanh dung dieh 1 mg / ml nude ea't, gQi la n6ng dQ C N6ng dQ C ra't d~m, phai do thti n6ng dQ thich hQp

Phan Nghien Cau - Clu(dng III

-56-h~ng each pha loilng 00 co CliO, C/lOO, C/lOOO ,1:-)000 hffp thu quang d 530 nm

cua cae dung dich nay Chung WichQncae n6ng uQ 2C/10, 4C/I0 va 6C/IO

.,

BANG 16 : Kct qua phan tich ham hf<jngnitrogen, protein, du'ong va acid uronic

cua cae phan dol;ln

111.3.3.Thu'c nghi€m

8anh so' cae 6ng nghi~m 4 ml then bang 17

Cho cae dung dich oil chuiin hi (300 Ill) van m6i 6ng nghi~m nhu' dil ghi d

hang 17 ,them H2SO4 d~m d~c d = I ,84( I ml ).Lam Il;lnh cae 6ng nghi~m Leong

Illf(jc oa va Hie ol3u f)~y cae <1ngnghi<;m h~ng t(J giffy nh6m.f)un Hong tren n6i

each thuy 20 phllt ,0 1000 C Lam ll;lnh cae 6ng nghi~m, them vao m6i 6ng thu6c

Ihu' carhazol (60 1l1),I~cdl3u 1-)0 yen lrong hong l<1i , 60 phUl (-)0 dO hffp thu

quang 0 530 nm

J

(%)

?

BANG 17: Binh philo acid uronic

phan

dung dich i g/ml i g/m1 g/ml g/ml g/ml 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Ph'an Nghien Cau - Chuang III

-57-Phan li'ng nhf;lY,co the do 2 /lg acid glicuronic / ml dung dich TU'dung dich acid glicuronic, ve duong bieu di~n chu§:n cua A530 , theo n6ng dQ acid glicuronic tang diln Voi cac m~u phan Hch, nho so' do A530 suy ra n'Ong dQ acid uronic trong dung dich va ham luqng philn tram acid uronic trong m~u kho

1I1.3A K6t qua

Ap d~ng phuong phap tren do ham luqng acid uronic cua cac phan dof;ln sieu

, lQc va cac phan dof;ln s~c ky cua dich trich Iy ba hQt bong bdinuoc M6i m~u thljc hi<';n3 fan vao cac ngay khac nhau

hang 16

111.3.5.Bien Iuan k6t qua

- Slj phan tich ham luQng acid uronic cho bitt la phuong phap sieu lQc d di'Cu ki~n nhi~t d() khac nhau cho k€t qua tuong tlj

- Cac phan dof;ln co hof;lt tinh IQi sua ,c6 ham luQng acid uronic caD

(14% - 19,3(70) va cac phan dof;ln khong co hof;lt tinh lQi sua, c6 ham luQng acid

uronic tha'p (4,5% - 11,8%)

- Phan dof;ln eo hof;lt tinh JQi sua khong ra r~t I~m, ph an dof;ln 5- 50 KD, co ham lu(Jng acid uronic tuong d6'i tha'p (9,5% - 12,3%)

IlIA.Bjnh philo ham hiqng cae dtiong ddn qua ddn xua't acetat alditol, btlng si\c

ky khi

iliA I Nguyen t~c

Polisacarid bi thuy giai bdi acid vo elj cho monosaearid ; cha't nay acetil hoa thanh cha't d~n xua't ace tat d~ bay h(ji, c6 th~ xac dinh biing phuong phap s~c ky khi (philn t<5ngquan IIA.)

