thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế bằng kỹ thuật trung hòa

ELISA: Thử nghiệm miễn dịch gắn men Enzyme-linked Immunosorbent assay RIA: Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ Good Manufacturing Practice IVAC Viện vắc xin và sinh phẩm y tế Institute of va

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

**************

BÙI SỸ DŨNG

thẩm định qui trình xác định hiệu giá

huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế

bằng kỹ thuật trung hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

**************

BÙI SỸ DŨNG

thẩm định qui trình xác định hiệu giá

huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế

bằng kỹ thuật trung hòa

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2011

PGS.TS, Lê Văn Phủng, Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin

và Sinh phẩm Y tế, Trưởng bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội

và tạo điều kiện cho nghiên cứu và

-

định Quố

, nhưng không phải là ít nhất

, những người

Bùi Sỹ Dũng

Bùi Sỹ Dũng

ELISA: Thử nghiệm miễn dịch gắn men

(Enzyme-linked Immunosorbent assay)

RIA: Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ

(Good Manufacturing Practice)

IVAC Viện vắc xin và sinh phẩm y tế

(Institute of vaccine and medical biologicals)

(Internationnal Unit)

KĐQG: Kiểm định quốc gia

HTKĐTUVC: Huyết thanh kháng độc tố uốn ván chuẩn

HTKĐTUVTN: Huyết thanh kháng độc tố uốn ván thử nghiệm

L+/10: Liều thử thách của độc tố uốn ván

MCQT: Mẫu chuẩn quốc tế

NICVB: Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

(National Institute for Control of Vaccine and Biologicals)

(Optical Density)

(Technical Report Series)

TCYTTG: Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

(World Health Organization)

TIG-H: Kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc từ người

(Tetanus Immuno-Globulin-Human)

ISO: Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

(International Standard Organization)

SAT: Kháng độc tố uốn ván

(Serum Anti Tetanus)

(Standard Operating Procedure)

(Standard deviation)

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 14

1.1 Thẩm định qui trình 14

1.1.1 Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình 14

1.1.2 Yêu cầu chung 14

1.1.3 Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định 15

1.2 Vi khuẩn uốn ván và huyết thanh kháng uốn ván 20

1.2.1 Vi khuẩn uốn ván 20

1.2.2 Kháng độc tố uốn ván 24

1.2.3 Huyết thanh kháng độc tố uốn ván 26

1.2.4 Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván 27

1.3 Kiểm định chất lượng huyết thanh kháng độc tố uốn ván 33

1.3.1 Yêu cầu chung 33

1.3.2 Các tiêu chí kiểm tra chất lượng kháng độc tố uốn ván 33

1.3.3 Xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván bằng kỹ thuật trung hòa 35

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Đối tượng nghiên cứu 40

2.2 Nguyên vật liệu 41

2.2.1 Động vật thí nghiệm 41

2.2.2 Độc tố uốn ván 41

2.2.3 Mẫu chuẩn 41

2.2.4 Mẫu thử nghiệm 41

2.2.5 Dung dịch pha độc tố uốn ván và huyết thanh kháng độc tố uốn ván 41

2.2.6 Dụng cụ 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu 42

2.3.1 Thiết kế thử nghiệm và cách xác định độ đúng, hệ số biến thiên, hệ số tương quan 42

2.3.2 Các bước tiến hành cho một lần thử nghiệm 44

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 Độ đúng 48

3.2 Độ chính xác 55

3.3 Độ tuyến tính 62

Chương 4: BÀN LUẬN 63

4.1 Thử nghiệm "có giá trị" và "không có giá trị" 63

4.2 Độ đúng 64

4.2.1 Trọng lượng chuột tham gia thử nghiệm 64

4.2.2 Độ dao động kết quả thử nghiệm 64

4.2.3 Độ đúng của qui trình 65

4.3 Độ chính xác 66

4.3.1 Trọng lượng chuột tham gia thử nghiệm 66

4.3.2 Độ dao động kết quả thử nghiệm 66

4.3.3 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian 67

4.4 Độ tuyến tính 67

KẾT LUẬN 70

KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Độ pha loãng cao nhất của mẫu thử gây chết chuột trong các lần thử nghiệm xác định độ đúng 48 Bảng 3.2 Trọng lượng của chuột (g) sử dụng trong xác định độ đúng 49 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) kết quả thử nghiệm so với giá trị thực của mẫu (độ đúng) 54 Bảng 3.4 Độ pha loãng cao nhất của mẫu thử gây chết chuột trong các lần thử nghiệm xác định độ chính xác 55 Bảng 3.5 Trọng lượng của chuột (g) sử dụng trong xác định độ chính xác 56 Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm tính theo % so với giá trị trung bình của mẫu trong xác định độ chính xác của qui trình 60 Bảng 3.7 Hệ số biến thiên khi xác định độ lặp lại của qui trình 61 Bảng 3.8 Hệ số biến thiên khi xác định độ chính xác trung gian của qui trình 61

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Minh họa độ đúng và độ chính xác của qui trình 19

Hình 1.2 Bệnh nhân uốn ván 20

Hình 1.3 Trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani) 21

Sơ đồ 1.1 Cấu trúc phân tử độc tố uốn ván và các sản phẩm thu được sau khi xử lý với Papain và Thio urea 23

Sơ đồ 1.2 Tóm tắt qui trình sản xuất kháng độc tố uốn ván từ ngựa 28

Hình 1.4 Minh họa thử nghiệm trung hòa 36

Biểu đồ 3.1 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1000 IU/mL 51

Biểu đồ 3.2 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1100 IU/mL 52

Biểu đồ 3.3 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1200 IU/mL 52

Biểu đồ 3.4 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1300 IU/mL 53

Biểu đồ 3.5 Kết quả thử nghiệm độ đúng ở mẫu nồng độ 1400 IU/mL 53

Biểu đồ 3.6 Kết quả thử nghiệm độ chính xác trung gian ở mẫu lô số 324 58

Biểu đồ 3.7 Kết quả thử nghiệm độ chính xác trung gian ở mẫu lô số 325 59

Biểu đồ 3.8 Kết quả thử nghiệm độ chính xác trung gian ở mẫu lô số 326 59

Biểu đồ 3.9 Tương quan tuyến tính giữa kết quả thử nghiệm với nồng độ của mẫu 62

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Qui trình xác định thể tích dung dịch độc tố uốn ván chứa L+

