đặc điểm của niệu bào đồ trong các giai đoạn phát triển của trẻ em

Các nghiên cứu của Lencioni cũng kết luận có liên quan chặt chẽ giữa các tế bào biểu mô trong nước tiểu và phiến ñồ âm ñạo trong ñáp ứng tế bào hormon và gọi tên của phương pháp tế bào n

                

HỒNG THI THỦY YÊN

ðẶC ðIỂM CỦA NIỆU BÀO ðỒ TRONG CÁC GIAI ðOẠN PHÁT TRIỂN

CỦA TRẺ EM

CHUYÊN ðỀ TIẾN SĨ

Chuyên ngành : NHI KHOA

Mã số : 3.01.43

Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN VĂN HỢP

ðề tài nghiên cứu : Nghiên cứu các giá trị của niệu bào đồ trong chẩn đốn

và theo dõi tiến trình dậy thì của trẻ gái

2.1 Nguồn gốc phôi thai học của tế bào biểu mô tam giác bàng quang

và tử cung - âm ñạo: Error! Bookmark not defined

2.1.1 Nguồn gốc phôi học của biểu mô tam giác bàng quang: Error!

Bookmark not defined

2.2 ðặc ñiểm tế bào học tam giác bàng quang Error! Bookmark not

defined

2.2.1 ðặc ñiểm biểu mô bàng quang Error! Bookmark not defined 2.2.2 Biểu mô “ dạng ñảo nhú” của tam giác bàng quangError! Bookmark not defined

2.3 ðặc ñiểm tế bào cặn nước tiểu Error! Bookmark not defined

2.3.1 Các tế bào tam giác bàng quang Error! Bookmark not defined 2.3.2 Các tế bào nhầy: Error! Bookmark not defined 2.3.3 Bạch cầu: Error! Bookmark not defined 2.3.4 Hồng cầu Error! Bookmark not defined 2.3.5.Các tinh thể Error! Bookmark not defined 2.3.6 Các tế bào ngoài tam giác bàng quang: Error! Bookmark not defined 2.3.7 Amibes, trichomonas, và các ký sinh trùng khácError! Bookmark not defined

2.4 Các ñặc ñiểm chung của quá trình bong tế bào Error! Bookmark

not defined

3 KÝ THUẬT THỰC HIỆN VÀ TIÊU CHUẨN ðÁNH GIÁ CÁC KẾT QUẢ NIỆU BÀO ðỒ Error! Bookmark not defined 3.1.Nguyên tắc kỹ thuật Error! Bookmark not defined

3.1.1.Kỹ thuật phân tách tế bào trong nước tiểuError! Bookmark not defined

3.1.2 Rửa bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 3.1.3 Kỹ thuật cố ñịnh và làm khô tiêu bản Error! Bookmark not defined 3.1.4 Kỹ thuật nhuộm màu Error! Bookmark not defined 3.1.5 Sơ lược giới thiệu về tiến triển của kỹ thuật nhuộm niệu bào ñồ

Error! Bookmark not defined

3.2 Các nghiên cứu ñánh giá thuốc nhuộm màu: Error! Bookmark not

defined

3.3 Các phương pháp khác Error! Bookmark not defined

3.3.1 Một số ñiểm lưu ý trong kỹ thuật niệu bào ñồError! Bookmark not defined

3.3.2 Mẫu nước tiểu nghèo tế bào : Error! Bookmark not defined

3.5 Tiêu chuẩn ñánh giá các kết quả niệu bào ñồ Error! Bookmark not

defined

3.5.1 Chỉ số về chất lượng: Error! Bookmark not defined 3.5.2 Chỉ số trưởng thành ( Index de maturation - IM)Error! Bookmark not defined

