Báo cáo: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA pdf

Azotobacter có khả năng cố định nitơ, tiết vào môi trường các vitamin, axit amin cũng như cáac chất kích thích sinh trưởng thực vật indol axit Nuôi cấy giống vi khuẩn sinh IAA Azotobacte

Luận văn

Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phat

triển của bi khuẩn sinh IAA

Mục lục

Mục lụcMỞ ĐẦU 1

MỞ ĐẦU 2

1 Đặt vấn đề 2

2 Mục tiêu: 2

3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn 2

4 Giới hạn: 3

PHẦN THỨ NHẤT 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 Vi khuẩn sinh IAA : Azotobacter T5 4

2 Vai trò của IAA 4

3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của VK sinh IAA 7

PHẦN THỨ HAI 8

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

1 Nội dung thực hiện 8

2 Vật liệu nghiên cứu: 8

3 Phương pháp nghiên cứu: 8

3.1 Phương pháp xác định phương trình mối tương quan 8

3.1 1.Pha môi trường 8

3.2 Chuẩn bị dung dịch giống vi khuẩn sinh IAA 9

3.3 Tiến hành thí nghiệm 9

3.3.1 Cấy vi khuẩn Aztobacter T5 vào môi trường nuôi giống 9

Hình 1- Cấy vi khuẩn vào bình để nhân giống 9

3.3.2 Cấy vi khuẩn azotobacter T5 vào môi trường (Cấy lần 2) 9

Hình 2- Cấy giống vào 4 lô có chứa môi trường 11

3.3.4 Tiến hành đo OD 11

Hinh 3 - Tiến hành đo chỉ số OD ở 4 lô thí nghiệm 12

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

IAA là một hocmôn sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin Nguồn nguyên liệu giàu IAA là các phần non và hạt của cây Một số vi khuẩn cũng

có khả năng tổng hợp loại auxin này Phát hiện 3 chủng có khả năng tổng hợp IAA

Azotobacter có khả năng cố định nitơ, tiết vào môi trường các vitamin,

axit amin cũng như cáac chất kích thích sinh trưởng thực vật (indol axit

Nuôi cấy giống vi khuẩn sinh IAA (Azotobacter chủng T5) vào môi

trường peptone, thử nghiệm trên mức nhiệt độ khác nhau: 25oC; 30oC; 35oC;

40oC Xác định IAA sinh ra trong mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau từ đó xác định nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA

2 Mục tiêu:

Xác định nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

sinh IAA( Azotobacter chủng T5) được thu thập tại BMT- Đăklak.

3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: Việc xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của vi khuẩn sinh IAA sẽ tìm ra được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Từ đó sẽ tạo ra môi trường có nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy để vi khuẩn sinh nhiều IAA

Ý nghĩa thực tiễn: Do chất IAA chiết xuất từ thực vật sẽ có giá thành cao, ngoài ra nông dân lạm dụng IAA trong trồng trọt, làm sản phẩm không an

toàn vệ sinh thực phẩm Vì vậy dùng VSV cung cấp IAA cho thực vật sẽ ổn định cho đất và không gây ảnh hưởng cho môi trường

4 Giới hạn:

Ở phạm vi đề tài này chúng tôi chỉ thực thí nghiệm trên đối tượng

khuẩn Azobector chủng T5 được phân lập và tuyển chọn tại Buôn Ma Thuột.

