nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại

Được thu thập từ giai đoạn rất sớm trong quá trình hình thành cá thể, các tế bào này có khả năng biến đổi thành mọi dòng tế bào của cả ba lá phôi, đặc biệt các tế bào có khả năng ứng dụn

Hà Nội - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận án này là công trình nghiên cứu của tôi, thuộc đề tài cấp Bộ Y tế

Các số liệu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ bản luận án nào

Tác giả luận án

Nguyễn Quang Tùng

Thày, Cô, các bạn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình, đặc biệt là những người tình nguyện tham gia nghiên cứu, những bà mẹ tình nguyện hiến mẫu máu dây rốn của con mình trong nghiên cứu này Với tình cảm và

sự biết ơn sâu sắc, tôi xin kính gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến:

Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường đại học Y Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

Vụ Khoa học-Đào tạo Bộ Y tế và tập thể các nhà khoa học tham gia

đề tài NCKH cấp Bộ “Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép tủy đồng loại” đã không

quản vất vả, hỗ trợ và cùng tôi triển khai các công việc của đề tài đạt kết quả tốt

Phòng Quản lý đào tạo sau đại học, Quản lý nghiên cứu khoa học đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, nhắc nhở, động viên tôi trong quá học tập, nghiên cứu

Bộ môn Huyết học-Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội, những Thày, Cô, bạn bè đồng nghiệp luôn dành cho tôi sự hỗ trợ tuyệt vời, những động viên, chia xẻ giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành công việc

Tập thể Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương, các Thày, Cô, anh chị em trong các khoa Miễn dịch-Di truyền, Thu gom, Sản xuất, Sàng lọc,

Tế bào, Đông máu và các khoa Lâm sàng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện tốt các quy trình kỹ thuật của nghiên cứu

Tập thể khoa Huyết học, khoa Truyền máu bệnh viện trung ương quân đội 108 đã tạo điều kiện và trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nhiều quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Tập thể khoa Sản-bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi trong việc thu gom các mẫu máu dây rốn

người Thày, người Anh đã luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất, khuyến khích

và chỉ bảo cho tôi trong công việc, học tập và nghiên cứu

Xin cám ơn các Thày, Cô, các anh chị em đã dành cho tôi những đóng góp quý báu trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận

án này

Cám ơn gia đình, Cha Mẹ, vợ con thân yêu, anh em ruột thịt, đã luôn tin tưởng, hy sinh và hỗ trợ không mệt mỏi để tôi có thể tập trung và cố gắng hoàn thành tốt công việc và nghiên cứu khoa học

Một lần nữa, xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất tới những người bạn đã tình nguyện tham gia nghiên cứu, vượt qua cảm giác đau đớn để hiến các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, hiến những mẫu dịch tủy quý giá Xin cảm

ơn các bà mẹ đã tình nguyện hiến những mẫu máu rốn của đứa con mình với hy vọng sẽ góp phần nhỏ bé để nâng cao chất lượng điều trị cho người bệnh

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm

Tác giả luận án

Nguyễn Quang Tùng

1.1 Khái niệm và xếp loại tế bào gốc 3

1.3 Nguồn cung cấp và thu gom tế bào gốc tạo máu 16

1.3.1 Tế bào gốc tạo máu sau huy động ra máu ngoại vi 17

1.3.4 Ứng dụng và lựa chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu 26

1.4.3 Đánh giá và kiểm tra chất lượng chế phẩm tế bào gốc 34

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị, sinh phẩm 43

2.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 54 2.4 Xử lý số liệu 54

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu từ các nguồn khác nhau 56

3.2 Kết quả xử lý các mẫu sản phẩm tế bào gốc tạo máu 80

3.3 Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc tạo máu ở - 196 0 C 87

3.3.2 Tỷ lệ tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông 87

3.4 Đặc điểm tế bào huyết học-miễn dịch và tế bào gốc tạo máu

của các sản phẩm từ các nguồn cung cấp khác nhau 89

3.4.3 Đặc điểm về tế bào gốc tạo máu của các sản phẩm 92

4.1.2 Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động bằng G-CSF 99

4.2 Về quy trình và kết quả xử lý các mẫu tế bào gốc tạo máu 115

4.2.1 Loại hồng cầu bằng phương pháp ly tâm đơn thuần 1164.2.2 Loại hồng cầu có sử dụng dung dịch cao phân tử 1174.2.3 Hiệu quả giảm thể tích mẫu và thu hồi tế bào gốc 120

4.3 Về quy trình và kết quả bảo quản tế bào gốc tạo máu 122

4.4 Về đặc điểm huyết học, miễn dịch và khả năng tạo máu 125

4.4.1 Một số đặc điểm tế bào máu của các mẫu tế bào gốc 1264.4.2 Một số đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc 1284.4.3 Tế bào gốc và khả năng tạo máu của các mẫu tế bào gốc 131

KẾT LUẬN 136

ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN

Danh mục các bài báo và công trình nghiên cứu

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

từng phần)

BCRP breast cancer-resistance protein (protein chống ung thư phế quản)

BFU-E Burst forming unit-erythrocyte (đơn vị tạo ồ ạt hồng cầu)

BMSC Bone marrow stem cells (tế bào gốc tủy xương)

CBSC Cord blood stem cells (tế bào gốc máu dây rốn)

CFU-G Colony forming unit-granulocyte (đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt)

CFU-GEMM

Colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte and marcophage (đơn vị tạo cụm đa dòng)

CFU-S colony forming unit-spleen (đơn vị tạo cụm lách)

E-LTC-IC Extended-long-term culture-initiating cell

(kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn cải tiến)

G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor

(yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt)

GM-CFU Granulocyte, Monocyte-colony forming unit

(đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono)

GM-CSF Granulocyte, Monocyte-colony stimulating factor

(yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono)

GMP granulocyte-monocyte precursors (tế bào đầu dòng hạt-mono)

HSC hematopoietic stem cells (tế bào gốc tạo máu)

LTC-IC long-term culture-initiating cell (kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn)

LT-HSC long-term hematopoietic stem cell (tế bào gốc sinh máu dài hạn)

M-CSF Macrophage-colony stimulating factor

(yếu tố kích thích tạo cụm dòng đại thực bào)

MDR1 multidrug-resistance 1 (yếu tố đa kháng thuốc 1)

(tế bào đầu dòng mẫu tiểu cầu -hồng cầu

PBSC Peripheral blood stem cell (tế bào gốc máu ngoại vi)

ST-HSC short-term hematopoietic stem cell (tế bào gốc sinh máu ngắn hạn)

UCSC Umbilical cord stem cells (tế bào gốc dây rốn)

USSC Unrestricted somatic stem cell (tế bào gốc đệm biệt hóa không giới hạn)

Bảng 3.3. Một số chỉ số tế bào miễn dịch của các mẫu thu gom từ máu

Bảng 3.4. Các chỉ số tế bào máu trước và sau tách không huy động 59

Bảng 3.5. Số lượng CD34 thu gom được từ máu ngoại vi sau huy động 62

Bảng 3.7 Thể tích và các chỉ số CD34 của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi

không huy động

64

Bảng 3.8 Một số chỉ số tế bào máu của đơn vị tế bào thu gom từ máu ngoại

Bảng 3.9 Một số chỉ số tế bào miễn dịch trong đơn vị tế bào thu gom từ máu

ngoại vi sau huy động.