3.5.3 Chỉ số estrogen ( Index estrogenique - IE)Error! Bookmark not defined

3.5.4 Chỉ số nhân (Index karyopycnotique-IK)Error! Bookmark not defined

4 ðẶC ðIỂM NIỆU BÀO ðỒ TRONG CÁC GIAI ðOẠN PHÁT

TRIỂN CỦA TRẺ EM Error! Bookmark not defined 4.1 Niệu bào ñồ giai ñoạn sơ sinh Error! Bookmark not defined 4.2 Niệu bào ñồ trong giai ñoạn tiền dậy thì Error! Bookmark not

defined

4.2.1 Niệu bào ñồ của trẻ tiền dậy thì Error! Bookmark not defined

4.3 Niệu bào ñồ ñược quan sát ở trẻ dậy thì Error! Bookmark not

I.ðẶT VẤN ðỀ

Giới nữ, c c hormon sinh dục cĩ nồng độ giao động theo c c thời kỳ của

cuộc đời và đặc biệt là trong chu kỳ kinh nguyệt.Cá giao động của hormon

được biểu hiện bằng c c thay đổi tế bào khơng chỉ ở c c biểu mơ cĩ l ên quan đến bộ máy tết niệu – sinh dục,mà cả ở c c tổ chức mơ.Từ năm 1917,Stockard và Papanicolaou đã mơ tả c c thay đổi theo chu kỳ của tế bào ở âm

đạo chuột, và c c động vật khá như mèo cái, bị sữa…với c c đặc điểm và

cơ chế hormon riêng biệt cho từng lồi Cá nghiên cứu sau đĩ của Papanicolaous về c c biến đổi tế bào nội mạc tử cung theo chu kỳ của phụ

nữ Cá nghiên cứu này đã tạo ra phương pháp phiến đồ âm đạo ( colpocytogramme) Từ đĩ, c c nghiên cứu khá nhau ở nhiều quốc gia cho phép hồn thiện kỹ thuật nhuộm phiến đồ âm đạo, giá trị của phương pháp này trong c c trường hợp bình thường và bệnh lý Cá nghiên cứu của Papanicolaou và Shor đã tạo ra nền tảng cho phương pháp thăm dị tế bào

hiện đại [13],[14]

Tuy nhiên, hoạt động của các hormon sinh dục cịn gây ảnh hưởng đến các tế bào biểu mơ của các tổ chức khác như niêm mạc miệng (Ziskin và Moulton-1948, Vincze, Talf và Liscio - 1959), mơi bé (Del Castillo và Videla-1965), trực tràng ( Arcangeli và Bonofiglio-1963), đặc biệt là trong lắng cặn của nước tiểu

Các nghiên cứu đầu tiên về tế bào trong nước tiểu thuộc về các tác giả người Argentine Biot và Beltran Nunez là những người đầu tiên đã cơng bố nghiên cứu “ Các biến đổi tế bào trong lắng cặn của nước tiểu liên quan đến chu kỳ kinh nguyệt” khả năng áp dụng như là test chẩn đốn rụng trứng”

năm 1944 Các tác giả lấy nước tiểu buổi sáng, sau khi quay ly tâm và nhuộm tế bào bằng Iod ñể dễ ñếm, ñã quan sát thấy ở phụ nữ giai ñoạn trưởng thành sinh dục có sự bong tế bào phong phú liên quan ñến giai ñoạn rụng trứng Trái lại ở giới nam, và giới nữ giai ñoạn mãn kinh không có hiện tượng trên Những năm sau ñó, Biot và Beltran ñã nêu các giá trị về phương diện lâm sàng của các nghiên cứu về biến ñổi tế bào nước tiểu Các tác giả

ñã phát triển kỹ thuật nhuộm tế bào từ kỹ thuật Shorr trong nhuộm phiến ñồ

âm ñạo Áp dụng kỹ thuật nhuộm màu chuyên biệt này cho phép quan sát ñược hình thái các tế bào và phản ứng bào tương giống như trong phiến ñồ

âm ñạo Các tác giả ñã khẳng ñịnh trong nghiên cứu công bố “ Các thay ñổi quan sát trong tế bào cặn lắng nước tiểu tương ñồng với các thay ñổi tế bào trong phiến ñồ âm ñạo ñược thực hiện cùng lúc trên cùng các bệnh nhân” [27]

