Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 6 docx

Ở chương này chúng ta sẽ tìm hiểu những cloning vector được các nhà SH phân tử thường dùng, tìm hiểu về tính chất, cách sử dụng của các loại cloning vector.. 6.1 Những vector tạo dòng dự

Chương 6: CLONING VECTOR CHO E.COLI

Ngày nay, những thí nghiệm cơ bản liên quan đến việc tạo cloning gene được quan tâm Trong chương 3,4 và 5 chúng ta đề cập đến vấn đề làm thế nào để có thể tinh sạch DNA từ phần chiết của tế bào? Làm thế nào để phân tử DNA tái tổ hợp có thể được tạo ra trong ống nghiệm? Làm thế nào để phân tử DNA có thể được chuyển vào trong tế bào sống? Làm thế nào recombinant clones được đặt lên hàng đầu?

Ở chương này chúng ta sẽ tìm hiểu những cloning vector được các nhà SH phân tử thường dùng, tìm hiểu về tính chất, cách sử dụng của các loại cloning vector

Sự đa dạng lớn các lọai vector tồn tại cùng với việc sử dụng E.Coli như là sinh vật chủ Điều này không có gì ngạc nhiên bởi vì vai trò chính của vi khuẩn đã được phát hiện trong nghiên cứu cơ bản hơn 50 năm qua Nguồn thông tin phong phú về vi sinh, sinh học di truyền về E.Coli đã đóng góp vào hầu hết các nghiên cứu chủ yếu về cấu trúc và chức năng của gene, đã được đưa vào vi khuẩn này như là sinh vật thực nghiệm Những năm gần đây, việc nghiên cứu tạo dòng gene và sinh học phân tử có mối quan hệ lẫn nhau – trở thành 1 thành tựu quan trọng trong tạo dòng gen, đã tác động kích thích nghiên cứu Nhu cầu của việc nghiên cứu thôi thúc việc phát triển nhiều cloning vector ngày càng tinh vi và phức tạp hơn

Chương này chủ yếu đề cập đến những loại cloning vector E.Coli quan trọng và công dụng đặc biệt của chúng

6.1) Những vector tạo dòng dựa vào plasmid của E.Coli:

Những vector tạo dòng đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tạo dòng gene là những plasmid của vi khuẩn nhỏ Một số lượng lớn vector plasmid khá nhau có thể được sử dụng với E.Coli, cĩ từ những nhà cung cấp thương mại Chúng là sự kết hợp của việc dễ dàng tinh sạch và đặc tính mong muốn như là hiệu quả chuyển gene cao, thuận lợi cho việc chọn lựa maker để chuyển gene và tái tổ hợp và khả năng tạo dòng thích hợp với những DNA lớn (lên đến 8kb) Hầu hết những thí nghiệm phổ biến đã sử dụng 1 hay nhiều các loại vector plasmid khác nhau

Vector đầu tiên được phát triển và vẫn được sử dụng phổ biến đến ngày nay là PBR322, đã được trình bày ở chương 5 Để minh hoạ cho những nguyên tắc chung của việc chọn lọc biến đổi và nhận biết sự tái tổ hợp (Tr.95) Chúng ta bắt đầu nghiên cứu plasmid vector E.Coli bằng việc tìm hiểu cặn kẽ PBR322

6.1.1) Danh pháp của vector plasmid trong cloning:

Tên “PBR322” tuân thủ theo quy định chuẩn cho danh pháp vector

“P” – chỉ ra đây là plasmid

“BR” – miêu tả thí nghiệm nơi mà vector đó được xác định cấu trúc lần đầu tiên (BR la viết tắc của 2 nhà bác học Bolivar và Rodirge những người phát triển PBR322 )

322 – để phân biệt plasmid này với những loại plasmid khác được tạo ra trong cùng 1 đợt thí nghiệm (1 số plasmid gọi là PBR325, PBR327, PBR328,

……)

6.1.2) Đặc tính có lợi của PBR322:

Bản đồ di truyền và tính chất vật lý của PBR322 giải thích tại sao plasmid là 1vector tạo dòng phổ biến