/10 Phụ lục 2: Biểu mẫu tiến hành xác định thể tích dung dịch độc tố uốn ván chứa L+

Ở nước ta cũng như trên thế giới, các loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc

từ vi khuẩn, vi rút v.v đã được sử dụng rộng rãi cho người nhằm mục đích phòng (vắc xin) và/hoặc chống (huyết thanh miễn dịch) nhiều bệnh nhiễm vi sinh vật Các chế phẩm sinh học cần phải được kiểm tra chất lượng toàn diện trước khi dùng cho người Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo tất cả các loạt sinh phẩm trước khi cấp phép xuất xưởng phải được kiểm định nghiêm ngặt về các tính chất an toàn, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt và các đặc tính

về hoá lý

Kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc từ ngựa được sản xuất và sử dụng trên thế giới từ những năm chiến tranh thế giới thứ nhất Ở Việt Nam kháng độc tố uốn ván được Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang sản xuất thành công từ những năm 1980 Tuy vậy trên thị trường trong nước, hiện nay có huyết thanh kháng độc tố uốn ván của 4 nhà sản xuất: Viện vắc xin và Sinh phẩm Y tế (Tetanus Antitoxin), Sanofi - Pasteur (Tetanea), Trung Quốc (Anti-Teta 2), Hungari (Tetanus Antitoxin) Mỗi năm có khoảng 20 loạt huyết thanh kháng độc tố cần được đánh giá chất lượng trước khi đưa vào sử dụng Để thực hiện tốt việc xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế cần có một qui trình đánh giá có độ tin cậy cao

Hiện nay, trong khu vực và trên thế giới đang sử dụng phổ biến qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván bằng kỹ thuật trung hòa Qui trình này cũng đã được Viện Kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y

tế (NICVB) và Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC) sử dụng trong nhiều năm và đây cũng là qui trình được ghi trong dược điển Việt Nam 4 (2009) Tuy vậy, qui trình này vẫn chưa được thẩm định đầy đủ và chặt chẽ Để góp phần khắc phục những hạn chế này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế bằng kỹ thuật trung hòa" với 3 mục tiêu sau:

1- Xác định độ đúng của qui trình

2- Xác định độ chính xác của qui trình

3- Xác định độ tuyến tính của qui trình

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Thẩm định qui trình

Theo ISO/IEC 17025: Thẩm định qui trình kỹ thuật là việc khẳng định bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan rằng các thông số cần xác định cho việc sử dụng một qui trình cụ thể đã được thực hiện [9]

Theo WHO:Thẩm định qui trình kỹ thuật là quá trình thiết lập một hoặc nhiều hơn các đặc tính: Độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính, vùng tuyến tính, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ mạnh phù hợp với từng qui trình 49 50

1.1.1 Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình

Việc thẩm định một qui trình kỹ thuật là nhằm chứng minh qui trình đó có phù hợp với mục đích sử dụng không 38 Thẩm định qui trình thử nghiệm phải được tiến hành khi 45 49 : Áp dụng một qui trình mới (thẩm định toàn phần), áp dụng các qui trình có trong Dược điển hoặc chuyển giao kỹ thuật (thẩm định một phần) hoặc nếu có thay đổi lớn về qui trình thử nghiệm (thay đổi dụng cụ, trang thiết bị, công thức hoặc qui trình thực hiện) thì tiến hành tái thẩm định một phần 22 50

Thẩm định qui trình kỹ thuật là một qui định bắt buộc, được tiến hành định

kỳ nhằm đảm bảo chất lượng của các kết quả thử nghiệm, vì kết quả thử nghiệm có thể bị biến đổi bởi những yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điện áp, con người, thiết bị và các phòng thí nghiệm khác nhau [51] [55]

1.1.2 Yêu cầu chung

Điều quan trọng nhất trong quá trình thẩm định là: các qui trình đó được diễn ra trong các điều kiện thực Tức là mọi hoạt động diễn ra tương tự như

các hoạt động thường xuyên mà qui trình đó được thực hiện trong quá trình làm việc Ví dụ: Số người /nhân viên tham gia, các qui trình đi vào, đi ra; giám sát môi trường, thao tác thực hiện giống như công việc thực hàng ngày khi áp dụng qui trình cần thẩm định 50

Tất cả các số liệu liên quan thu được trong quá trình thẩm định và các công thức được sử dụng để tính toán các đại lượng đặc trưng của việc thẩm định cần được đưa ra và thảo luận Các chất đối chiếu được sử dụng trong quá trình thẩm định cần phải được đánh giá rõ ràng và kèm theo tài liệu về độ tinh khiết Mức độ tinh khiết phụ thuộc vào mục đích sử dụng 38

1.1.3 Các chỉ tiêu trong thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định

Thẩm định qui trình thử nghiệm là một quá trình xác định một hay nhiều chỉ số phù hợp đối với thử nghiệm về 22 37 38 41 45

Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm thu được sau thử nghiệm của

lượng chất cần tìm đã được thêm vào mẫu hoặc sự khác biệt giữa giá trị trung

bình đo được và giá trị thực với cùng khoảng tin cậy 38 49 50

1.1.3.2 Độ chính xác (Precision)

Là giá trị gần nhất giữa nhiều lần đo thu được trong nhiều lần lấy mẫu, nó

có thể biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD), hoặc hệ số biến thiên (CV), độ chính xác có thể được coi là 38 49 50 :

- Độ lặp lại (Repeatability): Độ lặp lại diễn tả độ "chụm" của một qui

trình, trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Độ lặp lại còn được gọi là độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng

- Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): Độ chính xác trung gian

diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện

ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau

- Tính tái lặp (Reproducibility): Tính tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các

phòng thí nghiệm (Các nghiên cứu phối hợp giữa các phòng thí nghiệm

thường được áp dụng để tiêu chuẩn hoá phương pháp)

Độ chính xác được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 9 lần thử nghiệm trong khoảng nồng độ đã được xác định của qui trình (ví dụ: 3 nồng độ đã được xác định, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc tối thiểu 6 lần thử nghiệm ở nồng độ thử 100% 41 50

Độ chính xác của mỗi một qui trình cần phải đưa ra các dữ liệu sau: Độ lệch chuẩn (standard deviation), độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) hay hệ số biến thiên (coefficient of variation) và khoảng tin cậy