Các nghiên cứu của Lencioni cũng kết luận có liên quan chặt chẽ giữa các tế bào biểu mô trong nước tiểu và phiến ñồ âm ñạo trong ñáp ứng tế bào hormon và gọi tên của phương pháp tế bào này là niệu bào ñồ (urocytogramme) Niệu bào ñồ là tiến trình thăm dò hoạt ñộng hormon sinh dục nữ, ñánh giá quá trình ngấm estrogen, trưởng thành của biểu mô tam giác bàng quang - âm ñạo qua các tế bào bong ra trong nước tiểu

Các tế bào trong lắng cặn nước tiểu chủ yếu từ sự bong ra của biểu mô malpigi ở thành sau của vùng tam giác bàng quang Âm ñạo và tam giác bàng quang là các tổ chức có cùng nguồn gốc phôi thai học

Chính vì những vấn ñề trên, trong chuyên ñề này chúng tôi tập hợp lại một cách có hệ thống những các ñặc ñiểm phôi thai học và tế bào học liên quan ñến niệu bào ñồ, giới thiệu hình ảnh của niệu bào ñồ từ giai ñoạn sơ

sinh ñến thời kỳ dậy thì, cũng như kỹ thuật xét nghiệm niệu bào ñồ, các ứng dụng của xét nghiệm tế bào này trong lĩnh vực Nội tiết Nhi khoa.

II ðẶC ðIỂM TẾ BÀO HỌC CỦA NIỆU BÀO ðỒ

Các tế bào trong lắng cặn nước tiểu chủ yếu có nguồn gốc từ bàng quang, tam giác bàng quang và niệu quản Niêm mạc bàng quang, niệu quản

hệ thống tiết niệu ñược bao phủ bởi lớp tế bào biểu mô ñặc hiệu gọi là biểu

mô trung gian ñã ñược mô tả từ lâu Các nghiên cứu thực nghiệm ñã xác ñịnh ñược mối liên quan giữa hoạt ñộng của hormon sinh dục và biểu mô của tam giác bàng quang ở phụ nữ Estrogen hoạt ñộng kích thích thay ñổi hình thái các tế bào biểu mô tam giác bàng quang, làm xuất hiện trong nước tiểu các tế bào keratin hóa, có bào tương giàu glycogen Các tế bào này khác biệt rõ ràng với các tế bào biểu mô type transitionel bao phủ toàn bộ phần còn lại của hệ thống tiết niệu Raynaud (1962) ñã gọi chúng là “ các tế bào tiết niệu nhạy cảm với estrogen ” Hình thái học của chúng tương tự như các

tế bào niêm mạc âm ñạo Chúng ta sẽ nghiên cứu nguồn gốc phôi thai học, tế bào học của vùng tam giác bàng quang

2.1 Nguồn gốc phôi thai học của tế bào biểu mô tam giác bàng quang

và tử cung - âm ñạo

2.1.1 Nguồn gốc phôi học của biểu mô tam giác bàng quang

Ở phôi người vào ngày phát triển thứ 30, phần tận cùng của ruột sau ñược dãn rộng tạo thành một bóng rỗng ñược giới hạn bởi các tế bào nội bì (endoblaste) Khoang rỗng phủ bởi các tế bào nội bì (endoblaste ) này là ngã

ba của hệ tiêu hóa và tiết niệu, tạo thành ổ nhớp Vào tuần thứ năm, một

vách ngăn gọi là cựa niệu nang, sẽ tiến dần xuống dưới ñể gắn liền với màng nhớp, chia ổ nhớp ra 2 phần: phần sau là ống hậu môn – trực tràng, phần trước là xoang niệu sinh dục Trong khi tiến xuống phía dưới, cựa niệu nang

ñi qua phía sau ñoạn nối của ống Wolff với các túi niệu quản Ống Wolff - phát sinh từ trung bì trung gian bởi vậy có nguồn gốc trung bì, nối vào xoang niệu – sinh dục

Trong quá trình phát triển sau ñó, tư thế của ống Wolff thay ñổi tùy thuộc vào tiến triển của vị trí sát nhập của nó vào thành xoang niệu – sinh dục Khi phôi phát triển chiều dài ñến 15mm, các ống Wolff và niệu quản