PHẦN THỨ NHẤT TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Vi khuẩn sinh IAA : Azotobacter T5

Azotobacter là một loại vi khuẩn (VK) hiếu khí, sống tự do trong đất,

chúng có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ Ngoài đặc điểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật) Chính nhờ đặc điểm quan

trọng đó VK Azotobacter được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân

bón vi sinh làm tăng năng suất cây trồng

2 Vai trò của IAA

IAA( acid-3- indolaxetic),trong thực vật,IAA có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với glucose hay peptide IAA và các dẫn xuất của nó thường được gọi là auxin hay hormon sinh trưởng Đây là hormon thực vật được biết

Ở thực vật bậc cao, IAA tập trung nhiều trong các chồi, lá đang sinh trưởng, trong tầng phát sinh, trong hạt đang lớn, trong phấn hoa IAA được

tổng hợp tại đỉnh sinh trưởng của thân Tiền chất để tổng hợp nên IAA là acid amin tryptophan Trong cây IAA di chuyển từ đỉnh xuống gốc với tốc độ 10 -15mm/ h

Auxin có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thànhrễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Auxin kích thích

sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều ngang của tế bào làm

tế bào to vềchiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây to về chiều ngang

Auxin hoạt hoá bơm proton, bơm cácion H+ vào trong màng tế bào làm giảm pH của màng tế bào nên hoạt hóa enzyme phân hủy các polisaccaritliên kết giữa các sợi cenlulose làm cho chúng lỏng lẻo và tạc điều kiện cho thành tế bào giãn ra dưới tácdụng của áp suất thẩm thấu của không bào trung tâm Ngoài ra auxin còn kích thích sự tổng hợp các hợp cáccấu tử cấu trúc nên thành tế bào như các chất cenlulose, pectin, hemicenlulose Auxin còn ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, tuy nhiên ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào trong mối tác động tương

hỗ với các phytohormone khác Auxin còn có tác dụng hoạt hóa quá trình sinhtổng hợp các chất như protêin, cenlulose, pectin và kìm hãm sự phân giải chúng, nhờ thế có thể kéo dài tuổithọ của các cơ quan, đồng thời làm tăng quá trình vận chuyển vật chất (nước, muối khoáng, chất hữu cơ) ở trong cây, đặc biệt về các cơ quan sinh sản và cơ quan dự trữ của cây

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng auxin ảnh hưởng mạnh đến hô hấp và quá trình photphorylhóa trong tế bào (Ðioding, 1955;

Audus, 1959; Bonnet, 1957 ) Nồng độ auxin ở mức sinh lý thì tỷ

lệ NADH2/NAD, ATP/ADP tăng lên và ngược lại khi nồng độ auxin cao thì

tỷ lệ đó lại giảm.Auxin gây ra tính hướng động của cây (tính hướng quang và tính hướng địa) Bằng phương pháp sử dụngnguyên tử đánh dấu cho thấy AIA phóng xạ được phân bố nhiều hơn ở phần khuất sáng cũng như ở phầndưới của bộ phận nằm ngang và gây nên sự sinh trưởng không đều ở hai phía cơ quan nên gây tính hướngđộng của các cơ quan, bộ phận của cây.Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn: Hiện tượng ưu thế ngọn là một hiện tượng phổ biến ở trong cây Khichồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng

sẽ ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên Ðây là một sự ức chếtương quan vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn và rễ chính thì cành bên và rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng Hiện tượng này được giải thích rằng auxin được tổng hợp chủ yếuở ngọn chính và vận chuyển xuống dưới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên ức chế sinh trưởng.Khi cắt ngọn chính, lượng auxin tích luỹ trong chồi bên giảm sẽ kích thích chồi bên sinh trưởng Auxin kích thích sự hình thành rễ của cây

Sự hình thành rễ phụ của các cành giâm, cành chiết có thể chia làm ba giaiđoạn: Giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùngmầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài Ðể khởi xướng sự phản phân hóa tế bào mạnhmẽ thì cần hàm lượng auxin khá cao Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn

và có khi còn gây ứcchế Nguồn auxin này có thể là nội sinh, có thể xử lý ngoại sinh Vai trò của auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rấtrõ trong nuôi cấy

mô Trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự

ra rễ là cựckỳ quan trọng

Auxin kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt:Tế bào trứng sau khi thụ tinhtạo nên hợp tử và sau phát triển thành phôi Phôi hạt là nguồn tổng hợp auxin nội sinh quan trọng, khuyếchtán vào bầu và kích thích sự sinh trưởng của bầu để hình thành quả Vì vậy quả chỉ được hình thành khi cósự thụ tinh Nếu không có quá trình thụ tinh thì không hình thành phôi và hoa sẽ bị rụng Việc xử lý auxinngoại sinh cho hoa sẽ thay thế được nguồn auxin nội sinh vốn được hình thành trong phôi và do đó khôngcần quá trình thụ phấn thụ tinh nhưng bầu vẫn lớn lên thành quả nhờ auxin ngoại sinh Trong trường hợpnày quả không qua thụ tinh và do