41 50

1.1.3.3 Độ tuyến tính (Linearity): Là khả năng của một thử nghiệm thu được

các kết quả thí nghiệm dựa vào đường thẳng biểu diễn sự tương quan giữa độ

đáp ứng của đại lượng đo được và nồng độ chất cần tìm trong mẫu 22 38

45 49 50

Độ tuyến tính được đánh giá trên kết quả của: Tối thiểu 5 nồng độ mẫu đã được xác định giá trị, mỗi nồng độ được tiến hành tối thiểu 3 lần 22 37 41

50

1.1.3.4 Vùng tuyến tính (Range): Là vùng của phương pháp thể hiện bởi

khoảng giữa mức độ/nồng độ thấp và cao của các chất cần phân tích được xác định với mức độ chấp nhận về độ đúng, độ chính xác vẫn còn tuyến tính 22

37 41 49 50

1.1.3.5 Độ đặc hiệu (Specificity): Là khả năng xác định được chất cần tìm

có trong mẫu thử khi có mặt các thành phần khác: tá dược, tạp chất 22 37

41 49 50

1.1.3.6 Độ mạnh (Ruggedness): Là mức độ tái lặp các kết quả thu được

bằng cách phân tích các mẫu giống nhau với nhiều thay đổi nhỏ so với điều kiện chuẩn (phòng thí nghiệm khác nhau, kỹ thuật viên khác nhau, dụng cụ, trang thiết bị khác nhau, thuốc thử khác lô, khác nhau về nhiệt độ, thời gian thử ) 38 41 45 50

1.1.3.7 Giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection): Là lượng nhỏ nhất

chất cần tìm có thể xác định được nhưng không định lượng được giá trị chính xác của nó 38 41 45 50

1.1.3.8 Giới hạn định lượng (LOQ - Limit of Quantitation): Là lượng nhỏ nhất

chất cần tìm mà một qui trình kỹ thuật có thể định lượng được với điều kiện thỏa mãn độ đúng, độ chính xác thích hợp Xác định LOQ bằng cách pha loãng đến nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được chất thử với độ đúng và độ chính xác theo yêu cầu 38 41 45 50

Tùy thuộc vào từng loại qui trình như: Nhận dạng, định lượng, xác định giới hạn, xác định công hiệu và xác định thành phần mà chúng ta có thể sử dụng các thông số phù hợp như sau 38 41 45 50

Thử nghiệm

Xác định độ tinh khiết

Xác định công hiệu thành phần Xác định Định lƣợng các giới hạn Xác định

(-): Các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá

(+): Các chỉ tiêu này cần phải đánh giá

Giá trị đã biết trước của mẫu thử nghiệm Giá trị của các lần thử nghiệm

Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm

Hình 1.1 Minh họa độ đúng và độ chính xác của qui trình

Hình A giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm cao nhưng giá trị trung bình của các lần thử nghiệm cách xa giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm có độ chính xác cao, nhưng độ đúng thấp 9

Hình B giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm thấp và giá trị trung bình của các lần thử nghiệm cách xa giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm có độ chính xác và độ đúng đều thấp 9

Hình C giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm cao và giá trị trung bình của các lần thử nghiệm gần với giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm

có độ chính xác và độ đúng đều cao 9

Hình D giá trị của các lần thử nghiệm có độ chụm thấp nhưng giá trị trung bình của các lần thử nghiệm gần với giá trị biết trước của mẫu, vì vậy thử nghiệm có độ chính xác thấp, nhưng độ đúng cao 9

1.2 Vi khuẩn uốn ván và huyết thanh kháng uốn ván

1.2.1 Vi khuẩn uốn ván

1.2.1.1 Lịch sử phát hiện vi khuẩn uốn ván

Bệnh uốn ván là một bệnh đã được ghi nhận từ cách đây hơn 2000 năm Biểu hiện đặc trưng của bệnh là co cứng cơ, lưng vồng lên, cơ bụng cứng, cổ ưỡn ngửa ra sau, chân duỗi thẳng toàn thân uốn cong Tuy vậy mãi đến cuối

thế kỷ 19 người ta mới hiểu biết về căn nguyên gây bệnh là Clostridium tetani

và nhờ đó mà tìm ra được cách phòng bệnh 19

Hình 1.2 Bệnh nhân uốn ván

Lưng vồng lên, cơ bụng cứng, toàn thân uốn cong

Năm 1884, hai nhà nghiên cứu là Antonio Carle và Giorgio Rattone đã nhận thấy mối liên quan giữa vết thương và bệnh co cứng Cùng năm,

Nicolaier đã lấy đất chà xát vào động vật thí nghiệm cho thấy, làm như thế có thể gây được chứng uốn ván 19

Năm 1886, Rosenbach là người đầu tiên tìm thấy và mô tả trực khuẩn uốn ván trong bệnh phẩm vết thương ở người 19

Năm 1889, Shibasaburo Kitasato đã nuôi cấy thành công vi khuẩn uốn ván

từ bệnh nhân bị uốn ván 19

Năm 1890, Faber đã chứng minh được rằng, vi khuẩn uốn ván sản xuất (tiết) ra ngoại độc tố và chất này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh uốn ván Cũng trong thời gian này, Behring và Kitasato đã chế tạo được huyết thanh chống uốn ván, bằng cách gây miễn dịch cho thỏ và ngựa, mở ra kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh uốn ván (dùng kháng huyết thanh đặc hiệu) 9

Năm 1955, Moynihan đã sản xuất kháng độc tố uốn ván từ huyết thanh người 4 8 31 40

Hình 1.3 Trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani)

Trực khuẩn thon dài, nha bào hình tròn ở một đầu trông giống như cái dùi trống (mũi tên)

1.2.1.2 Hình thái và đặc tính sinh học

Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn thon

dài, đường kính thân 0,5 - 1,1 µm, dài 2,4 - 5 µm, có lông mọc xung quanh thân, di động mạnh Ở các nuôi cấy non, vi khuẩn bắt màu Gram dương, sau