65

Bảng 3.10 Thay đổi các chỉ số tế bào máu trong quá trình huy động 66

Bảng 3.11 Mối tương quan giữa chỉ số CD34 huy động và các thành phần

bạch cầu máu ngoại vi

68

Bảng 3.12 Biểu hiện lâm sàng trong quá trình huy động và tách tế bào 70

Bảng 3.13 Các chỉ số đông máu trước và sau khi tách tế bào (n = 10) 70

Bảng 3.14 Các chỉ số hóa sinh trước và sau khi tách tế bào (n = 10) 71

Bảng 3.15 Số lượng tế bào có nhân và CD34 của mẫu tế bào thu gom từ tuỷ

72

Bảng 3.16. Một số chỉ số tế bào máu của mẫu thu gom từ tuỷ xương.

Bảng 3.17 Số lượng và tỷ lệ % TB MD của mẫu thu gom từ tuỷ xương 73

Bảng 3.20. Số lượng bạch cầu đơn nhân và CD34 của mẫu máu dây rốn 75

Bảng 3.23. Một số chỉ số lâm sàng của mẹ và trẻ sơ sinh 78

Bảng 3.24. Liên quan giữa cân nặng trẻ và số lượng tế bào có nhân, tế bào

CD34 thu được từ máu dây rốn

79

Bảng 3.25 Kết quả xử lý mẫu TB gốc máu ngoại vi sau huy động (n=10) 80

Bảng 3.27. Kết quả loại hồng cầu và bạch cầu của đơn vị máu dây rốn bằng ly

tâm

83

Bảng 3.29. Thể tích và số lượng TB có nhân của đơn vị máu dây rốn trước và

sau xử lý.

84 84

Bảng 3.30. Kết quả thu hồi CD34 sau xử lý loại huyết tương của mẫu tế bào

gốc máu ngoại vi sau huy động (n=10)

Bảng 3.31. Kết quả thu hồi CD34 sau xử lý mẫu dịch tủy xương (n = 10) 85

Bảng 3.32. Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý MDR có sử dụng HES 85

Bảng 3.34. Tỷ lệ tế bào sống của các đơn vị tế bào gốc sau bảo quản 87

Bảng 3.35. Đặc điểm tế bào máu từ các nguồn cung cấp tế bào gốc 89

Bảng 3.36. Thành phần bạch cầu của chế phẩm từ các nguồn cung cấp 90

Bảng 3.40. Khả năng tạo cụm của tế bào gốc từ các nguồn cung cấp 94

Bảng 4.3. Hiệu quả thu hồi tế bào đơn nhân và CD34 máu dây rốn 121

Hình 1.3. Sơ đồ biệt hoá tạo máu 11

Sơ đồ 3.1. Tóm tắt quy trình xử lý TBG: Giảm HC và thể tích sản phẩm 86

Đồ thị 3.1 Thay đổi số lượng bạch cầu khi tách không huy động 60

Đồ thị 3.2 Thay đổi số lượng tiểu cầu khi tách không huy động 60

Đồ thị 3.3. Thay đổi SLCD34 máu ngoại vi khi huy động bằng G-CSF 61

Đồ thị 3.4. Thay đổi số lượng bạch cầu ở máu ngoại vi trong quá trình huy

Đồ thị 3.5. Thay đổi số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi trong quá trình huy

động bằng G-SCF và tách tế bào gốc

67

Đồ thị 3.6 Mối tương quan giữa tế bào CD34 với số lượng bạch cầu và bạch

Đồ thị 3.7. Mối tương quan giữa cân nặng trẻ sơ sinh và thể tích máu dây

rốn thu đựoc

79

Đồ thị 4.1. Mối tương quan giữa số lượng CD34 ở máu ngoại vi và trong

sản phẩm sau thu gom

101

Đồ thị 4.3. Tỷ lệ tế bào sống sau khi phá đông ở các điều kiện nhiệt độ 124

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ tế bào chết theo thời gian sau khi rã đông 87

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ các loại cụm tế bào tạo thành từ các nguồn cung cấp 93

Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp điều trị hiện đại, có hiệu quả đối với các bệnh lý cơ quan tạo máu và một số bệnh lý khác Nguồn tế bào để sử dụng cho ghép chủ yếu được thu gom từ tuỷ xương, từ máu ngoại

vi sau khi kích thích và từ máu dây rốn

Ghép tế bào gốc đồng loại (allograft) là quá trình truyền tế bào gốc từ người cho (có hoặc không có mối quan hệ huyết thống) nhằm tái lập khả năng tạo máu ở người bệnh Phương pháp này thường được áp dụng trong những bệnh lý: Lơxêmi cấp dòng tuỷ, lơxêmi cấp dòng lympho, suy giảm miễn dịch nặng, suy tuỷ xương, bệnh lý huyết sắc tố, bệnh hồng cầu hình liềm do mô tạo máu bị tổn thương nặng nề, không có khả năng tự hồi phục Quá trình ghép có thể được tiến hành sau điều trị làm giảm khối tế bào ung thư và tạo điều kiện cho các tế bào ghép có thể mọc được dễ dàng (quá trình điều kiện hoá) Thời gian mọc ghép và khả năng duy trì tạo máu dài hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó sự khác nhau về đặc điểm của các tế bào gốc tạo máu giữa các nguồn cung cấp có vai trò quan trọng

Bên cạnh tác dụng hồi phục mô tạo máu, gần đây, hiệu quả hồi phục

và duy trì khả năng miễn dịch của cơ thể nhận ghép đã được chứng minh và ứng dụng trên lâm sàng Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, có trong chế phẩm tế bào gốc hoặc được biệt hóa từ các tế bào gốc của người cho, sau khi truyền vào cơ thể nhận là thành phần chủ yếu của phản ứng ghép chống chủ nhưng đồng thời là phản ứng ghép chống ung thư/lơxêmi Các tế bào miễn dịch này sẽ “nhận diện” các tế bào ung thư của người bệnh và gây đáp ứng miễn dịch nhằm “diệt” các tế bào này Kết quả của phản ứng ghép chống ung thư sẽ giúp kéo dài thời gian sống thêm không bệnh của người nhận ghép

Từ những nguồn cung cấp chủ yếu, quá trình thu gom, xử lý và bảo quản các tế bào gốc đòi hỏi những quy trình kỹ thuật khác nhau Hiệu quả thu được những chế phẩm tế bào gốc mang những đặc điểm sinh học cũng khác nhau không những về mặt thành phần, số lượng tế bào gốc tạo máu mà còn

Hiện tại ở Việt Nam, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đã được triển khai từ nhiều năm tại một số trung tâm trong cả nước, tuy nhiên các công trình nghiên cứu công bố về quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài hạn các mẫu tế bào gốc tạo máu từ các nguồn cung cấp chủ yếu còn ít và

chưa hệ thống Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại” được tiến hành với các mục tiêu:

1 Ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây rốn

2 Đánh giá khả năng tạo cụm của tế bào gốc tạo máu và đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây rốn

1.1 KHÁI NIỆM VÀ XẾP LOẠI TẾ BÀO GỐC

1.1.1 Khái niệm về tế bào gốc

Đặc điểm cơ bản của tế bào gốc là khả năng tự tái tạo (self-renewal)

và biệt hoá thành các dòng tế bào trưởng thành Thực nghiệm đầu tiên của McCulloch và Till [158] vào những năm 1960 trên chuột đã xác định những đặc điểm này ở một quần thể tế bào, được đặt tên là đơn vị tạo cụm lách (CFU-S) và sau này được chứng minh là các tế bào gốc tạo máu (HSC) Về

lý thuyết, hiện tại có nhiều cách xếp loại tế bào gốc dựa vào các đặc điểm cơ bản khác nhau: khả năng biệt hoá, thời điểm có thể thu gom được trong quá trình hình thành và phát triển cá thể, theo chức năng và mô đích [13],[25],[103]

1.1.2 Xếp loại tế bào gốc

1.1.2.1 Xếp loại theo khả năng tăng sinh và biệt hoá:

− Tế bào gốc toàn năng (totipotent): Có khả năng biệt hoá thành mọi dòng

tế bào của một cơ thể Về lý thuyết, từ một tế bào gốc có thể hình thành một cơ thể hoàn chỉnh nếu được phát triển trong môi trường cơ thể mẹ