Đặc tính hữu dụng đầu tiên của PBR322 là về kích cỡ của nó, ở chương 2 nói rõ rằng 1 vector tạo dòng phải nhỏ hơn 10kb để tránh những vấn đề như là DNA bị gãy trong suốt quá trình tinh sạch PBR322 có kích thước là 4363bp, điều đó có nghĩa là nó không chỉ có thể được tinh sạch 1 cách dễ dàng mà nó còn có thể xây dựng được phân tử DNA tái tổ hợp Ngay cả khi thêm đoạn DNA 6kb thì phân tử PBR322 tái tổ hợp vẫn có kích thước phù hợp

Đặc trưng thứ hai của PBR322 được đề cập trong chương 5, nó có mang 2 vị trí gen kháng kháng sinh,kháng ampiciline hoặc tetracyline, có thể được sử dụng như là 1 maker chọn lọc cho những tế bào chứa plasmid Và mỗi gen maker có 1vị trí cắt duy nhất dùng cho thí nghiệm cloning Việc chèn vào DNA mới trong PBR322 được cắt bởi PstI, PvuI hay Scal sẽ bất hoạt gen ampR và sử dụng 1 trong 8 loại enzyme endonuclease giới hạn (đáng chú ý là BamHI và HindIII) bất hoạt gen kháng Tetracyline Các vị trí cắt đa dạng này có thể được sử dụng cho việc bất hoạt do xen đoạn, điều đó có nghĩa là l PBR322 có thể sử dụng để clone những đoạn phân tử DNA có kiểu đầu sole

Thuận lợi thứ ba của PBR322 là khả năng sao chép cao, thông thường thì có khoảng 15phân tử tồn tại sau khi biến nạp tế bào E.Coli nhưng số lượng này có thể tăng lên (khoảng 1000-3000) bằng sự khuyếch đại plasmid khi có, sự hiện diện của chất ức chế sự tổng hợp protein chẳng hạn như là Chloramphenicol Việc nuôi cấy E.Coli sẽ cung cấp 1 lượng lớn phân tử PBR322 tái tổ hợp có triển vọng

6.1.3) Các dòng PBR322:

Điểm thuận lợi đáng chú ý của PBR322 khi là cloning vector không phải ngẫu nhiên Trong thực tế plasmid được thiết kế để cấu trúc cuối cùng sẽ có tính chất mà ta mong muốn Yù tưởng vế cấu trúc của PBR322 đã được chỉ ra

ở (H 6.2a)

H6.2(a) thao tác thiết kế pBR322

Việc sản xuất PBR322 mang tính thương mại thì yêu cầu những kỹ thuật thao tác DNA đầy đủ và khéo léo được trình bày ở chương 4 Tóm tắt về kết quả thao tác này như (H 6.2b )Từ đó cho thấy rằng PBR322 trong thực tế bao gồm dẫn xuất từ 3 plasmid khác nhau trong tự nhiên Gen ampR có plasmid R1 1 loại plasmid kháng kháng sinh điển hình đã tìm thấy trong quần thể E.Coli tư ï nhiên (Tr17) Gen TetR lấy từ R6-S là 1 plasmid kháng sinh thứ hai, và điểm khởi đầu sao chép có nguồn gốc từ PMB1 giúp sự nhân lên trực tiếp của vector trong tế bào PMB1 có mối quan hệ chặt chẽ với sản phẩm do E.Coli tạo ra là plasmid ColE1 có khả năng sản xuất ra coliein

6.1.4) Những cloning vector plasmid E.coli điển hình khác:

PBR322 thì được phát triển sau thập niên 1970, những bài báo đầu tiên nghiên cứu miêu tả nó được xuất bản năm 1977 là từ đó thì những cloning vector plasmid được thiết kế và đa số chúng là dẫn xuất từ PBR322, bằng những thao tác tương tự được tóm tắt ở (H 6.2a) Không thể nào miêu tả hết tất cả các loại vector này đặc biệt khi chúng có nhiều sự biến đổi, 3 dự án sau đây sẽ chứng minh cho hầu hết các đặc trưng quan trọng nhất của cloning vector plasmid ứng dụng trong kỹ thuật di truyền ngày nay

a) PBR327 – Một plasmid có số lượng sao chép cao:(h 6.3a)