24 giờ nuôi cấy có thể bắt màu Gram âm Trong những điều kiện thích hợp, nha bào hình thành được trong vòng 48 - 72 giờ Nha bào chịu đựng được 100

oC từ 1 đến 2 giờ, sấy khô ở 150 o

19

- Tetanolysin có tính chất làm tan máu, gần giống như streptolysin của

Streptococcus tan huyết Tetanolysin dễ bị ô xy làm biến chất Tetanolysin có

độc tính đối với tim nên có thể gây chết người 2 6 19

- Tetanospasmin là một protein nhạy cảm với nhiệt độ, có trọng lượng phân

tử 150.000; gồm 2 tiểu đơn vị: chuỗi nặng (H) - trọng lượng phân tử khoảng 100.000 chịu trách nhiệm gắn vào gangliosid trên màng tế bào thần kinh và chuỗi nhẹ (L) - trọng lượng phân tử khoảng 50.000, mang độc tính Hai chuỗi được nối với nhau bằng cầu nối disulfit -S-S- Khử cầu nối này ta thu được 2 chuỗi riêng biệt và không còn tính độc, nhưng khi nối trở lại, độc tính lại hồi phục Người ta cũng có thể dùng papain để cắt phân tử độc tố (mà vẫn giữ được cầu nối disulfit) thành 2 đoạn không độc, mỗi đoạn có thể dùng làm kháng nguyên gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm và chúng vẫn phản ứng đặc hiệu với kháng độc tố (hình 1.2 ) 19

Tetanospasmin là một trong hai độc tố có tính độc cao nhất, chỉ đứng sau

ngoại độc tố của vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum: chỉ 10-4

µg

đã đủ gây chết chuột nhắt trắng trong 48 giờ (liều gây chết của Clostridium

botulinum là 10-6 µg) Độc tố uốn ván được hình thành trong tế bào, một phần được tiết ra ngoài, một phần được giải phóng khi tế bào bị ly giải Sau xử lý bằng formol, tetanospasmin trở thành giải độc tố (anatoxin) 19 29 40 Độc tố hòa tan được trong nước, bị hủy ở nhiệt độ 65 o

C trong 1 - 2 giờ, bị biến chất dưới tác dụng của ánh sáng, các chất kiềm và axit mạnh 13 32

Sơ đồ 1.1 Cấu trúc phân tử độc tố uốn ván

và các sản phẩm thu được sau khi xử lý với Papain và Thio urea

-S

S

466 438

H 3 N

S

S

OOC

1.2.1.4 Giải độc tố uốn ván

Độc tố uốn ván được giải độc thì tạo thành giải độc tố Giải độc tố uốn ván

là một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao, có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể trung hòa độc tố Người ta sử dụng giải độc tố để sản xuất vắc xin phòng bệnh uốn ván Hiện nay, hầu hết các nhà sản xuất đều sử

dụng chủng Clostridium tetani Harvard, nuôi cấy trên môi trường Mueller -

Miller trong nồi lên men với thời gian khoảng 1 tuần, cho đến khi vi khuẩn giải phóng ra độc tố Sản phẩm thu được từ quá trình nuôi cấy này (độc tố thô) được lọc và giải độc bằng focmalin với nồng độ cuối cùng là 0,5% với pH 7,6 và giữ ở 37 oC trong thời gian 4 tuần để độc tố uốn ván được giải độc hoàn toàn 19 43

1.2.2 Kháng độc tố uốn ván

Kháng độc tố uốn ván thuộc lớp globulin miễn dịch IgG cho nên có cấu trúc phân tử giống như cấu trúc phân tử chung của lớp IgG Phân tử IgG có phân tử lượng 150.000 daltons, khi dùng papain xử lý, phân tử này được cắt làm 3 mảnh có trọng lượng phân tử tương tự nhau, khoảng 50.000 daltons Hai trong 3 mảnh có cấu trúc và tính năng giống nhau và có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Hai mảnh này là Fab (antigen binding fragment) vì có khả năng kết hợp với kháng nguyên Mảnh thứ 3 có khả năng kết tinh trong dung dịch và được gọi là mảnh Fc (cristallizable fragment) không có khả năng kết hợp với kháng nguyên nhưng mang các thuộc tính sinh học khác của phân tử globulin miễn dịch

Khi phân tử IgG được xử lý với chất Mercaptoethanol để cắt cầu nối disulfua (S-S) thì phân tử sẽ được chia thành 4 chuỗi giống nhau từng đôi Một đôi có phân

tử lượng 53.000 daltons gọi là chuỗi nặng viết tắt là H (H: Heavy) và một đôi có phân tử lượng là 22.000 daltons gọi là chuỗi nhẹ L (L: Light) Phân tử IgG nếu đem xử lý với men pepsin, men này sẽ cắt chuỗi nặng ở phía đầu COOH của cầu

nối S-S liên chuỗi nặng bởi vậy phân tử chỉ được chia làm 2 mảnh: Mảnh lớn có phân tử lượng khoảng 100.000 daltons và có 2 hóa trị để kết hợp kháng nguyên và được gọi là mảnh F(ab’)2, mảnh nhỏ còn lại nhanh chóng bị phá hủy

Cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đều có vùng thay đổi (variable domain), ở đó trình tự sắp xếp của các axid amin biểu lộ ở mức cao tính đa dạng của kh ả năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên lên mỗi phân tử IgG Vị trí thay đổi của phân tử ở chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được gọi lần lượt là VH và VL (V: Variable; H: Heavy; L: Light) Phân tử IgG gắn kháng nguyên với tính đặc hiệu như nhau Mỗi vị trí gắn kháng nguyên được hình thành bởi liên kết của một vùng VH với vùng VL Những khu vực khác của phân tử kháng thể không có sự thay đổi về trật tự sắp xếp axid amin được gọi là vùng hằng định

CH trên chuỗi nặng và CL trên chuỗi nhẹ (C: Constant)

Chuỗi nhẹ chỉ có một vị trí CL, trong khi chuỗi nặng có ba vị trí là CH1,

CH2, CH3 Chúng có cấu trúc khác nhau đối với từng lớp dưới IgG Các cầu disulfit nối hai chuỗi nặng đối diện với nhau tại mối nối giữa CH2 và CH2, tại

đó cấu trúc bậc 3 của protein tạo ra vị trí nhận biết đặc hiệu đối với C1q là phần đầu tiên bị hoạt hóa theo con đường cũ (kinh điển, classical) của hệ thống hoạt hóa bổ thể 30 35 42 43

Phân tử IgG có tầm quan trọng đối với một số chức năng của kháng thể như thực bào kháng nguyên qua trung gian bổ thể Ngoài ra có thể có chức năng đối với phản ứng phụ do trị liệu bằng Immunoglobulin