− Tế bào gốc vạn tiềm năng (pluripotent) hay tế bào gôc đa tiềm năng

(multipotent): Có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau của các mô trong cơ thể nhưng không thể hình thành một cơ thể hoàn chỉnh

− Tế bào gốc đơn tiềm năng (unipotent): Chỉ còn khả năng biệt hoá thành

các tế bào trưởng thành trong một mô xác định

1.1.2.2 Xếp loại theo quá trình phát triển cá thể:

Dựa vào thời điểm có thể phân lập được trong quá trình phát triển cá thể tế bào gốc được xếp thành 3 loại: tế bào gốc phôi (ES), tế bào gốc bào thai (FSC) và tế bào gốc trưởng thành (ASC) [146] Một số tác giả còn xếp

[63],[168] Trong môi trường nuôi cấy in vitro, các tế bào này phân chia không ngừng nhưng vẫn bảo tồn được khả năng biệt hoá in vitro và in vivo Được thu thập từ giai đoạn rất sớm trong quá trình hình thành cá thể, các tế bào này có khả năng biến đổi thành mọi dòng tế bào của cả ba lá phôi, đặc biệt các tế bào có khả năng ứng dụng quan trọng trên lâm sàng

là các neuron thần kinh và các tế bào beta ở tiểu đảo Langerhans tiết insuline của tuyến tuỵ nội tiết

Tế bào gốc bào thai (FSC) có thể được thu thập từ chính bào thai hay các

thành phần phụ của bào thai (bánh rau, dây rốn ) Đây là nguồn cung cấp tế bào gốc rất phong phú và thực sự mang nhiều hứa hẹn cho ngành y học tái tạo [1],[96],[100] Được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất trong nhóm này chính là các tế bào gốc tạo máu thu gom từ máu rốn Các tế bào này thể hiện khả năng biệt hoá dài hạn thành tế bào trưởng thành của tất

cả các dòng tế bào máu và trường hợp ghép tế bào gốc máu rốn đầu tiên

đã được tiến hành thành công vào năm 1988 [62] Đặc biệt trong khoảng

10 năm trở lại đây, hướng nghiên cứu tập trung vào việc xác định, phân lập và nuôi cấy biệt hoá các tế bào gốc từ các thành phần phụ của bào thai như dây rốn, bánh rau, màng ối và dịch ối (Hình 1.1) Các tế bào gốc thu thập từ những cấu trúc này có khả năng biệt hóa đa dạng thành những tế bào của cả ba lá phôi là tế bào mỡ, tế bào xương, sụn, tế bào cơ, cơ tim và các neuron thần kinh trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung những yếu tố kích thích thích hợp Từ những vị trí khác nhau có thể thu được những quần thể tế bào gốc sau:

−

Màng ối

R Dịch ối

Dây rốn

+ Tế bào gốc từ máu dây rốn (CBSC): Được thu gom từ nguồn máu dây

rốn Bên cạnh quần thể tế bào gốc tạo máu còn có nhiều loại tế bào gốc khác như tế bào định hướng nội mạc (EPC), tế bào gốc trung mô (MSC) [33],[126]

+ Tế bào gốc từ mô dây rốn (UCSC): Được thu thập từ những vùng giải

phẫu khác nhau của dây rốn, đều thể hiện khả năng của tế bào gốc điển hình, với khả năng biệt hoá đa dạng ở các mức độ khác nhau (Hình 1.2) Trong đó quần thể tế bào gốc có khả năng biệt hoá không giới hạn (USSC) có thể biệt hoá thành các nguyên bào xương, nguyên bào sụn, các tế bào mô mỡ, các tế bào thần kinh (cả neuron và tế bào thần kinh đệm) và tế bào tạo máu cũng đã được xác định trên thực nghiệm [22],[41],[112]

+ Tế bào gốc thu gom từ các cấu trúc khác: Gan phôi, bánh rau, màng ối

và dịch ối [107],[166]

Màng lót

Vùng gian mạch

Dưới màng lót

Hình 1.2 Các vị trí thu gom tế bào gốc từ dây rốn[100]

− Tế bào gốc trưởng thành (ASC) được thu thập từ cá thể trưởng thành

Nhóm tế bào gốc này lại được xếp loại dựa vào nguồn cung cấp

− Tế bào gốc trưởng thành (ASC) được thu thập từ cá thể trưởng thành

Nhóm tế bào gốc này lại được xếp loại dựa vào nguồn cung cấp

+ Tế bào gốc từ tuỷ xương

+ Tế bào gốc từ tuỷ xương (BMSC): Là nguồn cung cấp tế bào gốc cho

những trường hợp ghép đầu tiên và rất phổ biến [84] Tế bào gốc tạo máu cũng có những dưới nhóm với đặc điểm khác nhau như quần thể

tế bào có khả năng tạo máu dài hạn (LT-HSC) và ngắn hạn (ST-HSC)

có khả năng hồi phục mô tạo máu rất khác nhau khi được ghép vào cơ thể nhận [102], [129]

Tế bào gốc máu ngoại vi (PBSC): Được thu gom bằng các máy tách

tế bào sau khi huy động ra máu bằng các cytokine đơn thuần hay kết hợp, hoặc cùng với hoá trị liệu Hiện nay, nguồn tế bào gốc này được

sử dụng cho hầu hết các trường hợp ghép tự thân thay cho nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương và dần được sử dụng phổ biến hơn để ghép đồng loại Kết quả cho thấy thời gian mọc ghép sớm hơn, khả năng miễn dịch được phục hồi nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến ghép thấp hơn, nguy cơ xuất hiện ghép chống chủ tương đương, tuy nhiên

tỷ lệ ghép chống chủ mạn tính cao hơn so với sử dụng nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương [23],[131],[132]

+

dụng biện pháp kỹ thuật nuôi cấy ngoài cơ thể trong môi trường lỏng,

có cung cấp đầy đủ các yếu tố kích thích tạo máu, các quần thể tế bào gốc được nhân lên nhằm đáp ứng đủ lượng tế bào cần cho ghép trên lâm sàng Tuy nhiên, đây không phải là một giải pháp được lựa chọn hàng đầu vì giá thành đắt, đòi hỏi trang thiết bị nuôi cấy hiện đại và trong điều kiện vô khuẩn tuyệt đối Mặt khác, do phát triển ngoài cơ thể nên quá trình biến đổi tế bào ở mức phân tử còn chưa được nghiên cứu kỹ, do vậy việc truyền loại tế bào này trở lại cơ thể người bệnh vẫn đang được cân nhắc [48],[70],[94],[98]

+ Tế bào gốc cảm ứng (iPS): Được tạo thành qua việc tác động thay đổi

lại chương trình biệt hoá (reprogramming) của tế bào sinh dưỡng bằng cách đưa vào nhân tế bào đó các gen thích hợp (Oct3/4, Sox2, Klf4 và c-Myc) Đây là thành tựu mới nhất trong nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc hiện nay Các tế bào gốc cảm ứng iPS mang những đặc điểm về hình thái, biểu hiện các dấu ấn màng, dữ liệu gen (gene expression profile), khả năng tăng sinh và biệt hoá không giới hạn tương tự như các tế bào gốc phôi Các nghiên cứu được công bố từ năm 2007 đã thu được kết quả tạo tế bào gốc vạn tiềm năng từ nguyên bào xơ, nguyên bào nội mạc [152],[170]