IlIA.2 Dieu ch€ cha't d~n xua't acetal aJditol

a) Thuy gidi cclc dgi phan tit polisacarid hang acid W) c(/: trong mQt 6ng thuy tinh

(5 ml) c6 d~y n~p kin, cho m~u kho (2 fig) , dung dich acid HCI N (I ml) D~y th~t kin; dun soi cach thuy I gio d 100 °c Cho dung dich vao blnh cilu nho , lam bay hlji d chan khong Them toluen (2 ml) d~ lOf;licac v€t nudc

b) Phdn ang khit h(Ji horohidrur natrium (NaBH4): cho nudc (l ml) vao blnh Call,

NaBH4 khan (20 mg) H6n hQp duQc khua'y deu d trong mQt oem , d nhi~t dQ ph()ng.Them vai giQt CH3COOH 50 (jf)de lof;li JuQng thU'a NaBH4 Lam bay hoi

dung dich d chan thong

(4 x 3 ml) vao blnh cilu d~ bi€n d<5ibor thanh borat trimetil BO3(CH3)3, cha't nay

Phlln Nghien c,iu - Chu(Jng III

-58-deSbay hoi se bj khli'khi cho bay ht1i dung djch d chan khong Ph'an c~n con l<;\ig6m alditol va acetal natrium.

Khua'y deu I gi('j ,0 60 °c Lam bay htjj h6n htjp <3chan khong Lo~i cac v6t nudc

con l<;\ibdi toluen (2 mJ) Dung acetat etil d€ trich acetal alditol.

c) Dieu chff cde chcll :

- Cac cha't d6ng c6 chan kh6ng cua djch trich Iy ba h{)t bong bt)i nudc, cac phan do<;\nsieu lQc, cac ph an do<;\ncua phuong pilar s~c ky lQc gel va s~c ky iran d6i ion 111.4.:).Vieu kiCn phan tich m~u

May s~c ky khl VARIAN :)400

chieu day 0,25 J.1m chi€u dai 0,324 mm x 15 m, chi sO'phan c1!c 52/100 Nhi~t dQcua bQph~n chich mfiu van may: 240 °c

NhiQt d() cua be)ph~n pilat hiQn tin hiQu : 240 °c

Khi sli' dt;lng : nitrogen (3,2 Bar), hidrogen (2,7 Bar)

Chuang tr'lnh nhi~t dQ: 200 °c trong 2 phlit d'au, titp do tang 3 °C/phlit trong 10

phlit,cu(1icung2:)0 °c trong4 phlit T(ingcQng16phlit

Chuftn hj m~u chat: chat acetat alditol( I mg) 1 100 J.11CH2CI2

Dung dung djch (I J.11)cho m6i phan tich

Ap dt;lng di€u ki~n tren d€ phan Hch mfiu acetal alditol chuftn va h6n hQp cua 7 m~u chuftn de hi6t thoi gian lu'u tru' cua tung cha't.Phan tich m6i m~u 3 l'an

111.4.4.Ktt 9ua

BuQc ghi d bang 18

IIl.4.5 Bi~n lu~n ktt qua

a) Trong di~u ki~n lhi nghi~m, acetal galactitol va acetal glucitol co thai gian lUll lru lrung nhau, chi cho m{)l mui vOi nhanh che nh6 d chol mlii, nen ham lu(Jng cua

2 lo~i duong lren du<jc tinh chung

h) Ktt qua phan Hch duong 0 bang 18, ktl hQp vdi ktt qua thli' nghi~m ho<;\ttinh

\(Jisua (Bang II ) cho lhay giua phan do~n co ho~t tinh IQi sua( chat lrich tho; phan do~n 50-100 KD) va phan do~n khong co ho~t tlnh lQi sua

(phan do~n < 5KD, phan do~n > 100 KD) khong co slf khac bi~t nao dang luu Y

v'Cham lu(Jngcac ]o~i duong d(jn

-59-BANG 18 : Ke't qua philn tich ham lu<jng duong ddn cua cac philn do~n khac nhau

Chung Wi ugh) ding khong lhG sli' dl!ng phuong phap philn tich n'ay d€ dlf doan lruoc m(Hphiln do~n co ho~t tinh l<jisua nhu ml!c dich dil neu 0 ph'an III.J c) K0l qua philn rich ham luQngcac lo~i duong ddn cho lhfty polisacarid cua bil h{)lhong chua cac lo~i duong lrung Hnh nhu ramnoz, fucoz, arahinoz, xiloz, manoz, gaJacloz, glucoz lrong do arabinoz co ham luQng cao nha't, k€ li€p la galactoz va glucoz