Hai vùng CH3 đối nhau được hợp nhất bởi cầu nối không đồng hóa trị, trong khi 2 vùng CH2 vẫn tách biệt bởi hai chuỗi oligosaccharid Phân đoạn

Fc của IgG chịu trách nhiệm dọn sạch (clearing) các phức hợp kháng nguyên kháng thể (Ag/Ab) bằng cách:

- Hoạt hóa hệ thống bổ thể

- Gắn phức hợp này với các thụ thể Fcγ có mặt trên hầu hết các tế bào thực bào, tế bào lympho T và B

Phân đoạn Fc cũng tác động với một vài tế bào khác dẫn đến giảm điều biến (down - regulation) các phản ứng miễn dịch nội sinh trong một vài tình huống Ngược với phân đoạn Fc, hai phân đoạn Fab của phân tử IgG mang tính đặc hiệu kháng nguyên cao Ở mức độ phân tử, vùng gắn kháng nguyên của mỗi phân đoạn Fab trong cấu trúc IgG được đặc trưng bởi trình tự sắp xếp các axid amin có khả năng biến đổi cao, hình thành nên ba cái móc (loop) ở đầu của hai vùng VH và VL, được ký hiệu là CDR1, CDR2 và CDR3 (complementarity determing region = CDR) Vị trí gắn kháng nguyên của mỗi phân đoạn Fab của IgG bao gồm hai bộ có ba móc CDR giống hệt nhau và do vậy, phân tử IgG sẽ cố định hai kháng nguyên với tính đặc hiệu như nhau 3

18 25 30 34

1.2.3 Huyết thanh kháng độc tố uốn ván

Huyết thanh kháng độc tố uốn ván sử dụng cho người là một chế phẩm có chứa globulin kháng độc tố, có khả năng trung hoà đặc hiệu ngoại độc tố do

vi khuẩn Clostridium tetani sinh ra

1.2.3.1 Các loại huyết thanh kháng độc tố uốn ván sử dụng cho người

Globulin miễn dịch chống uốn ván có nguồn gốc từ người (TIG-H: Tetanus Immuno - Globulin - Human) được tách chiết từ máu của bệnh nhân uốn ván hoặc được chiết xuất từ huyết thanh của người cho máu đã được tiêm vắc xin phòng uốn ván Kháng thể trung hoà độc tố uốn ván có được bằng cách gây miễn dịch chủ động cho người hoặc động vật sau khi tiêm tối thiểu 2 liều vắc xin uốn ván và thời gian cần để sinh kháng thể ít nhất là 2 tuần kể từ khi tiêm liều thứ hai IgG kháng uốn ván được phân bố đều trong tuần hoàn

và những khoảng gian bào Kháng độc tố trong mô có khả năng trung hoà độc

tố tại vết thương, kháng độc tố ở người mẹ đã được gây miễn dịch, đi qua rau thai đến thai nhi có thể ngăn ngừa được uốn ván sơ sinh 11 36

Huyết thanh kháng độc tố uốn ván sản xuất từ ngựa được sản xuất bằng cách tinh chế huyết thanh từ những con ngựa đã được gây miễn dịch với độc

tố uốn ván Chính vì có nguồn gốc từ ngựa (dị loài) nên huyết thanh kháng độc tố uốn ván này khi dùng cho người có thể gây phản ứng phụ Huyết thanh kháng độc tố uốn ván (Serum Anti - Tetanus, SAT) thương phẩm, ngoài Immunoglobulin đặc hiệu có khả năng trung hòa độc tố uốn ván, còn có chất bảo quản, các chất ổn định pH, ổn định tính đẳng trương dung dịch

Đối với bệnh nhân bị uốn ván mà trong tiền sử chưa được miễn dịch bằng vắc xin uốn ván, cần được điều trị bằng kháng độc tố uốn ván chế từ huyết thanh ngựa hoặc huyết thanh người ngay sau khi bị thương, với liều lượng

1500 - 3000 IU 6 42 44 50

1.2.3.2 Huyết thanh kháng độc tố uốn ván lưu hành tại Việt Nam

- TETANUS ANTITOXIN: Do Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang sản xuất, có nguồn gốc từ huyết thanh ngựa, hàm lượng kháng thể 1500 IU/ống

- TETANEA: Do Sanofi pasteur (Pháp) sản xuất, có nguồn gốc từ huyết thanh ngựa, hàm lượng kháng thể 1500 IU/ống

- ANTI - TETA 2: Do Trung Quốc sản xuất bán thành phẩm và Công ty vắc xin và sinh phẩm số 2 đóng ống, có nguồn gốc từ huyết thanh ngựa, hàm lượng kháng thể 1500 IU/ống

- TETANUS ANTITOXIN: Do Hungari sản xuất, có nguồn gốc từ huyết thanh ngựa, hàm lượng kháng thể 1500 IU/ống

1.2.4 Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván

Huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế được sản xuất từ huyết tương ngựa đã được miễn dịch với kháng nguyên uốn ván (giải độc tố uốn ván) được tinh chế, cô đặc bằng phương pháp Pope dùng pepsin, bảo quản bằng merthiolat 1/10 000 [12] Qui trình sản xuất gồm các giai đoạn chính như sau (hình 1.3):

Sơ đồ 1.2 Tóm tắt qui trình sản xuất kháng độc tố uốn ván từ ngựa

Bán thành phẩm

Xử lý huyết tương Loại bỏ Albumin Tủa kháng thể

Miễn dịch cơ bản

Tồn trữ huyết tương ở 4 o

C

Miễn dịch cao độ Miễn dịch nhắc lại

Lấy máu, chắt huyết tương

Thẩm tích - cô đặc

Kiểm tra vô khuẩn, công hiệu

Kiểm tra công hiệu

Kiểm tra vô khuẩn

Kiểm tra vô khuẩn Kiểm tra an toàn Kiểm tra công hiệu Kiểm tra hoá lý

Kiểm tra chất gây sốt

Quốc gia

Xuất xưởng

Hỗn hợp lô bán thành phẩm Đóng ống, bao bì

Kho biệt trữ chờ kiểm định

Nhập kho sinh phẩm

Kiểm tra vô khuẩn Kiểm tra an toàn Kiểm tra công hiệu Kiểm tra hoá lý

Kiểm tra chất gây sốt

Địa phương

1.2.4.1 Sản xuất huyết tương kháng độc tố uốn ván

Ngựa dùng để sản xuất huyết tương kháng độc tố uốn ván phải khỏe mạnh, không bị bệnh truyền nhiễm, bệnh ký sinh trùng đường máu, tuổi từ 4 - 7 năm, cân nặng từ 200 kg trở lên, ngựa đực phải thiến, ngựa cái không được sinh sản, việc sản xuất huyết tương gồm các giai đoạn sau 12 :