1.1.2.3 Xếp loại theo mô đích và chức năng biệt hoá

Dựa vào khả năng phân lập được từ mô cụ thể, cũng như khả năng định hướng biệt hoá đến các tế bào trưởng thành của mô đích đặc trưng để xếp loại và định danh các tế bào gốc đặc hiệu mô (tissue-specific stem cells) Các công trình nghiên cứu về tế bào gốc sớm nhất được công bố là các tế bào gốc tạo máu Về lý thuyết của sự phát triển, cơ thể của mọi cá thể luôn luôn đổi mới Trong những điều kiện sinh lý bình thường và cả trong các điều kiện bệnh lý Trong điều kiện sinh lý, quá trình tái tạo và đổi mới mô đích là nhờ

+ Tế bào gốc đệm từ tuỷ xương (Bone marrow-derived stroma stem

cells) có đa tiềm năng biệt hoá [26],[73]

+ Tế bào gốc đệm khác: Thu gom từ máu ngoại vi huy động, từ máu

dây rốn [75],[126]

+ Tế bào gốc biệt hoá từ mô mỡ (Adipose tissue-derived stem cells):

có khả năng biệt hoá thành các tế bào xương, sụn, tế bào gan hay các neuron thần kinh [175]

+ Tế bào gốc biệt hoá từ da (Skin-derived precursor stem cells): có

khả năng biệt hoá thành các neuron thần kinh và các tế bào Schawnn [173]

Trong từng mô, những quần thể tế bào mang đặc điểm đặc trưng của

tế bào gốc cũng đã và đang được xác định [118],[140]

Tế bào gốc ung thư (CSC): Gần đây, một số nghiên cứu về bệnh lý ác tính

cơ quan tạo máu và ung thư đã tập trung chứng minh giả thiết về Theo lý thuyết này, sở dĩ các khối u có thể tồn tại và phát triển là nhờ khả năng tự tái tạo (self-renewal) của một quần thể tế bào trong khối u và đó chính là các tế bào gốc ung thư Các nghiên cứu đang tập trung chứng minh và xác định quần thể tế bào gốc đặc hiệu này, đồng thời xác định các đặc trưng để làm cơ

sở cho các phương pháp điều trị nhắm đích (target therapy) (Hình 1.3) với hy vọng có thể kiểm soát được khả năng phát triển của khối u và có thể điều trị khỏi bệnh hoàn toàn [90],[114],[127],[155]

1.2.1 Đặc điểm tế bào gốc tạo máu

Đặc trưng của tế bào gốc tạo máu là khả năng tự tái tạo, biệt hoá thành các dòng tế bào máu trưởng thành và có thể tái tạo mô tạo máu thực nghiệm trên động vật sau khi chiếu xạ liều chí tử Tỷ lệ tế bào gốc thường rất thấp, khoảng 1 tế bào trong tổng số từ 10.000 đến 1.000.000 tế bào tuỷ xương và hầu hết ở trạng thái nghỉ, không phân bào [42] Trong một số tình huống nhất định, như nhiễm khuẩn, chảy máu cấp tính hoặc điều trị hoá chất các tế bào gốc sẽ nhanh chóng tăng sinh Tình trạng rối loạn quá trình tạo máu cũng có thể gặp trong các bệnh lý như lơxêmi, bệnh tăng sinh tuỷ hoặc giảm sinh tuỷ

Do vậy, tế bào gốc tạo máu được định nghĩa dựa trên ba đặc trưng cơ bản,

đó là khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hoá đa dòng và khả năng phục hồi

mô tạo máu [138] Ngoài ra còn một số đặc điểm khác như khả năng di

chuyển từ tủy ra máu, tính mềm dẻo (plasticity) trong biệt hóa và chết theo chương trình

a Khả năng tự tái tạo

Bằng chứng rõ ràng về khả năng tự tái tạo của các tế bào gốc là việc cung cấp liên tục các tế bào máu trong suốt cuộc đời của một cá thể Khả năng này liên quan chặt chẽ với hoạt tính của enzym tổng hợp chuỗi có khả năng tổng hợp của chuỗi DNA mới bằng cách rút ngắn độ dài chuỗi DNA trong quá trình phân chia tế bào (telomerase) Ở người, thời gian tổng hợp chuỗi DNA rất ngắn trong quá trình phân bào của tế bào gốc, đặc biệt khi bị tác động mạnh (stress) như trong quá trình ghép [50],[110]

b Khả năng biệt hoá đa dòng

Tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hoá thành tất cả các dòng tế bào máu, ban đầu tạo ra các tế bào định hướng dòng: dòng tuỷ và dòng lympho Các tế bào định hướng dòng lympho sẽ phân chia và biệt hoá thành các dòng lympho T, B và NK Các tế bào gốc định hướng dòng tuỷ sẽ phân chia và biệt

dưới sự kích thích đặc hiệu của các cytokine có thể chuyển đổi lẫn nhau từ dòng tuỷ sang dòng lympho và ngược lại [138], [141]

c Khả năng phục hồi mô tạo máu

Các y văn sớm nhất đã công bố về khả năng phục hồi mô tạo máu của

tế bào gốc dựa trên nghiên cứu thực nghiệm ghép trên chuột sau chiếu xạ liều chí tử Tương tự như vậy, các tế bào gốc ở người cũng đặc trưng bởi đặc tính

có thể quay trở lại tuỷ xương và tái tạo mô tạo máu trong mô hình ghép dị loài thực nghiệm Sau khi trở lại cư trú tại tuỷ xương (homing), các tế bào gốc tạo máu tăng sinh và biệt hoá, đáp ứng những tín hiệu kích thích từ môi trường đệm gian bào (extracellular matrix) [43]

1.2.2 Nguồn gốc tế bào gốc tạo máu

Quá trình tạo máu được hình thành và tiến hóa từ ếch, cá ngựa đến động vật có vú, kể cả chuột và ở người Tuy nhiên, quá trình hình thành tế bào gốc tạo máu và quá trình tạo máu nguyên phát trong thời kỳ bào thai ở người còn chưa được chứng minh rõ ràng Từ trung bì phôi, sau quá trình tạo máu nguyên phát ngắn ngủi là quá trình tạo máu thứ phát Sau đó, các tế bào gốc mở rộng phạm vi cư trú đến gan và lách của bào thai (ở động vật có vú)

và thận (ở cá ngựa) và bắt đầu biệt hoá thành các dòng tế bào máu Trong giai đoạn cuối của thai kỳ, các tế bào gốc di cư xa hơn đến tuỷ xương ở động vật

có vú và cư trú lâu dài tại đây

Hiện tượng di chuyển tự nhiên của các tế bào gốc trong quá trình phát triển phôi thai cũng có thể giúp giải thích được sự tồn tại của chúng tại các

mô không tạo máu ở người trưởng thành Chỉ khi đến cư trú tại tuỷ xương-với vi môi trường tạo máu lý tưởng-các tế bào gốc mới phát huy được

Copyright © 2005 Elsevier Inc (USA) All rights reserved.