PBR327 được xây dựng bằng việc loại bỏ 1 đoạn DNA có kích thước 1089bp từ PBR322 Sự loại bỏ này không ảnh hưởng đến ampR và tetR nhưng khả năng

sao chép và tiếp hợp của pasmid này thì bị thay đổi và kết quả là PBR327 sẽ có

2 điểm quan trọng khác với PBR322

H6.3 2 plasmid cloning vector Ecoli

1) PBR327 có 1 số lượng sao chép cao hơn PBR322, có khoảng 30-45 phân tử cho mỗi tế bào E.Coli Điều này không liên quan nhiều đến việc tăng số lượng plasmid mà ta quan tâm, khi mà cả 2 plasmid này có thể khuyếch đại số lượng bản sao lớn hơn 1000 Tuy nhiên khả năng sao chép cao của PBR327 trong tế bào bình thường thì làm cho vector này phù hợp hơn nếu mục đích của các cuộc thí nghiệm là nghiên cứu chức năng của gen được clone Trong những trường hợp này lượng gen đóng vai trò quan trọng, vì gen được clone có nhiều bản sao hơn, việc tìm ra hiệu quả của gen trong tế bào chủ dể phát hiện hơn, PBR327 với khả năng copy cao vì thế đó là sự lựa chọn tốt hơn PBR322 trong việc cloning này

2) Việc loại cũng như phá huỷ khả năng tiếp hợp của PBR322 làm cho PBR327 là 1 plasmid không có khả năng tiếp hợp nên không thể trực tiếp chuyển nó vào trong nhiều tế bào E.Coli khác, điều này thì quan trọng

cho biological containment (kiểm soát sinh học: phương pháp phòng

ngừa để ngăn chặn sự sao chép của phân tử DNA tái tổ hợp trong vsv

trong môi trường tự nhiên, phòng ngừa Sh bao gồm việc sử dụng các vector và sinh vật chủ đã được biến đổi để chúng không tồn tại bên ngoài

phòng thí nghiệm) Hạn chế khả năng tiếp hợp của phân tử PBR327 tái tổ

hợp là giải pháp để ngăn chặn sự lây nhiễm của chúng vào vi khuẩn định

cư trong ruột khi có sự cố kỹ thuật xảy ra Ngược lại, PBR322 có thể tăng số lượng 1 cách tự nhiên trong E.Coli về mặt lí thuyết bằng sự tiếp hợp nên thực tế PBR322 được ít sử dụng hơn (mặc dù PBR322 ít phức tạp hơn) để giảm mức tối thiểu cơ hội xảy ra những vấn đề trên Tuy nhiên PBR327 cũng có thể xảy ra trường hợp tương tự nếu gene được clone chứa tiềm năng có hại

b) PUC8-plasmid chọn lọc gen Lac:

Các loại vector này được đề cập ở chương 5, khi nhận biết sự tái tổ hợp bằng sự bất hoạt do xen đoạn của gen -Galactocidase (Tr 97) pUC8 là dẫn xuất từ PBR322 mặc dù chỉ còn vùng khởi đầu sao chép và gen kháng ampR Trình tự nucleotid của gen ampR đã được biến đổi không chứa 1vị trí cắt duy nhất Tất cả các vị trí cloning này được tập trung vào 1 đoạn ngắn của gen lac Z’ chứa trong pUC8

pUC8 có 3 thuận lợi quan trọng vì thế nó là 1 trong những cloning vector phổ biến nhất trong E.Coli

Đầu tiên là tính ngẫu nhiên: Trong quá trình thao tác xây dựng pUC8, xảy ra đột biến ở điểm khởi đầu sao chép Trước khi khuyếch đại thì plasmid này có khoảng 500-700 bản sao Điều này là hiệu quả có ý nghĩa đối với sản lượng sản lượng DNA clone có thể đạt được từ việc chuyển đổi vào tế bào E.Coli với những plasmid pUC8 tái tổ hợp

Thuận lợi thứ hai :Ta cĩ thể xác định phân tử tái tổ hợp có thể thành công bằng 1 tiến trình đơn giản nhờ vào môi trường agar chứa ampiciline và X-gal (Tr 98)

Đối với PBR322 và PBR327 , sự chọn lọc tái tổ hợp là 1 kỹ thuật gồm nhiều bước đòi hỏi cấy từ môi trường kháng kháng sinh này sang môi trường kháng kháng sinh khác(Tr 96) Vì vậy thí nghiệm về cloning với pUC8 chỉ cần một nữa thời gian so với PBR322 hay PBR327