Miễn dịch cơ bản: Ngựa dùng để sản xuất huyết tương được gây mẫn

cảm 3 mũi tiêm dưới da 2 bên cổ theo thứ tự (1; 2; 3), tương ứng lần lượt với thể tích hỗn dịch (kháng nguyên + tá chất sulphat nhôm) là (1,25 mL, 1,25

mL và 5 mL), ở các thời điểm ngày thứ 1, 50 và 60 Cho ngựa nghỉ 3 - 6 tháng kể từ mũi tiêm cuối cùng thì lấy máu kiểm tra và đưa vào gây miễn dịch cao độ

Miễn dịch cao độ: Sau khi lấy máu kiểm tra hiệu giá 5 ngày thì gây mẫn

cảm bởi 7 mũi tiêm tiếp theo dưới da lưng dọc 2 bên cột sống theo thứ tự (4; 5; 6; 7; 8; 9; 10) tương ứng lần lượt với thể tích hỗn dịch (kháng nguyên + tá chất sulphat nhôm) là: 1,25 mL (100 Lf); (3,5 mL (700 Lf); 3,5 mL (700 Lf); 6,5 mL (1300 Lf); 6,5 mL (1300 Lf), 13 mL (2600 Lf) và 23 mL (4600 Lf) ở các thời điểm ngày thứ 5; 12; 19; 26; 33 và 40 Đến ngày thứ 59 lấy máu kiểm

tra hiệu giá và ngày thứ 73 thì lấy máu lần 1: 1% trọng lượng cơ thể

Miễn dịch nhắc lại: Sau khi lấy máu lần 1, cho ngựa nghỉ 3 tuần rồi tiêm

miễn dịch nhắc lại 1 mũi 20 mL hỗn dịch (kháng nguyên + tá chất sulphat nhôm) Sau 12 ngày lấy máu kiểm tra hiệu giá, ngày 14 lấy máu lần 2, sau 4 -

5 ngày thì lấy máu lần 3 (1,5% trọng lượng cơ thể) và cho ngựa nghỉ 2 tuần,

cứ thế tiếp tục Trước mỗi lần lấy máu thì phải lấy máu kiểm tra hiệu giá Nếu hiệu giá ≤ 150 Lf/mL thì không lấy máu và 3 lần miễn dịch nhắc lại nếu hiệu giá ≤ 150 Lf/mL thì cho ngựa nghỉ sản xuất

Lấy máu, chắt huyết tương: Trong suốt thời gian gây miễn dịch nhắc lại,

nếu ngựa ốm sẽ không lấy máu Trước khi lấy máu, ngựa phải được tắm rửa

sạch sẽ, chải lông nhất là ở vùng cổ Việc lấy máu thực hiện ở tĩnh mạch cổ,

số lượng máu lấy bằng 1,5% trọng lượng của ngựa Dùng dung dịch Sodium Citrat 4% làm chất chống đông với số lượng 70 mL/1lít máu Các chai thuỷ tinh để lấy máu có chứa dung dịch Sodium Citrat như qui định trên cho từng con ngựa được hấp tiệt trùng trước khi lấy máu Các chai máu được giữ ở nhiệt độ 18 - 20 oC trong thời gian 24 giờ để hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu lắng xuống và huyết tương ở phần trên Dùng máy hút để hút phần huyết tương vào chai thuỷ tinh đã hấp tiệt trùng, huyết tương bảo quản bằng merthiolat 1/20.000 12

Tồn trữ: Huyết tương được bảo quản ở phòng lạnh 4 oC trong thời gian 1 -

3 tháng mới đem tinh chế

1.2.4.2 Tinh chế huyết tương kháng độc tố uốn ván

Mục đích của việc tinh chế và cô đặc là loại bỏ albumin và những protein không cần thiết Việc tinh chế cô đặc huyết tương kháng độc tố uốn ván tại Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế thực hiện theo phương pháp Pope gồm các giai đoạn sau 12 :

Xử lý huyết tương: Huyết tương tồn trữ trong kho lạnh trước khi đưa vào

tinh chế phải kiểm tra vô trùng và công hiệu

- Pha loãng huyết tương theo tỷ lệ 1/1

- Điều chỉnh nhiệt độ của dung dịch 30 - 32 oC

- Pepsin loại 1/10.000, 0,7 g/lít huyết tương (Sigma) Dùng 10 lít HCl 0,8% (trọng lượng/thể tích) cho 100 lít huyết tương

- Điều chỉnh pH 3,2 bằng HCl 20%

- Thời gian xử lý là 30 phút

Loại bỏ albumin và những protein không cần thiết: Albumin và những

protein không cần thiết được loại bỏ bằng phương pháp kết dính chọn lọc bằng nhiệt

- Tổng thể tích huyết tương sau khi được xử lý cần phải được điều chỉnh

về pH 4,2 bằng NaOH 40%

- Cho amonium sulfat 14% (trọng lượng/thể tích)

- Dùng Caprilic acid để tẩy màu với nồng độ 0,1- 0,2% (thể tích/thể tích), khuấy đều

- Đưa nhiệt độ dung dịch lên 56 oC, khuấy liên tục và giữ ở nhiệt độ 56

oC trong vòng 1 giờ

- Lọc dung dịch bằng lọc ép Simoneton 175 mm/185 mm hay lọc ép Filtrox 400 mm x 400 mm với giấy lọc thường, bỏ tủa và lấy nước lọc

Làm kết tủa kháng thể: Kháng thể uốn ván hoà tan trong nước lọc được

kết tủa bằng amonium sulfat 30%

- Đo thể tích nước lọc có được

- Đưa nồng độ amonium sulfat từ 14% lên 30% (thêm 16% amonium sulfat)

- Điều chỉnh pH của dung dịch lên 6,5 - 6,6 bằng dung dịch NaOH 40%

- Để ở nhiệt độ phòng (20 - 25 oC) qua đêm

- Bỏ phần nước nổi trên, lấy phần tủa ở dưới và lọc qua máy lọc Simoneton với giấy lọc thường (cần ép khô kháng thể bằng không khí nén)