ñổ vào bàng quang ở các vị trí cách xa nhau Sau ñó, như sơ ñồ, các ống Wolff sát nhập vào ñoạn trên của niệu quản Tiến triển sau ñó của xoang niệu- sinh dục phụ thuộc theo ñặc ñiểm giới tính nam hay nữ

Do các ống Wolff và niệu quản có nguồn gốc trung bì, nên bàng quang không ñược bao phủ hoàn toàn bởi lá nội bì Phần bàng quang ñược giới hạn giữa 2 lổ niệu quản và lổ niệu ñạo có nguồn gốc trung bì, tạo thành một hình tam giác, gọi là tam giác bàng quang [1],[6], [12]

2.1.2 Nguồn gốc phôi học của biểu mô tử cung– âm ñạo:

Ở giai ñoạn phát triển trung tính ( chưa biệt hóa giới tính ), phôi thai của 2 giới ngoài ống Wolff ( ñã trình bày ở trên) còn có 2 ống Muller cũng ñựoc tạo ra từ lá trung bì Trong giai ñọan phát triển của bào thai nữ, những ñoạn dưới của hai ống Muller sát nhập với nhau ở ñường giữa, tạo thành ống

tử cung – âm ñạo

Ở ñoạn trên ống tử cung âm ñạo, vách ngăn hai ống Muller ñã sát nhập nhau bị tiêu ñi và ñoạn này tạo ra thân - eo tử cung Ở ñoạn dưới của ống tử cung âm ñạo, hai thành biểu mô của hai ñoạn ống Muller sát nhập với

nhau tạo ra lá biểu mô âm ñạo ðoạn trên lá biểu mô âm ñạo tạo ra một phần

cổ tử cung, còn ñoạn dưới tạo ra ñoạn trên của âm ñạo Chung quanh ñoạn trên của lá biểu mô âm ñạo xuất hiện chỗ lồi vây quanh cổ tử cung Sự tiêu

ñi của biểu mô ở chỗ lồi ấy tạo ra túi cùng âm ñạo

ðoạn dưới âm ñạo -nối vào thành sau của xoang niệu sinh dục, ñược bao phủ bởi biểu mô của xoang niệu sinh dục có nguồn gốc nội bì Như vậy biểu mô âm ñạo có 2 nguồn gốc: khoảng 4/5 trên biểu mô âm ñạo có nguồn gốc từ củ Muller từ lá trung bì, còn biểu mô của ñoạn 1/5 dưới của âm ñạo phát sinh từ xoang niệu – sinh dục có nguồn gốc nội bì Như vậy ở người nữ, tam giác bàng quang, tử cung, túi cùng 2 bên - là nơi lấy bệnh phẩm chủ yếu khi làm phiến ñồ âm ñạo và phần trên âm ñạo có cùng nguồn gốc lá trung

2.2 ðặc ñiểm tế bào học tam giác bàng quang

2.2.1 ðặc ñiểm biểu mô bàng quang

Biểu mô bàng quang ñược xếp vào nhóm biểu mô trung gian (biểu mô

lát giả tầng) Biểu mô bàng quang có thể thay ñổi hình dạng theo mức ñộ co

thắt hay dãn nở của bàng quang Lớp biểu mô này có thể chia làm 3 lớp tế bào từ màng ñáy cho ñến bề mặt Lớp tế bào ñáy nằm trên mô liên kết có khả năng co dãn, có cấu tạo như một màng ñáy thực sự, tiếp ñến là lớp tế bào trung gian có ñộ dày khác nhau tùy theo mức ñộ ñầy hay rỗng của bàng

quang Trên cùng, là lớp tế bào bề mặt có kích thước lớn, thường có 2 nhân, ñôi khi có ña nhân, có hình dạng như chiếc ô, khác hẳn tế bào lớp dưới Lớp

tế bào bề mặt tạo ra hàng rào thẩm thấu ngăn cách nước tiểu và dịch mô Chúng tạo ra một lớp màng ñặc biệt ñược cấu tạo bởi các phó ñơn vị hình lục giác ñường kính 150 A0 , làm cho biểu mô bàng quang có ñặc tính thấm ñặc biệt Hơn nữa, màng này kết hợp cùng với thể Golgi và có ñặc tính hóa học ñặc biệt ( thành phần chính của cầu nối lipide là cerebroside) [1],[12]