111.5.Djnh philo ham hiqng protein bhng phddng phIlp so mall, sit d\lng ph~m xanh Coomassie G-250

111 S.I.Nguyen t~c

Trong moi lruong acid ,ph§:m xanh coomassie k€t hQp vdi polipeptid va protein cho

.san ph§:mmau xanh dudng, co dQhftptho clfcd~i ()595 nm (Ph'ant6ng quan II.6). 1l1.5.2 Tac cha't sli' dl!ng

a) Thu6c thli' protein -coomassie cua hang PIERCE

.!ducitol

Phl1n Nghien Ct(u - Chuang III

-60-b) Dung dieh bovine serum albumin (BSA) cua hang PIERCE, chua 2 mg/ml trong

dung dieh NaCI 0,9 % voi azid natrium Dung de thiet l~p dtfong bieu dic§nehu§:n

c) Mftu co ehua protein, e'an phan Heh : c'an it nhfft I mg va pha thanh dung dieh

I mg / mJ H2O va 0,5 mg / mJ H2O

d) Thiet l~p dtfong hi~u dic§n ehu§:n : c'an ve 2 dtfong bieu dic§n chu§:n theo n'Ong

dQ protein d~m d~c (26 - 200 f.lg/ml) hay loang (2,8 - 26 f.lg/ml) theo bang 19

BANG 19 : f)Qhffp tho quang d 595 nm cua cae dung dich BSA dung lam chu§:n

IIL5.3 Thtfc nghiem

f)anh s6 thu tt! cae 6ng nghi~m theo bang 20

BANG 20: f)inh ph an ham Itf<;Jngprotein

S6thli hi 6n~ n~hi~m

N'on~ d(1 m~lI phan

lich ml!lml H2O

Trong nhung 6ng nghi~m (1 ml) d~c bi~t dung de do dQ hffp tho quang, cho

vao m6i 6ng : thu6c thli' coomassie (1 ml) va cae dung dich chu§:n bi d bang 20

(200 ).11).uk nhy trong 5 phut f:)o dQ hffp tho quang d 595 nm f:)o m6i 6ng 3 l'an

Ti! dung dich BSA, ve dtfong bi~u dic§n chu§:n cua A595 theo n'Ong dQ BSA

tang d'an Voi cae mftu phan Hch, dt!a vao s6 do A595 , soy ra n'Ong dQ protein co

trong dung dich (pg/ml) va ham Itf<;Jngph'an tram protein trong mftu kIlo

I

j

N()ng dQ BSA (f.lg/ml) H2O 26.6 40.0 53.3 80.0 106.6 133.0 166.6 200.0

DQ hffp tho quang d 595 nm 0 0.55 0.61 0.67 0.71 0.81 0.86 1.00 1.08

N()ng (h) HSA (f.lg/mJ) H2O 2.8 3.3 6.6 13.3 20.0 26.6

H() hffp tho quang d 595 nm 0 0.10 0.15 0.25 0.30 0.38 0.55

u1 IMiiu 2 I Miiu 3 I Miiu 4 I Miiu5

110.51110.51110.5/110.5/1/0.5

Phl1n Nf!,hien Cliu - ClutClng III

-61-111.5.4 Kt3t qua

Ap dl;lng phuong phap tren do ham luQng protein trong cae philo do:;tn sieu IQe va cae philo do:;tn eua cae phudng phap siie ky

Kef qu(i : Ham lueJng protein tdng quat ghi d bang 16.