- Lấy kháng thể cân trọng lượng có được và giữ ở phòng lạnh chờ kháng thể các mẻ tinh chế khác để thẩm tích cùng một lúc

trong nước cất sau khi thẩm tích bằngBaCl2 bão hòa

- Khi kiểm tra ion SO4-2 trong nước cất sau thẩm tích không còn, phải thẩm tích tiếp với ít nhất 200 lít nước cất nữa

Tẩy màu: Sau khi thẩm tích cô đặc xong, huyết thanh kháng độc tố uốn

ván được khử màu bằng gel Al(OH)3 với nồng độ 3 - 5% ở nhiệt độ 56 o

C

trong thời gian 1 giờ, sau đó được ly tâm 4000 vòng/1 phút trong 30 - 60 phút

để loại bỏ phần cặn, lấy nước nổi

Làm đẳng trương và lọc vô trùng: Sau khi được tẩy màu, cần phải đo lại

thể tích huyết thanh tinh chế có được và làm đẳng trương với NaCl 0,85 - 0,9%, pH=6 - 7, bảo quản bằng merthiolat 1/10.000 sau đó lọc vô trùng qua

hệ thống cột lọc với màng lọc kép không thấm Sau khi lọc vô trùng xong, lấy mẫu kiểm tra vô trùng và công hiệu

1.2.4.3 Sản xuất bán thành phẩm

Hỗn hợp: Các lô huyết thanh kháng độc tố uốn ván được hỗn hợp thành lô bán thành phẩm có thể tích tối thiểu 40 lít Sau đó lọc vô trùng bằng hệ thống cột lọc với màng lọc kép không thấm (lọc catridge) có kích thước lỗ 0,45/0,2

µm và đựng trong các chai 10 lít đã sấy tiệt trùng Các lô bán thành phẩm được đánh số liên tục, các chai đựng huyết thanh bán thành phẩm được đánh

số từ 1, 2, 3, 4, 5… việc lấy mẫu được thực hiện từng chai một để kiểm định Kiểm định về các phương diện sau 12 28 :

+ Vô khuẩn

+ An toàn

+ Công hiệu

+ Chất gây sốt

+ Hóa học: Nồng độ protein, nồng độ NaCl, nồng độ methiolate, pH

Đóng ống, bao bì: Sau khi có kết quả kiểm định như trên (cấp 1), huyết

thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế được chuyển sang phòng đóng ống, dán nhãn Sau khi dán nhãn, đóng bao bì, huyết thanh kháng độc tố uốn ván được đặt vào kho biệt trữ, để bộ phận kiểm định lấy mẫu kiểm tra (kiểm định cấp 2)

1.2.4.4 Sản xuất thành phẩm

đóng ống tự động, mỗi ống chứa 1500 IU/mL Sau khi đóng ống xong, các ống kháng độc

tố uốn ván được đóng gói: 20 ống/1hộp, ngoài hộp ghi rõ: Nơi sản xuất: Viện vắc xin; số lô; số lượng: 20 ống; số đơn vị 1500 IU/ống; hạn dùng: 2 năm; bảo quản: ở 2 - 8 o

C 12

1.3 Kiểm định chất lƣợng huyết thanh kháng độc tố uốn ván

1.3.1 Yêu cầu chung

Trong sản xuất kháng độc tố uốn ván việc kiểm tra đánh giá, chất lượng là rất quan trọng vì các lý do: Thứ nhất, sản phẩm phải đủ an toàn để dùng cho người Thứ hai, kháng độc tố uốn ván là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật

có cấu trúc phân tử phức tạp, có thể bị biến tính do nhiệt độ và thời gian bảo quản, nên công hiệu cần phải đủ để trung hòa độc tố uốn ván

Bởi vậy, việc kiểm tra đánh giá chất lượng kháng độc tố uốn ván phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến bán thành phẩm và thành phẩm cuối cùng)

Việc đảm bảo chất lượng sản phẩm là một công việc phức tạp bắt đầu từ công việc kiểm định nguồn nguyên liệu đầu, giám sát qui trình sản xuất và tuân theo thực hành sản xuất đúng (Good Manufacturing PracticeGMP) một cách nghiêm ngặt để xuất xưởng sản phẩm có chất lượng tốt Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin và sinh phẩm đòi hỏi tính khách quan và chính xác, tuân thủ chặt chẽ các qui trình, các phương pháp, kỹ thuật của TCYTTG

và KĐQG qui định nhằm đảm bảo độ chính xác cao 48

Chất lượng của kháng độc tố uốn ván thành phẩm được đánh giá bao gồm các chỉ số về vô khuẩn, an toàn, công hiệu, chất gây sốt và các tính chất lý, hóa học Các thử nghiệm tìm các chỉ số này cần được thực hiện theo thường qui thống nhất chung 48

1.3.2 Các tiêu chí kiểm tra chất lượng kháng độc tố uốn ván

Hiện nay kiểm tra chất lượng kháng độc tố uốn ván tinh chế được đánh giá trên rất nhiều tiêu chí khác nhau quan trọng nhất là 12 28 :

An toàn (Dược điển Việt Nam IV - phụ lục 15.11 ): Dùng 5 chuột nhắt

trắng nặng 17 - 22 g/con và 2 chuột lang nặng 250 - 350 g/con Tiêm phúc mạc chuột lượng huyết thanh miễn dịch bằng một liều dùng cho người, nhưng không quá 1 mL cho mỗi chuột nhắt trắng và không quá 5 mL cho mỗi chuột lang Tiêu chuẩn: Sau ít nhất 7 ngày theo dõi chuột không giảm cân và không

(1mL0,6 o

7 12 15 27 33

Kiểm tra tính chất vật lý, hoá học

- Trạng thái và màu sắc (cảm quan

này đạt tiêu chuẩn, 12 28

- Protein ngoại lai - phụ lục 15.10): Xác định protein của loài động vật hoặc người dùng để sản xuất huyết thanh miễn dịch Bằng kỹ thuật khuếch tán miễn dịch hoặc kỹ thuật điện di miễn dịch Nhận định kết quả: Protein được nhận dạng đúng khi xuất hiện đường tủa giữa mẫu thử nghiệm và huyết thanh kháng loài tương ứng 12 16 28

- Protein tổng số - phụ lục 15.18): Dựa vào tính chất của thuốc thử Nessler cho phản ứng màu với ion (NH4+) được tạo thành sau khi vô cơ hóa các chất protein Tiêu chuẩn: Không quá 170 g/L 12 16 17