đó không có hạt.Auxin kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sự hình thành tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốnđược cảm ứng bởi các chất ứ chế sinh trưởng Vì vậy phun auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sựđậu quả và hạn chế rụng nụ, quả non làm tăng năng suất Cây tổng hợp đủ lượng auxin sẽ ức chế sự rụnghoa, quả, lá

3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của VK sinh IAA.

PHẦN THỨ HAI NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Nội dung thực hiện

Xác định mối tương quan giữa nồng độ IAA và chỉ số OD Xác định IAA bằng phương pháp soi OD, nếu OD tăng thì nồng độ IAA tăng

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh IAA của vi

khuẩn Azotobacteria chủng T5

Nuôi cấy giống vi khuẩn sinh IAA (Azotobacter T5) vào môi trường

peptone, thử nghiệm trên 4 mức nhiệt độ khác nhau: 25oC; 30oC; 35oC; 40oC

Xác định IAA sinh ra trong mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau, xem môi trường nào sinh nhiều IAA hơn

2 Vật liệu nghiên cứu:

Vi khuẩn sinh IAA dùng để làm thí nghiêm này là vi khuẩn

Azotobacter chủng T5.

Nguyên liệu làm môi trường pepton : Pepton, cao nấm men, nước máy Dụng cụ: 16 ống nghiệm, 1 bình tam giác 500ml, ống đong, bông không thấm, giấy bạc, đũa thủy tinh, que cấy, đèn cồn, pypet

3 Phương pháp nghiên cứu:

3.1 Phương pháp xác định phương trình mối tương quan

3.1 1.Pha môi trường

- Môi trường pepton:

+ Peptone 5g + Cao nấm men 2,5g + Nước máy 0,5lit

- Cho 5g pepton; 2,5g cao nấm men và 0,5 lit nước máy vào nồi inox, sau đó đun nóng và khuấy đều cho pepton và cao nấm men tan hết Tiếp theo

đổ vào bình tam giác 500ml

- Riêng các dụng cụ còn lại gói giấy báo đem sấy để tiệt trùng

3.2 Chuẩn bị dung dịch giống vi khuẩn sinh IAA

Chuẩn bị ống giống vi khuẩn sinh IAA : Azotobacter chủng T5

3.3 Tiến hành thí nghiệm

3.3.1 Cấy vi khuẩn Aztobacter T5 vào môi trường nuôi giống

- Lau phòng cấy: Lau toàn bộ phòng cấy bằng cồn 900 ,sau đó bật tia

UV trong vòng 15 phút rồi tắt

- Tiến hành cấy giống vi khuẩn: Cấy giống vào bình tam giác chứa môi trường đã chuẩn bị

Hình 1- Cấy vi khuẩn vào bình để nhân giống

- Để vào nơi thoáng mát, sau2 ngày sẽ đem giống cấy lần 2 vào các ống nghiệm

- Gồm 16 ống nghiệm chia làm 4 lô.