2.2.2 Biểu mô “ dạng ñảo nhú” của tam giác bàng quang

Cifuentes (1947) [18] là người ñầu tiên ñã chống lại quan ñiểm cho rằng hệ tiết niệu ñược bao phủ toàn bộ bởi cùng tế bào biểu mô tiết niệu Khi

quan sát nội soi, ông ñã mô tả những vùng ñặc biệt màu trắng sữa Các ñảo

nhú này khác biệt rõ rệt với các phần còn lại của biểu mô tiết niệu Chúng khư trú dưới dạng các tiểu ñảo lan tỏa trong tam giác bàng quang, ñược tạo thành bởi lớp biểu mô lát tầng và rất biến ñổi một cách rất nhạy cảm dưới tác dụng kích thích nội tiết Các tiểu ñảo này có nguồn gốc từ một biến dạng

dị hóa khư trú dưới tác dụng của estrogen Bur (1957) nhận ñịnh rằng các tiểu ñảo dạng lát trong tam giác bàng quang như lớp phủ âm ñạo là vết tích của “ những cuộc tranh chấp biểu mô” trong thời kỳ phôi thai

2.3 ðặc ñiểm tế bào cặn nước tiểu

Niêm mạc biểu mô hệ tiết niệu có ñặc ñiểm bong dần ra trong nước tiểu Nước tiểu bình thường không có vi khuẩn hay hồng cầu, các tế bào

viêm, chỉ có một ít bạch cầu [12]

Các thành phần tế bào chủ yếu hiện diện trong cặn nước tiểu có thể ñược phân loại theo mức ñộ quan trọng như sau:

+ Có rất nhiều tế bào biểu mô bong ra từ tam giác bàng quang

+ Tế bào nhầy

+ Bạch cầu

+ Các cặn tinh thể

+ Các tế bào của bàng quang và niệu quản

+ Các vi sinh vật như amibes, trichomonas, và các ký sinh trùng khác

2.3.1 Các tế bào tam giác bàng quang

Các tế bào biểu mô của các tiểu ñảo của biểu mô lát tầng, rải rác từ vùng trung tâm tam giác bàng quang cho ñến niệu quản, có các ñặc tính giống như tế bào biểu mô ở âm ñạo, và ñược tận dụng ñể làm niệu bào ñồ Chúng gồm có 4 dạng tế bào:

tế bào ñáy, có bào tương ưa base, tỷ lệ nhân/ bào tương nhỏ hơn tế bào ñáy + Các tế bào trung gian, xuất phát từ lớp trung gian của biểu mô malpighi, ñặc trưng bởi bào tương ưa base nhẹ và nhân có kích thước nhỏ hơn rõ rệt so với tế bào ñáy và cận ñáy

+ Các tế bào bề mặt là các tế bào malpighi kích thước lớn, ña diện, có bào tương ưa eosine và nhân ñông tụ ( là những tế bào ở lớp trên cùng ) hoặc nhân có kích thước rất nhỏ ( các tế bào ở lớp sâu hơn )

Các tế bào này bong ra trong nước tiểu, các ñặc ñiểm hình dạng ñược nhận diện dựa vào các ñặc ñiểm sau:

Màu sắc của bào tương khi nhuộm màu: khi nhuộm các tế bào có bào tương

bắt màu ñỏ nhạt, người ta gọi chúng là các tế bào ưa eosine (eosinophile), khi bào tương bắt màu màu xanh dương là các tế bào ưa base ( cyanophile)

Hình dạng: Các tế bào có hình ña diện là tế bào bề mặt và trung gian, các tế

bào cận ñáy và tế bào ñáy có dạng thuôn dài hay hình tròn

Kích thước: Các tế bào bề mặt có kích thước lớn nhất, các tế bào trung gian

có kích thước trung bình, kích thước tế bào cận ñáy và tế bào ñáy nhỏ dần Kích thước các tế bào tam giác bàng quang trong cặn nước tiểu trong niệu bào ñồ tương ñương với các tế bào ở phiến ñồ âm ñạo [10], [12]