Định hướng dòng tuỷ

T lympho

B lympho

NK

1.2.3 Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu

Các nghiên cứu về tế bào gốc tạo máu thường gặp phải khó khăn vì chúng phân bố rất rải rác trong các mô tạo máu và không có các dấu ấn đặc trưng hay các kỹ thuật đặc hiệu hoàn toàn để xác định chính xác tế bào gốc tạo máu Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng một tập hợp nhiều phương pháp để xác định và phân lập tế bào gốc, bao gồm: xác định dấu ấn màng tế bào, nhuộm loại trừ, nuôi cấy in vitro, đếm tế bào gốc trong ghép và phương pháp thực nghiệm trên linh trưởng

a Phương pháp xác định dấu ấn màng tế bào

Cho đến nay, chưa có một dấu ấn nào được cho là đặc trưng để xác định chính xác tế bào gốc tạo máu ở người Các tế bào gốc tạo máu là những

tế bào mang dấu ấn CD34+ hay không mang dấu ấn CD34 ? [49] Thực

Tuy đã có nhiều bằng chứng chứng minh tế bào gốc tạo máu ở người

là những tế bào có CD34+, nhưng một số nghiên cứu gần đây lại phát hiện thấy các tế bào không mang dấu ấn CD34, Lin và CD38 nhưng có CD133+ cũng có khả năng mọc ghép và biệt hoá đa dòng và có thể được định nghĩa như quần thể tế bào gốc nguyên phát ở giai đoạn rất sớm [141] Mặt khác, các tế bào không có dấu ấn CD34 sau quá trình nuôi cấy in vitro lại biệt hóa

ra quần thể các tế bào có CD34+ Một bằng chứng khác là khả năng mọc cụm trong mọi điều kiện nuôi cấy in vitro luôn chiếm tỷ lệ rất thấp trong quần thể

tế bào có dấu ấn CD34 Những dữ kiện này đặt ra câu hỏi liệu tế bào gốc tạo máu có phải chỉ là các tế bào mang dấu ấn CD34+ hay còn những dấu ấn khác [92] Trên thực tế lâm sàng, CD34 vẫn là dấu ấn quan trọng nhất để xác định quần thể tế bào gốc tạo máu

b Phương pháp nhuộm thải trừ

Tế bào gốc tạo máu người có đặc tính thải trừ một số thuốc nhuộm DNA như Rhodamine-123 và Hoechst-33342 [36] Trong mô tạo máu, các tế bào Hoechst-/low tồn tại như một quần thể phụ (side-population cells) có các dấu ấn giống như tế bào gốc, nhưng có thêm dấu ấn của protein chống ung thư phế quản BCRP+ Các tế bào này có khả năng tăng sinh rất cao khi ghép vào cơ thể Trong tủy xương người, quần thể này không mang dấu ấn CD34

và Lin Ở máu ngoại vi huy động hay máu dây rốn quần thể này có thể mang dấu ấn CD34+ hoặc không [23] Khả năng tái tạo của các tế bào này ở người đang tiếp tục được nghiên cứu

Một số hệ thống nuôi cấy đã được phát triển và áp dụng để đếm các tế bào gốc ở chuột và người, bao gồm kỹ thuật tạo cụm tế bào (CFC), kỹ thuật tạo cụm các tế bào có khả năng tăng sinh cao (HPPCFC), kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn (LTC-ICs) và cải tiến (E-LTC-ICs) Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn cải tiến xác định dưới nhóm các quần thể tế bào sau quá trình nuôi cấy dài hạn, có khả năng tăng sinh rất cao và duy trì đến 18 tuần

Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy có thể giúp đếm các tế bào gốc tạo máu

đa tiềm năng ở người Nguyên lý của kỹ thuật này là lựa chọn quần thể tế bào gốc nguyên phát, nuôi cấy trong điều kiện có đầy đủ các yếu tố kích thích tăng sinh dòng, tạo điều kiện cho quá trình biệt hoá theo hướng dòng tuỷ hoặc dòng lympho Tuy nhiên kỹ thuật này không đánh giá được khả năng tái

cư trú của các tế bào gốc trở lại tuỷ xương mà Khả năng này chỉ đánh giá được trong quá trình ghép [23],[156]

d Phương pháp xác định tế bào gốc trong quá trình ghép

Kỹ thuật xác định tế bào gốc dựa vào khả năng hồi phục hoàn toàn hệ tạo máu của cá thể nhận sau khi đã bị diệt tuỷ

Các tế bào gốc của người được đếm gián tiếp qua ghép dị loài vào chuột sau chiếu xạ liều nửa chí tử hoặc bào thai cừu đã mẫn cảm Sự có mặt của tế bào gốc người trong tuỷ xương của động vật nhận ghép được đánh giá bằng dấu ấn CD45+ hoặc sự có mặt của DNA đặc trưng người Đây là điểm quan trọng để đánh giá ghép thành công, xác định được sự có mặt của tế bào gốc được tiêm vào và khả năng hồi phục mô tạo máu cho động vật thực nghiệm [124]

e Phương pháp thực nghiệm trên linh trưởng

Mô hình ghép tự thân trên động vật linh trưởng như khỉ rhesus macaques và khỉ đầu chó đã được sử dụng để bước đầu đánh giá hoạt động

của tế bào gốc tạo máu Tính tương đồng cao về gen học và sinh học của loài

1.2.4 Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc tạo máu

Các nghiên cứu về đặc điểm sinh học của tế bào gốc đã góp phần làm sáng tỏ về quá trình tự tái tạo, biệt hoá và chết theo chương trình Những kiến thức về chu trình tế bào giúp hoàn thiện ứng dụng ghép tế bào gốc tạo máu trên lâm sàng – một phương pháp điều trị rất hiệu quả nhiều bệnh lý ác tính

và không ác tính cơ quan tạo máu cũng như các bệnh lý cơ quan khác [5],[71],[74],[101], [104],[108],[172] Có hai hình thức ghép:

Ghép đồng loại: Tế bào gốc “lành lặn” của người cho sẽ được truyền

vào nhằm giúp hồi phục mô tạo máu của cơ thể người nhận, do vậy thời gian hồi phục bạch cầu và tiểu cầu được rút ngắn sau diệt tuỷ, giảm biến chứng nặng gây tử vong do quá trình suy tuỷ kéo dài sau điều trị bằng hoá chất hay

xạ trị Nguồn tế bào gốc có thể lấy từ người cho có quan hệ huyết thống (related donor) như cha, mẹ, anh chị em ruột, họ hàng hoặc không có quan hệ huyết thống (unrelated donor) Các tế bào ghép vào cần phải hòa hợp về hệ kháng nguyên tổ chức HLA Một hình thức đặc biệt của ghép đồng loại là ghép cùng gen (syngenetic transplantation) do nguồn tế bào gốc được lấy từ anh/chị em đôi cùng trứng

Ghép tự thân: Tế bào gốc tạo máu của người bệnh được thu gom,

Chỉ định điều trị của ghép tạo máu ngày càng được mở rộng, từ các bệnh lý ác tính tạo máu như lơ xê mi cấp, u lympho, đa u tủy xương đến các bệnh lý khác như suy tủy, thalassemia và còn được sử dụng trong điều trị một

số u đặc (solid tumors) Bên cạnh tác dụng hồi phục mô tạo máu, gần đây, vai trò của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch và sự khác biệt về HLA giữa người cho và người nhận đã được ứng dụng để phát huy hoặc điều hòa tác dụng “ghép chống ung thư”

Việc nghiên cứu áp dụng các tế bào gốc tạo máu (HSC) vẫn còn nhiều khó khăn, một trong những mục đích của các nghiên cứu là cố gắng tạo

đủ số lượng tế bào gốc từ nguồn cung cấp có số lượng thấp, ví dụ sử dụng tế bào gốc từ máu dây rốn để ghép cho người trưởng thành Tuy nhiên muốn phát triển được, các tế bào gốc phải được kích thích để phân chia liên tục và cân đối, nghĩa là các tế bào sinh ra duy trì được các đặc điểm giống như tế bào “mẹ” Một số yếu tố có thể là nguyên nhân gây cản trở quá trình phát triển của các HSC [23],[159]:

1 Quá trình tăng sinh của HSC trong thực nghiệm là có giới hạn Điều này được xác định do hoạt tính enzyme DNA tolemerase vì qua mỗi chu kỳ phân bào, độ dài chuỗi DNA lại bị rút ngắn lại do hoạt tính enzyme giảm đi và do vậy khả năng tăng sinh không phải là vô hạn

2 Các HSC và các tuổi biệt hoá trung gian đi vào cái chết theo chương trình (apoptosis) Điều này xảy ra trong quá trình điều hoà tế bào gốc ở giai đoạn tạo máu ổn định nên sự phát triển ngoài cơ thể có thể bị giới hạn