- Mỗi lô gồm 4 ống nhưng chỉ cấy vi khuẩn vào 3 ống, 1 ống không cấy

vi khuẩn để làm đối chứng khi đo OD

- Sau khi cấy giống vào môi trường giống 2 ngày ta tiến hành cấy truyền vi khuẩn từ môi trường giống sang 12/16 ống nghiệm đã chia lô và đánh dấu sẵn

- Lau phòng cấy bằng cồn, và sau đó bật tia UV trong 15 phút

- Đem 16 ống nghiệm và bình vào phòng cấy, lắc đều các bình tam giác, lấy bông và giấy bạc của bình giống, hơ nhẹ miệng bình giống, tay phải cầm pipetman gắn đầu tip vô trùng ( chỉnh thể tích 1 ml) hút sinh khối rồi bơm và các ống nghiệm của 4 lô đã đánh dấu( mỗi lô bơm 3 ống, 1 ống làm đối chứng)

- Đặt nút bông các ống nghiệm của 4 lô sau đó để 4 lô ở 4 mức nhiệt độ khác nhau:

Hình 2- Cấy giống vào 4 lô có chứa môi trường

+ Lô 1: 25oC( nhiệt độ phòng)

+ Lô 2: 30oC

+ Lô 2: 35oC

+ Lô 4: 40oC

3.3.4 Tiến hành đo OD

- Sau khi cấy 3 ngày, ta đem 4 lô ra đo OD để xác định số lượng tế bào

vi khuẩn

- Bật máy đo OD, lắc đều các ống nghiệm số

- Đo OD xác định nồng độ tế bào vi khuẩn ở các ống thuộc 4 lô có nhiệt

độ khác nhau

+ Lô 1: 25oC( nhiệt độ phòng): Lấy ông nghiệm môi trường chuẩn 1 đổ vào ống puvet ( 0/1), sau đó đổ lần lượt 3 ống nghiệm môi trường 1 có nuôi cáy vi khuẩn vào 3 ống puvet đánh thứ tự 1,2,3 Tiếp theo ta đo OD ở bước sóng 610nm, đặt ống puvet 0/1 sau đó bấm nút “cal” để về 0, rồi đặt ống puvet

1 vào và số OD đo được là 0,115; ống puvet 2 : 0,120; ống puvet 3: 0,111

+ Lô 2: 30oC: Đo OD xác định nồng độ tế bào vi khuẩn ở bình môi trường 2(nồng độ tryptophan 0,1%): làm các bước tương tự như trên 3 ống puvet có số đo OD lần lượt là: 0,100; 0,103; 0,101

+ Lô 3: 35oC: Đo OD xác định nồng độ tế bào vi khuẩn ở bình môi trường 4(nồng độ tryptophan 0,2%): làm các bước tương tự như trên 3 ống puvet có số đo OD lần lượt là: 0,135; 0,138; 0,139

+ Lô 4: 40oC: Làm các bước tương tự như trên 3 ống puvet có số đo OD lần lượt là: 0,148; 0,135; 0,154

Hinh 3 - Tiến hành đo chỉ số OD ở 4 lô thí nghiệm

Nhận xét: Lô số 2 có chỉ số OD thấp nhất điều đó có nghĩa là số lượng

vi khuẩn nhiều nhất Như vậy với điều kiện nhiệt độ 30oC thì vi khuẩn sinh IAA sinh trưởng và phát triển tốt nhất

KẾT LUẬN

Qua các bước thí nghiệm và tiến hành đo OD ta thấy ở các điều kiện

nhiệt độ khác nhau thì sự sinh trưởng của vi khuẩn Azotobacter T5 cũng khác

nhau

Ở điều kiện nhiệt độ 30oC là nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát

triển của vi khuẩn Azotobacter T5 vì có chỉ số đo OD thấp nhất (0,100; 0,103;

0,101), điều này cũng có nghĩa là nồng độ IAA của môi trường này là cao nhất

Kết quả thí nghiệm cho thấy khi nhiệt độ vượt quá ngưỡng tối ưu, nếu nhiệt độ càng cao thì sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA càng giảm dần

Như vậy điểm cực thuận về giới hạn nhiệt độ của Azotobacter T5 là

30oC trong nuôi cấy loại vi khuẩn này cần tạo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho

sự sinh trưởng và phát triển của chúng để thu được sinh khối lớn nhất