Bảng 1 Kích thước của các tế bào của niệu bào ñồ [27]

( So sánh với các tế bào của phiến ñồ âm ñạo)

S: Tế bào bề mặt ( Cellules superficielles)

I: Tế bào trung gian (Cellules intermediaires)

B: Tế bào ñáy ( Cellules basales)

ðặc ñiểm nhân tế bào: Nhân tế bào có dạng ñông tụ ( pycnotique) trong các

tế bào bề mặt ưa eosine, và dạng hình cầu trong các tế bào trong các tế bào

trung gian, trong các tế bào ñáy nhân tế bào to, tròn chiếm gần hết bào

tương Nhân dạng ñông tụ, bắt màu ñậm ñồng nhất, ñường kính nhỏ hơn 5 µ, rất dễ nhận thấy dưới kính hiển vi quang học Chỉ số tế bào bề mặt ưa eosine

có nhân ñông tụ có giá trị quan trọng ñể ñánh giá hoạt ñộng estrogen

Bảng 2 Phân loại và ñặc ñiểm của các tế bào niệu bào ñồ [27]

Trong niệu bào ñồ, các tế bào nhầy có thể quan sát thấy các thay ñổi

có tính chu kỳ ở các phụ nữ có kinh nguyệt Người ta cũng mô tả hiện tượng các tinh thể ñặc trưng cho lớp nhầy của ñường tiết niệu dưới hiệu quả hoạt ñộng của estrogen với sự khác nhau của hình ảnh tinh thể tương tự như của lớp nhầy âm ñạo

2.3.3 Bạch cầu

Các tế bào bạch cầu ít gặp trong niệu bào ñồ, chỉ khi có nhiễm trùng ñường tiểu hay ở trẻ gái tiền dậy thì Các tế bào bạch cầu hạt, nhân ña dạng nhiều thùy Các tế bào mủ không ñều, bờ không ñều không nét ðường kính

từ 8 - 12µ

2.3.6 Các tế bào ngoài tam giác bàng quang

+ Các tế bào bàng quang lớp ñáy có kích thước nhỏ, hình thuôn dài, các tế bào bề mặt gọi là các tế bào hình cây dù, kích thước lớn, thường có hai nhân hay nhiều nhân, chúng không có hiện tượng phân chia bề mặt với ñặc tính ưa eosine hay nhân ñông ñặc trưng của các biểu mô tầng nhạy cảm với sự kích thích hormon

+ Các tế bào niệu quản thường bong ra với với số lượng hạn chế

+ Các tế bào niệu ñạo luôn có dạng kích thước nhỏ

2.3.7 Amibes, trichomonas, và các ký sinh trùng khác

Rất hiêm khi quan sát thấy amibe trong cặn nước tiểu Y văn ghi nhận

có 2 trường hợp, có dạng hình tròn hay bầu dục, kích thước từ 15- 60µ lớn hơn các tế bào trung gian và tế bào ñáy, bào tương có tính cyanose yếu, các hạt bên trong có màu vàng cam, có thể có các hồng cầu ñang bị thực bào, có thể di ñộng

2.4 Các ựặc ựiểm chung của quá trình bong tế bào

Dưới tác ựộng của estrogen và progesteron các tiểu ựảo biểu mô lát tầng của tam giác bàng quang có một quá trình tăng sinh và biệt hóa, rồi bong tróc ra nước tiểu đặc tắnh bong tróc này là cơ sở của niệu bào ựồ, nhờ

ựó mà chúng ta mới phân tách ựược tế bào từ nước tiểu

Quá trình bong tế bào bao gồm tất cả các thành phần tế bào mà chúng tôi ựã mô tả ở trên (2.3.1), với số lượng nhất ựịnh có thể xác ựịnh các ựặc ựiểm số lượng và chất lượng của tế bào tùy theo phương cách ựánh giá