1.3 NGUỒN CUNG CẤP VÀ THU GOM TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU

Đến nay, nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép trên lâm sàng có thể được thu gom từ tuỷ xương, từ máu ngoại vi sau quá trình huy động bằng cytokin và/hoặc kết hợp với hoá trị liệu, và từ máu dây rốn [30],[33]

Tế bào gốc từ tuỷ xương là nguồn cung cấp được mô tả sớm nhất khi Thomas tiến hành thành công ca ghép đầu tiên năm 1959 [157] Hơn hai mươi năm sau, tế bào gốc ở máu ngoại vi sau huy động được sử dụng phổ biến hơn vì quá trình thu gom không cần gây mê toàn thân và vì người nhận

tế bào gốc từ máu ngoại vi sau huy động thường có thời gian hồi phục bạch cầu và tiểu cầu sớm hơn so với nhận tế bào gốc từ tuỷ xương [30] Trường hợp ghép tế bào gốc từ máu dây rốn đầu tiên được tiến hành năm 1988 [từ 33] và từ đó trở đi, đây là nguồn tế bào gốc chủ yếu được sử dụng cho ghép ở người trưởng thành khi không tìm được người cho phù hợp Tuy nhiên, thành công của ghép tế bào gốc từ máu dây rốn thường bị hạn chế do số lượng tế bào gốc thu được thấp

Về phương diện sinh học, ghép tế bào gốc từ các nguồn khác nhau có chất lượng và số lượng tế bào gốc cũng khác nhau và điều đó ảnh hưởng đến động học của quá trình phục hồi khả năng tạo máu Nói chung, sử dụng tế bào gốc

từ máu ngoại vi sau huy động cho thấy thời gian hồi phục bạch cầu hạt và tiểu cầu sớm nhất, sau đó là tế bào gốc tủy xương, chậm nhất là khi sử dụng

tế bào gốc máu dây rốn [85]

1.3.1 Tế bào gốc tạo máu sau huy động ra máu ngoại vi

Đây là nguồn tế bào định hướng tạo máu từ tuỷ xương, được huy động ra máu ngoại vi bằng cách sử dụng những yếu tố kích thích tăng trưởng

Hiện nay, đây là nguồn chủ yếu sử dụng cho ghép đồng loại khi có người cho cùng huyết thống (related donor) Huy động tế bào gốc được tiến hành đối với người tình nguyện bằng G-CSF có thể thu đủ số lượng tế bào CD34 cần thiết, đồng thời tránh được các biến chứng khi phải gây mê để thu hoạch

từ tuỷ xương Các nghiên cứu lâm sàng khi sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi với sử dụng tế bào gốc từ tuỷ cho thấy: kết quả mọc ghép sớm hơn, khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, giảm tỷ lệ tử vong liên quan đến biến chứng ghép ở nhóm sử dụng tế bào gốc máu ngoại vi, nguy cơ xuất hiện bệnh ghép chống chủ tương đương ở cả hai nhóm [45],[155]

1.3.1.1 Huy động tế bào gốc ra máu ngoại vi

Tế bào mang dấu ấn CD34+ thu gom được qua huy động ra máu ngoại vi có nhiều đặc điểm khác với tế bào gốc thu gom từ tuỷ xương Tác dụng của quá trình huy động cần phải đạt được mục đích vừa kích thích tăng số lượng tế bào và vừa giải phóng các tế bào này ra khỏi khoang tuỷ Nhiều liệu trình huy động khác nhau đã được sử dụng cho bệnh nhân và người cho bằng cách

sử dụng các cytokine tạo máu, kết hợp các cytokine với nhau, kết hợp cytokine và hoá trị liệu, chemokine đơn độc hay kết hợp với cytokine

a Huy động bằng cytokine

* Huy động bằng G-CSF: là cytokine được sử dụng nhiều nhất vì hiệu quả

cao so với các cytokine khác, và lành tính Khi huy động, số lượng tế bào CD34 thay đổi theo thời gian, mức cao nhất đạt được vào ngày thứ năm, thấp

số lượng tế bào CD34+ ở máu ngoại vi ngay trước khi bắt đầu dùng cytokine Liều sử dụng để huy động thường là 10μg/kg/ngày, có thể tăng đến 40μg/kg/ngày và kết quả huy động có liên quan đến liều được sử dụng [165]

Sử dụng liều duy nhất hay hai lần trong ngày ở người trưởng thành không đem lại kết quả chắc chắn, nhưng mang lại kết quả tốt hơn ở trẻ em Bệnh nhân đã điều trị từ trước bằng hoá trị liệu hay xạ trị liệu, bệnh nhân cao tuổi

có kết quả huy động đạt thấp [20], [164]

Độc tính của G-CSF thể hiện rõ nhất khi huy động từ người cho khỏe mạnh Hầu hết có biểu hiện toàn thân, chủ yếu là đau xương với mức độ nhẹ, chỉ vài trường hợp cần giảm liều hoặc sử dụng thuốc giảm đau Một số biến chứng khác cũng đã được ghi nhận như tăng kích thước lách, tăng nguy cơ tắc mạch, tăng đông Các bệnh nhân mắc bệnh tự miễn có thể tăng biểu hiện bệnh trong quá trình sử dụng G-CSF Tuy nhiên không có báo cáo nào về hiện tượng tăng nguy cơ của rối loạn sinh tuỷ hay bệnh ác tính tạo máu ở người cho khoẻ mạnh hoặc bệnh nhân được điều trị G-CSF liệu trình ngắn ngày Không có biến chứng lâu dài nào được ghi nhận ở người cho [21]

Sử dụng G-CSF làm thay đổi số lượng tế bào máu và các chỉ số hoá sinh và đông cầm máu Các enzym Alanine aminotransferase (ALT), lactate dehydrogenase (LDH) và alkaline phosphatase (ALP) huyết thanh tăng, ure

và bilirubine giảm Những thay đổi hoá sinh này sẽ mất đi trong vòng 2 tuần sau khi dừng sử dụng [17]

* Huy động bằng GM-CSF: Khi kết hợp GM-CSF và hóa trị liệu để huy

động, số lượng CFU-GM có thể tăng lên tới 1000 lần Trong một số trường hợp, kết hợp cyclophosphamide với GM-CSF có hiệu quả hơn khi sử dụng G-CSF đơn độc Giống như G-CSF, GM-CSF cũng có tác dụng huy động

* Các cytokine khác: cũng đã được nghiên cứu

- Yếu tố kích thích đại thực bào (M-CSF): không có tác dụng với liều 8.106

IU/ngày [55]

- Erythropoietin (EPO): có tác dụng huy động yếu [117]

- Interleukin-3: chỉ làm tăng nhẹ số lượng CFU-GM ở ngày thứ tám và lại

giảm xuống ở ngày thứ 15 [59]

- PIXY-321: PIXY-321 là một phân tử lai của GM-CSF và IL-3, có gây

tăng nhẹ CFU-GM nhưng không làm tăng số lượng tế bào CD34+ [31]

- Yếu tố tế bào gốc (SCF: Stem cell factor): SCF đơn thuần có tác dụng phụ

thuộc liều và làm tăng từ 6-10 lần CFU-GM với độc tính như phù mạch (angioedema), nổi mày đay, ngứa, co thắt thanh quản [47]

* Kết hợp các cytokine

Khi sử dụng đồng thời, các cytokine có thể sẽ hiệp đồng tác động

- G-CSF và GM-CSF: hiệu quả huy động PBSC tăng lên rất cao, nhưng

nếu tiêm GM-CSF trước thì không làm tăng hiệu quả huy động [69],[167]