Thuận lợi thứ ba của pUC8 là việc tập hợp những vị trí cắt giới hạn, điều đó cho phép 1 đoạn DNA có 2 đầu sole (Stich end) (1vị trí cuối EcoRI và BamHI ở vị

trí khác) để clone mà không cần có sự tham gia các đoạn linker(linker là chuỗi

mã DNA nhân tạo, bổ sung vào các đoạn phân tử DNA mục tiêu nhằm tạo ra

1vị trí phân cắt hạn chế của E cắt giới hạn) (H6.4a)

H6.4 plasmid pCU

(a) nhĩm các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pCU8

(b) nhĩm các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pCU18

Những vector pUC khác có thể kết hợp những vị trí cắt khác nhau và tạo nên tính linh động cho việc clone các đoạn DNA (H.6.4b) Hơn thế nữa, nhóm vị trí cắt trong những vector này tương tự như những nhóm trong M13mp (Tr119) DNA được clone vào là 1 thành phần của nhóm pUC8 có thể được chuyển trực tiếp vào M13mp Bằng kỹ thuật giải trình tự DNA hay sự phát sinh đột biến Invitro cĩ thể xác định cấu truc của nĩ(H 6.4c) (xem trang 193-223 để miêu tả quá trình này.)

c) pG EM3Z-sự dịch mã Invitro của DNA được clone (H.6.5a):

H6.5 pGEM3Z

(a) sơ đồ của vector pGEM3Z

(b) tổng hợp RNA trong invitro gồm các vị trí căt ( EcoRI, …………, HindIII)

pGEM3Z rất giống vector pUC, nó cũng mang gene ampR và gene lac Z’ và chứa các nhóm vị trí cắt giới hạn, có kích thước gần giống nhau Điểm đặc trưng của pGEM3Z là thêm vào 2 đoạn DNA ngắn, mỗi đoạn hoạt động như là 1vị trí nhận biết cho việc gắn 1 enzyme RNA polymerase, 2 trình tự promotor đều nằm ngoài nhóm các vị trí cắt và được sử dụng cho việc chuyển 1 đoạn DNA mới vào trong phân tử pGEM3Z Đều này có nghĩa là nếu 1 phân tử pGEM3Z tái tổ hợp được trộn với 1 RNA polymerase thuần khiết trong ống nghiệm thì sự phiên mã sẽ xuất hiện và bản sao RNA của đoạn clone được tổng hợp Đoạn RNA được tạo ra và sử dụng như là mẫu lai (Tr.168) hoặc đáp ứng cho các mục đích thí nghiệm của việc nghiên cứu về tiến trình RNA (chú ý có sự loại bỏ của cả đoạn intron) hay sự tổng hợp protein

Những promotor được mang bởi pGEM3Z và những vector khác của loại này thì không có các trình tự chuẩn được nhận ra bởi RNA polymerase của E.Coli Trong khi đó 1 trong những promotor đặc hiệu cho RNA polymerase được ghi mã bởi bacteriophage T7 và promotor còn lại thì đặc hiệu RNA polymerase SP6 Những RNA polymerase này được tổng hợp trong suốt quá trình xâm nhập E.Coli với 1 hay nhiều loại phage và chịu trách nhiệm phiên mã

các gene của phage Chúng được chọn để phiên mã invitro vì đó là những enzyme có hoạt tính cao (Lưu ý là toàn bộ quá trình xâm nhập phân giải chỉ mất

20 phút) có thể tổng hợp 1-2 g RNA mỗi phút, tạo ra nhiều hơn so với dùng E.Coli chuẩn

6.2) Cloning vector đưa vào bacteriophage M13:

Colning vector có1 yếu tố thiết yếu là nó phải có phương tiện sao chép trong tế bào chủ, với yêu cầu này thì vector plasmid phải dễ đáp ứng ngay cả khitrình tự DNA ngắn có thể hoạt động như là điểm khởi đầu sao chép plasmid Phần lớn những enzyme cần cho sao chép được cung cấp bởi tế bào chủ Những thao tác phức tạp chẳng hạn như là việc tạo ra PBR322 rất lâu (H.6.2a) sao cho cấu trúc cuối cùng của nó có chứa điểm khởi đầu sao chép không bị ảnh hưởng với bacteriophage như M13 có liên quan đến sự tái tạo thì phức tạp hơn nhiều Thông thường các phân tử DNA phage có mang nhiều gen, cần thiết cho sự sai chép bao gồm những gen được ghi mã cho lớp vỏ protein phage vànhững enzyme sao chép chuyên biệt của phage Sự thay đổi hay là sự loại bỏ 1 trong những gen nay sẽ làm hư hại hay phá hủy khả ngăng sao chép của phage, vì vậy phân tử DNA phage ít có cơ hội thay đổi Nói chung cloning vector phage không có sự khác biệt đáng kể so với những phân tử bố mẹ