111.5.5.Bien luiln ket qua

Trong ml;lctieu tim ki6m mQtphu(jng phap hoa hQe ehuiin d€ dt!'doan philo do~n nao co ho~t Hnh IQisua trude khi dem thli'nghi~m trt!'etiep tren dQng v~t , ket

, qua philo rIch ham luQng protein k6t heJp vdi ket qua thli' nghi~m ho:;tt Hnh IQi sua cho hie't la cac philo do:;tn kh<1ngco ho:;tt Hnh hJi sua (philn do:;tn < 5 KD va philo do~n > 100 KD) co ham lue}ng protein tha'p ( 0,3 - 4,1 %) Trai l:;ti,philo do~n co ho~t tinh le}isli'a, chU'a ham lu'e}ngprotein can (5,Y - 11,4 (}())

V~y phu'ong phap dinh philo ham lueJng protein du'Qc su' dl;lng de dt!' doan philo do~n nao co ho~t Hnh le}isu'a

III.6 Bjnh philo ham hiQng nitrogen

II1.6 1 Phuong phap sli'dung

Dung may philo Heh FRAISSE : d0t mall trong mQt chen b:;tc dudi luong kill helium va oxigen, pIlat hi~n kIll nitrogen bdi may eatharometre Do la m(H diu WHEAS'fON (cau di0n trd bling stungten),vdi mQt dati, nh~n luong kIll pIlat ra tif ce)t, dau kia ngilm trong helium

t)i~n trd cua moi nhanh dIu, tuy thue)c nhi~t de) va helium philo tan heji n6ng mall hdn nilrogcn.Se}i hk tungstcn K , ndi t~o lhanh nilrogcn do slf <.16lnong mall , SC nong hejn va no mang gia trj di4n trd khae Ngu'(Ji ta do sl;l'khac bi0t th6 Hang tlMng u'ng vdi sf; lueJng nitrogen (hlnh 18)

III.6.2 K€t qua

Ghi d bang 16

II1.6.3 Bi0n lu~!l-ket qua

Cae philo do~n co ho:;tt Hnh IQi sua co ham'luQng nitrogen eao (4,1 -8,5 %) va cae philo do:;tn khong co ho:;tt Hnh IQi sua, co ham luQng nitrogen

Lhap(O,Y- 2,Y %).

III.7.Hjnh philo amino acid biing si\c ky long cao ap Hl)LC, su d\lng phli<ing phap t~o thanh ddn xua't o-phtaldialdehid :

m.7.1 Gidi thi~u v~ vi~e chQnphu(jng phap :

Cha't d<1ngco chiln kh<1ngcua djch trlch ha hQth<1ngvdi nude va cae philo

Ph'an Nghien O(U -ChU:(fng III

-62-Helium HINH 18 : Sd d'Ocua phlidng pilar dinh ph an nitrogen

Q 2 ~ Mau

""" v'

; CuDa1050 OC

La

C

Te bao lam chuan

Te bao <10

May ghi

do~n sieu lQc cua n6 chaa nitrogen va protein (bang 16), chang to co sl{ hi~n di~n

cua amino acid trong chung Chung t6i tie'n hanh phan ttch cac amino acid t~i

ph('mg th nghi~m sinh h<,>cSACLA Y ( l1u'dcC(}ng H(}a Pilar), dung may phan Hch

amino acid LKH HIOCHROM 4400 , thlfc hi~n tr011cac m~u nhli : chill d6ng d)

chan kh611gcua djch trich th6 bff h<)tb6ng va phan dol;ln sieu lQc 50 - 100 KD

K0t qua la ca hai m~u d'Cu chaa ph'an IOn cac amino acid vdi ham lli<;fngfir

1 - 15 %, ngo~i trir prolin Do mftu khong chua prolin, titn hanh dinh phan amino

acid b~ng may s~c ky lOng cao ap, sa d~ng chill Q-phtaldialdehid lam cha't ke't h<;fp vdi amino acid (ph'an t6ng quan II.7)

III.7.2 Thl{c nghi~m :

Dung phlidng phap GUOY AO WU [24] :

Q-phtaldialdehid (UP A)

Metano]

Dung dich borat 0,04 M , pH 9,5

2-Mercaptoetanol

Brij-35 (polietilen glicol dodecil eter)

Pha dung dich mdi m6i ngay

5 mg

125 J.Ll 1,12 ml

5 I.d

40 Jll

-I