- SCF và G-CSF: Thực nghiệm trên động vật cho thấy kết hợp SCF và

G-CSF chỉ có thể làm tăng số lượng tế bào định hướng trong máu từ

3.5-21.6 lần Các kết quả ứng dụng lâm sàng còn hạn chế hơn [106]

- IL-3 và G-CSF: Kết quả huy động khá tốt, đỉnh tế bào định hướng xuất

hiện vào ngày thứ 5 khi sử dụng G-CSF đơn độc, và ngày thứ ba nếu kết

hợp IL-3 [61]

- IL-3 và GM-CSF: hiệu quả thấp và nhiều biến chứng [34]

- Epo và G-CSF: số lượng GM-CFU thu được giảm nhẹ so với nhóm chỉ sử

dụng G-CSF đơn độc [111]

* Một số kết hợp khác: So với G-CSF đơn độc, kết hợp TPO và G-CSF thu

b Huy động bằng hoá trị liệu kết hợp cytokine

Số lượng CFU-GM ở máu ngoại vi tăng rất cao trong thời gian hồi phục sau hoá trị liệu [111] và sử dụng hoá trị liệu kết hợp cytokine đạt kết quả huy động cao hơn so với khi sử dụng đơn độc từng biện pháp Kết quả nghiên cứu

gợi ý rằng, nếu thất bại với huy động bằng cytokine đơn độc thì có thể tiến hành huy động kết hợp hoá trị liệu [19],[80]

1.3.1.2 Thu gom tế bào gốc sau khi huy động ra máu ngoại vi

a Thời điểm tiến hành thu gom

Việc chọn thời điểm tiến hành thu gom là yếu tố quan trọng để đảm bảo có được lượng tế bào đủ cho ghép Số lượng tế bào CD34 thu được có thể ước lượng dựa vào: (1) số lượng CD34 trước thu gom, (2) tổng thể tích máu được

xử lý và (3) khả năng thu gom của thiết bị

b Kỹ thuật thu gom

Kỹ thuật tách tế bào được sử dụng rộng rãi để tách tiểu cầu từ người cho khoẻ mạnh và dường như không có nguy cơ gì đáng kể xảy ra với người cho Các yếu tố quan trọng đảm bảo độ an toàn của kỹ thuật tách tế bào gốc cũng như với tách tiểu cầu bao gồm: (1) tình trạng tĩnh mạch đường vào, (2) thể tích máu tồn tại ở ngoài cơ thể trong quá trình xử lý và (3) loại dịch được truyền vào người cho hay bệnh nhân Tuy nhiên, việc thu gom PBSC để ghép

tự thân cho bệnh nhân đang điều trị thì cần sự chăm sóc thích hợp trong quá trình tách [150]

Tình trạng của bệnh nhân tham gia tách cần được đánh giá và những nhân

c Tình trạng tĩnh mạch đường vào

Tĩnh mạch đường vào phù hợp là yếu tố quan trọng để có thể tiến hành kỹ thuật hiệu quả nhất Các thiết bị tách theo nguyên lý liên tục đòi hỏi áp lực đường vào với dòng chảy ổn định và thường ít nhất với tốc độ 20ml/phút Đa

số người cho tình nguyện có thể sử dụng trực tiếp tĩnh mạch cánh tay, nhưng

ở những bệnh nhân ghép tự thân nên được đặt catheter tĩnh mạch để sử dụng cho cả quá trình tách tế bào và quá trình ghép sau đó [67], [87],[131]

d Thiết bị tách tế bào

Hiện nay có nhiều loại thiết bị tách tế bào gốc từ máu ngoại vi và được chia làm hai loại: tách theo dòng liên tục (continuous-flow device) như Fenwall CS3000, COBE Spectra, Fresenius AS104 hoặc tách theo dòng không liên tục (discontinuous-flow device) như Haemonetics Loại tách theo dòng không liên tục có lợi là chỉ sử dụng một đường tĩnh mạch, trong khi đó, loại tách theo dòng liên tục đòi hỏi hai đường tĩnh mạch để rút máu và truyền trả lại, cần xử lý thể tích máu lớn hơn nhưng thời gian xử lý ngắn hơn Hiện nay, thiết bị làm giàu các tế bào đơn nhân chứa HSC cũng đã có trên thị trường Thiết bị này giúp làm giảm số lượng bạch cầu hạt và tiểu cầu khi thu gom và tạo thuận lợi cho quá trình bảo quản, cũng như các quá trình xử lý khác

e Dung dịch chống đông

Dung dịch chống đông được thêm vào máu trong quá trình tách tế bào để ngăn ngừa hiện tượng ngưng kết khi máu tuần hoàn ngoài cơ thể và ngăn hiện tượng kết dính tế bào trong chế phẩm Chất chống đông chứa citrate có tác dụng đó và an toàn khi sử dụng cho quá trình tách tiểu cầu từ người cho khoẻ mạnh và cũng như trong quá trình tách PBSC Trở ngại chủ yếu đó là

dòng máu đi qua thiết bị hoặc thay đổi tỷ lệ trộn citrate Ví dụ với máy COBE-Spectra, giới hạn tốc độ dòng máu mà theo đó citrate được tiêm vào đồng thời không quá 1 ml/phút/lít máu bệnh nhân, được tính toán dựa vào giới tính và cân nặng Ngoài ra, cần phải điều chỉnh dựa vào chức năng gan, thận của người bệnh cũng như nồng độ điện giải, nồng độ protein huyết tương đặc biệt ở những bệnh nhân đang điều trị hóa chất

Kinh nghiệm trong quá trình xử lý máu ở bệnh nhân, các dấu hiệu ban đầu của tình trạng ngộ độc citrate xảy ra cần ngừng quá trình lại cho đến khi hết dấu hiệu rồi lặp lại quá trình xử lý ở tốc độ thấp hơn Heparin có thể được sử dụng để thay thế cho một phần citrate Một số trung tâm sử dụng citrate chống đông không liên tục hoặc bơm liên tục calcium gluconate trong quá trình xử lý, đặc biệt khi xử lý lượng máu lớn Tuy nhiên, việc bồi phụ quá nhiều calci cũng làm giảm chức năng cơ tim và cần theo dõi sát diễn biến của hiện tượng này

f Kỹ thuật tách thể tích lớn (LVL: Large volume leukapheresis)

Số lượng tế bào CD34+ được thu gom tỷ lệ thuận với số lượng CD34+ ở máu ngoại vi và phụ thuộc vào khả năng thu gom của thiết bị và thể tích máu được

xử lý Với những bệnh nhân có lượng CD34+ ở máu thấp, cần phải tiến hành thu gom nhiều lần để đạt được liều tế bào cần thiết đủ cho ghép Một biện pháp khác có thể được áp dụng là kỹ thuật tách thể tích lớn với quy trình xử

lý kéo dài hơn LVL không phải là một tên gọi đúng, nhưng thường được sử dụng để chỉ quá trình xử lý một lượng máu lớn gấp hơn 2-3 lần thể tích máu của bệnh nhân Điển hình, thể tích máu xử lý gấp sáu lần hoặc hơn đối với bệnh nhân thường từ 25 đến 36 lít LVL giảm số ngày sử dụng cytokine và số lần tách tế bào và giảm chi phí

nhưng tốc độ dòng máu có thể tăng lên để giảm thời gian xử lý và kéo dài thời gian thu gom để đạt được thể tích dự kiến Nguy cơ của LVL là thời gian tách kéo dài và ngộ độc citrate Bệnh nhân đồng thời cũng có thể giảm tiểu cầu và giảm đến mức thấp [39]

g Kỹ thuật thu gom từ người cho đồng loại

Sử dụng PBSC cho ghép đồng gen và đồng loại có thời gian mọc ghép nhanh hơn so với tế bào gốc từ tuỷ xương Tần suất xuất hiện GVHD cấp tương tự với tế bào gốc từ tuỷ xương, mặc dù số lượng T-lympho trong chế phẩm PBSC cao hơn nhiều lần Tuy nhiên, tỷ lệ GVHD mạn cao hơn khi ghép PBSC, và khó điều trị hơn