Thimerosal: Không quá 0,02% (phụ lục 15.29)

Phenol: Không quá 0,25% (phụ lục 15.28)

Nếu như sản phẩm không đạt một trong những tiêu chí trên đều không đạt chất lượng

1.3.3 Xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván bằng kỹ thuật trung hòa

1.3.3.1 Nguyên lý của kỹ thuật

Là phản ứng xẩy ra giữa kháng độc tố uốn ván trong huyết thanh với độc

tố uốn ván Huyết thanh thử pha loãng ở các đậm độ khác nhau sẽ được ủ với một lượng độc tố đã xác định Lượng độc tố không trung hoà sẽ được phát

hiện qua các triệu chứng đặc hiệu do độc tố gây ra trên chuột nhắt trắng Dựa vào số chuột liệt khác nhau ở các độ pha loãng của huyết thanh thử và huyết thanh chuẩn để tính kết quả Đơn vị của huyết thanh thử được tính theo đơn vị của huyết thanh chuẩn (IU/mL) [1]

Hình 1.4 Minh họa thử nghiệm trung hòa

* Xác định thể tích dung dịch độc tố uốn ván chứa L + /10 12 21

(Thử nghiệm này được thực hiện trước khi thực hiện thử nghiệm xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván)

L + /10 là lượng độc tố uốn ván nhỏ nhất còn lại trong 0,5 mL dung dịch sau khi trung hòa với 0,1 đơn vị quốc tế kháng độc tố uốn ván đủ để gây chết chuột có trọng lượng 16 - 18 g trong thời gian 96 giờ.

Tiêm chuột Chuột bình

thường

Ủ huyết thanh và Độc tố uốn ván Độc tố uốn ván

Các độ pha huyết thanh

Chuột liệt

Kết quả

Chuẩn bị dung dịch tiêm

Lần lượt cho vào 5 ống nghiệm:

Huyết thanh kháng độc tố chuẩn (mL) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Dung dịch độc tố uốn ván sau pha

loãng 1/30 (mL) 0,602 0,604 0,606 0,608 0,610 Nước muối sinh lý (mL) 0,898 0,896 0,894 0,892 0,890

Thể tích trong mỗi ống (mL) 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50

Tiêm chuột

- Tiêm 0,5 mL dung dịch sau trung hòa dưới da lưng cho mỗi chuột nhắt

- Sử dụng 04 chuột cho mỗi độ pha

Theo dõi và đánh giá kết quả:

- Theo dõi và ghi số chuột chết trong vòng 96 giờ ở từng độ pha ở các

thời điểm 24 giờ; 48 giờ; 72 giờ và 96 giờ

- Thử nghiệm không có giá trị khi có độ pha tồn tại cả chuột sống và chuột chết

- Nhận định kết quả: Độ pha chứa L+/10 là độ pha có nồng độ độc tố thấp nhất mà còn gây chết toàn bộ chuột, thể tích dung dịch độc tố uốn ván sử dụng để pha độ pha này là thể tích cần tìm Trong ví dụ trên, nếu chuột chết từ ống số 3 trở đi thì thể tích cần tìm là 0,606 mL

* Xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván thử nghiệm

Chuẩn bị dung dịch tiêm mẫu chứng

Lần lượt cho vào 3 ống nghiệm:

- Dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 0,5 IU/mL: ống thứ

nhất 0,9 mL; ống thứ hai 1,0 mL; ống thứ ba 1,1 mL

- Một thể tích dung dịch độc tố có chứa L+/10

- Nước muối sinh lý sao cho vừa đủ 2,5 mL/ống

- Lắc đều các ống, ủ 37 oC trong 45 phút, tránh ánh sáng

Chuẩn bị dung dịch tiêm mẫu thử nghiệm

Lần lượt cho vào 5 ống nghiệm tương ứng với 5 độ pha (mỗi độ pha 1 ống):

- 1mL dung dịch kháng độc tố uốn ván mẫu thử

Độ pha loãng của KĐTUV thử nghiệm 1/2600 1/2800 1/3000 1/3200 1/3400

Dung dịch KĐTUV thử nghiệm (mL) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Dung dịch độc tố có chứa L+

/10; (mL) 0,606 0,606 0,606 0,606 0,606

Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 mL 0,894 0,894 0,894 0,894 0,894

Tiêm chuột

- Tiêm 0,5 mL dung dịch tiêm (mẫu chứng/mẫu thử nghiệm) dưới da

lưng cho mỗi chuột nhắt

- Sử dụng 04 chuột cho mỗi độ pha

Theo dõi và đánh giá kết quả:

- Theo dõi và ghi số chuột chết trong vòng 96 giờ ở từng độ pha ở các

thời điểm 24 giờ; 48 giờ; 72 giờ và 96 giờ

- Mẫu chứng sử dụng 0,9 mL và 1,0 mL dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 0,5 IU/mL đều gây chết toàn bộ chuột trong vòng 96 giờ Số chuột ở mẫu chứng sử dụng 1,1 mL dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn

nồng độ 0,5 IU/mL sẽ sống toàn bộ trong vòng 96 giờ

- Thử nghiệm không có giá trị khi có độ pha tồn tại cả chuột sống và chuột chết

- Nhận định kết quả: Dung dịch tiêm chứa lượng kháng độc tố uốn ván thử nghiệm lớn nhất mà không bảo vệ được chuột trong thời gian tương đương với mẫu chứng có chứa 1,0 mL kháng độc tố uốn ván có nồng độ 0,5 IU/mL 12

20 28

- Hiệu giá kháng độc tố uốn ván thử nghiệm được tính như sau 12 20 28 : Hiệu giá (IU/mL) = 0,5 x N

Trong đó:

N: Độ loãng huyết thanh kháng độc tố uốn ván thử nghiệm

0,5: Số IU có trong 1 mL dung dịch huyết thanh kháng độc tố uốn ván chuẩn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Là "Qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế bằng kỹ thuật trung hoà":

0,9 mL; 1 mL; 1,1 mL mẫu chuẩn

Sơ đồ 2.1 Qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế

bằng kỹ thuật trung hoà

Tiêm dưới da lưng chuột Swiss (16-18 g)

(mỗi độ pha 4 con)

Kiểm tra giá trị của thử nghiệm

(không có nồng độ nào vừa có chuột chết vừa có chuột sống)