Vấn đề trong thiết kế cloning vector phage được trình bày khi xem xét M13 Bộ gen M13 thông thường là 6,4kb, hầu hết bộ gen người thường chứa 10

gen được gắn kết nhau (H.6.6)

Mỗi gene thì cần thiết cho sự sao chép của phage, đây là trình tự đơn cĩ 507 nucleotide mà ta có thể gắn thêm vào mà không làm đứt gãy các gene này

Thực tế vùng này bao gồm điểm khởi đầu sao chép vẫn còn nguyên vẹn.Rõ ràng , ở đây cũng có chút khó khăn để sửa đổi bộ gen của M13

Tuy nhiên 1 sự hấp dẫn đáng được lưu ý của M13 là có thể chứa thêm 1 phiên bản DNA được clone mạch đơn (Tr.26) đặc điểm này hoạt động như 1 tác nhân kích thích cho sự phát triển của cloning vector M13

6.2.1) Việc hoàn thiện cloning vector M13mp2:

Bứơc đầu tiên trong xây dựng cloning vector M13 là chèn thêm gen lac Z’vào trong trình tự liên gene(trình tự khác gene) Việc này sẽ làm tăng các điểm tan trong mơi trường X-gal

M13mp1 khơng chứa một vị trí cắt duy nhất trong gene LacZ’ Tuy nhiên nó chứa hexanucleotide GGATTG ở gần điểm khởi đầu sao chép,1 sự thay đổi chuỗi nucleotide đơn sẽ làm cho GAATTG như là 1 vị trí cắt bởi EcoRI Nhờ vào sự

đột biến in vitro tạo ra các sữa đổi trên Và kết quả là tạo ra M13mp2 (H.6.7b)

H6.7 (a) cấu trúc của M13mp1

(b) M13mp2 bắt nguồn từ bộ gene của M13 hoang dại

, M13mp2 có 1 sự thay đổi đáng kể về gen lac Z’ (bộ 3 thứ 6 mã hoá cho asparagine thay vì aspatic acid) nhưng enzyme B-galactosidase được tạo ra khi M13mp2 xâm nhiễm tế bào vẫn có chức năng tốt

M13mp2 là cloning vector M13 đơn giản nhất Đoạn DNA đầu sticky enh được cắt bởi EcoRI có thể chèn vào vị trí clone và tái tổ hợp làm điểm tan hiện rõ trong mơi trường x-gal agar

6.2.2) M13mp7-Vị trí clone đối xứng:

Các bước tiếp theo trong việc phát triển vector M13 là thêm vị trí cắt giới hạn vào gen lac Z’ Việc làm này thành công khi tổng hợp 1 đoạn

oligonucleotide ngắn trong ống nghiệm gọi là polylinker(điểm đa tách dòng)

Đoạn này gồm những vị trí cắt và có những đầu Sticky end được cắt bởi EcoRI (H.6.8a), đoạn polylinker này gắn vào vị trí EcoRI của M13mp2 tạo ra M13mp7 (H6.8b) là 1 vector phức tạp hơn với 4 vị trí clone (EcoRI, BamHI, SalI, pstI)

H6.8 cấutrúc của M13mp7

(a0 đọan polylinker

(b) đọan chèn vào vị trí EcoRI của M13mp2 chú ý rằng vị trí cắt SalI cũng đuợc nhân biết

Đoạn polylinker được thiết kế để nó không làm đứt gãy hoàn toàn gen lac Z’, việc đọc thứ tự của gen được duy trì suốt đoạn polylinker Mặc dù vector này thay đổi chức năng nhưng enzyne B- galactosidase vẫn được tạo ra Khi M13mp7 được bị phân cắt với cả EcoRI, BamHI, Sal, 1phần hay tất cả các đoạn

polylinker thì được cắt bỏ (H6.9a)