Quá trình thực hiện tách tế bào cũng được tiến hành khá thuận lợi đối với người cho PBSC để ghép đồng loại Người cho tình nguyện khoẻ mạnh, đều được sử dụng G-CSF để huy động Một số biến chứng gặp thoáng qua trong quá trình huy động và tách, tuy nhiên đã có những báo cáo về tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim, tai biến mạch não và vỡ lách [53]

h Kỹ thuật tách ở trẻ em và và bệnh nhi

PBSC có thể thu gom được từ bệnh nhi, bao gồm cả trẻ nhỏ Khó khăn cơ bản là việc duy trì một lượng máu cố định ngoài cơ thể (trong thiết bị tách), chọn tĩnh mạch đường vào, theo dõi sát bệnh nhi Điều đặc biệt quan trọng đối với bệnh nhi là chọn thời điểm tách hợp lý nhất để giảm tối đa số lần tách cần tiến hành và nhận được số lượng tế bào cần thiết

Thể tích máu xử lý thường được căn cứ dựa vào thể tích máu cá nhân thay cho thể tích đặt sẵn (ví dụ đặt 2 lần thể tích máu thay cho đặt 6 lít) đối với mọi bệnh nhi Bệnh nhi cũng có thể được tiến hành LVL để nhận được đủ số lượng tế bào HSC với số lần tách ít nhất Tốc độ dòng máu vào thiết bị ở trẻ

em thấp hơn so với ở người lớn nhằm làm giảm nguy cơ phản ứng với citrate

[65],[154]

giảm tiểu cầu do G-CSF và do quá trình gạn tế bào cũng là một trong những biến chứng thường gặp Khoảng 90% các trường hợp có biểu hiện đau xương, đau đầu, đau người, cảm giác mệt, buồn nôn và nôn, tê bì do hạ can xi máu Các biến chứng nặng có thể gặp như lách to ra, thâm nhiễm bạch cầu hạt dưới da (hội chứng Sweet), huyết khối động mạch, phản vệ Về lâu dài, cho đến nay, chưa có báo cáo nào đề cập đến các biến chứng về huyết học, miễn dịch hay tình trạng sức khỏe của người cho tình nguyện không liên quan huyết thống sau quá trình huy động và gạn tách tế bào gốc từ máu ngoại vi

1.3.2 Tế bào gốc tạo máu từ tuỷ xương

Hiện nay, tế bào gốc từ tuỷ xương chủ yếu được sử dụng cho ghép đồng loại, hoặc trong một số trường hợp ghép tự thân nhưng không thể huy động được

tế bào gốc ra máu ngoại vi Ghép tế bào gốc từ tuỷ đồng loại giúp người bệnh được ghép mà không bị lẫn tế bào ung thư (tumor-free graft), đồng thời cung cấp khả năng miễn dịch chống ung thư Những chỉ định kiểu ghép này bao gồm bệnh lý có tổn thương tuỷ xương, suy giảm miễn dịch, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh hoặc bệnh lý huyết sắc tố

Nguồn tế bào sử dụng ghép có thể thu thập từ tuỷ xương của người cho hoà hợp toàn bộ hoặc một phần, có hoặc không liên hệ huyết thống Một số ngân hàng dữ liệu về tuỷ xương đã được thiết lập trên khắp thế giới, trong đó lớn nhất là Chương trình người hiến tuỷ quốc gia Mỹ, hàng năm có trên 2000 trường hợp được tiến hành ghép [44]

Quá trình thu gom tế bào gốc từ tủy xương đối với trường hợp ghép

tự thân hay ghép đồng loại tương tự như nhau và thực hiện trong phòng mổ

vô khuẩn Trộn dung dịch chống đông cho dịch tuỷ với mỗi lần hút và được lọc trước khi bơm vào túi bảo quản, sau đó chuyển vào túi vô khuẩn và tiến

1.3.3 Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn

Trong dây rốn rất giàu tế bào định hướng tạo máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng (early and committed progenitor cells) Năm 1989, lần đầu tiên tiến hành ghép thành công tế bào gốc máu dây rốn cho bệnh nhi Fanconi, và đến nay hàng nghìn trường hợp ghép đã được tiến hành để điều trị bệnh máu

ác tính và không ác tính [35],[40],[161]

Máu dây rốn được thu thập từ bánh rau bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, ngay tại thời điểm bà mẹ sinh con Thông thường, máu dây rốn được thu thập vào túi cỡ nhỏ với thể tích khoảng 150 đến 250 ml có sẵn chất chống đông Tùy theo quy trình, tế bào gốc từ máu rốn được thu thập từ bánh rau trước hoặc sau khi sổ rau Quá trình thu gom không được gây cản trở việc chăm sóc người mẹ cũng như em bé và nên có kế hoạch thu gom từ trước khi sinh Để giảm khả năng nhiễm khuẩn, dây rốn cần được sát khuẩn bằng cồn và các dung dịch sát khuẩn khác Sử dụng kim có kích thước lớn, dẫn máu rốn chảy theo trọng lực Dung dịch chống đông nên sử dụng là CPD và CPDA vì đẳng trương và có pH trung tính

Tiền sử cá nhân và gia đình của người mẹ (và nếu có thể của cả đứa trẻ và bố đứa trẻ) cần được ghi chép rõ ràng trước khi thu gom hoặc trong vòng 48 giờ kể từ khi thu gom Đơn vị máu rốn sẽ không được sử dụng cho ghép đồng loại nếu tiền sử gia đình (mẹ, bố hoặc anh, chị, em) có bệnh di truyền Bắt buộc tiến hành định nhóm ABO/Rh của đơn vị máu dây rốn sau

Nguồn tế bào định hướng tạo máu từ máu dây rốn cũng được áp dụng rộng rãi, đặc biệt ở bệnh nhi, khi không tìm được người cho tuỷ hay máu ngoại vi phù hợp HLA [57] Xu hướng hiện tại của các nghiên cứu về tế bào tạo máu trong máu dây rốn tập trung vào các vấn đề:

1 Tính an toàn và hiệu quả của ghép tế bào từ máu dây rốn,

2 Khả năng sử dụng cho ghép ở người lớn,

3 Mở rộng phạm vi ghép không hoà hợp HLA nhưng vẫn duy trì tính an toàn và hiệu quả mọc ghép

1.3.4 Ứng dụng và lựa chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu

Hiệu quả mong muốn chủ yếu của ghép tế bào gốc tạo máu là (1) hồi phục số lượng tế bào tạo máu để rút ngắn thời gian suy tủy do quá trình điều kiện hóa (diệt tủy hoặc không diệt tủy) trước ghép và (2) hồi phục chất lượng tạo máu dựa vào khả năng tăng sinh, biệt hóa của các tế bào gốc mới

được ghép vào

Với mục tiêu hồi phục số lượng tế bào tạo máu, mô hình ghép tự thân

và sử dụng các chế phẩm tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi sau huy động là phù hợp, hiệu quả và an toàn Kết quả hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy thời gian mọc ghép dòng bạch cầu hạt đạt rất nhanh, thường sau 10-14 ngày Tuy nhiên, loại chế phẩm này chỉ mang lại hiệu quả điều trị đáng kể khi tiến hành cho những bệnh lý không hoặc ít tổn thương tủy tạo máu: các bệnh tự miễn, đa u tủy xương hoặc một số thể u lympho, Hodgkin

Để phục hồi chất lượng tạo máu, nhất là trong những bệnh lý có bất thường tế bào gốc tạo máu: lơxêmi, rối loạn sinh tủy nguyên phát, các bệnh