Có 2 phương cách:

- Tổng số toàn bộ các tế bào bong tróc

- Tỷ lệ phần trăm các thành phần tế bào ở các dạng khác nhau

đánh giá mức ựộ phong phú của tế bào bong ra là một trong những yếu tố quan trọng trong phương pháp chẩn ựoán tế bào Ờ hormon

Thời ựiểm mà buồng trứng hoạt ựộng thấp nhất ( giai ựoạn tiền dậy thì) mật ựộ tế bào rất nghèo nàn, ngược lại khi hoạt ựộng của estrogen bình thường hay tăng cao, tế bào bong ra rất phong phú

Phương cách bong tế bào : Hình ảnh tế bào có thể có liên hệ với phương thức bong tróc tế bào Các tế bào có thể ựơn lẻ, hay từng nhóm, từng ựám, từng mảng, tương tự hình ảnh của phiến ựồ âm ựạo dưới tác dụng của estrogen trong chu kỳ kinh nguyệt Hiện diện của các tế bào riêng lẻ là chỉ số của hoạt ựộng estrogen trong pha kắch thắch trứng của chu kỳ kinh hay trong khi ựiều trị estrogen Trái lại, hình ảnh tế bào tụ thành nhóm là hiện tượng sau rụng trứng Sau rụng trứng là thời kỳ loại bỏ tế bào, các tế bào bong ra từng ựám, từng mảng với số lượng nhiều và dễ nhận thấy nhất

3 KỸ THUẬT THỰC HIỆN VÀ TIÊU CHUẨN ðÁNH GIÁ CÁC KẾT

QUẢ NIỆU BÀO ðỒ

Niệu bào ñồ là quá trình thăm dò hoạt ñộng của hormon sinh dục trên

cơ sở ñánh giá số lượng và chất lượng các dạng tế bào khác nhau có trong cặn nước tiểu, ñược nhận diện bằng các thuốc nhuộm tế bào khác nhau Các

tế bào biểu mô này bong ra từ các tiểu ñảo biểu mô lát tầng của tam giác bàng quang - (Lencioni 1953) [27]

Do ñặc ñiểm các tế bào biểu mô tam giác bàng quang bong ra trong môi trường dịch lỏng ( nước tiểu) không có chất nào tạo thuận lợi cho sự kết dính tế bào, hơn nữa nước tiểu là môi trường rất dễ gây thối rửa, nên có rất nhiều vấn ñề về kỹ thuật ñể thực hiện niệu bào ñồ

Trong phần này chúng tôi sẽ trình bày một số kỹ thuật và phương pháp ñã ñược áp dụng với các lợi ñiểm và bất lợi cũng như phương pháp ñang sử dụng hiện nay

3.1.Nguyên tắc kỹ thuật [2],[7],[8], [13],[14],[19],[23],[24],[27],[30]

Các kỹ thuật niệu bào ñồ ñược phân tích theo các bước chuẩn bị như sau

- Kỹ thuật phân tách tế bào trong nước tiểu

- Rửa bệnh phẩm

- Kỹ thuật cố ñịnh và làm khô

- Kỹ thuật nhuộm màu

3.1.1.Kỹ thuật phân tách tế bào trong nước tiểu

ðể phân tách tế bào ñường dẫn tiểu từ trong môi trường dịch lỏng, người ta

ñã áp dụng các kỹ thuật sau

- Lọc nước tiểu

- Ly tâm nước tiểu

- Làm khô nước tiểu

- Kỹ thuật hút

- Sử dụng phin lọc “ Millipore ”

3.1.1.1 Kỹ thuật lọc nước tiểu

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc lọc nước tiểu bằng giấy lọc lót trong một ñáy phễu Các chất giữ lại trên giấy lọc sẽ ñược lấy ra và phết lên lam kính Phương pháp này ñược Del Castillo, Argonz và Galli Mainini áp dụng ( 1946-1948), chỉ có giá trị khi có hoạt ñộng kích thích của estrogen, trong các trường hợp thiếu estrogen tế bào thu nhận ñược rất ít Hơn nữa, các sợi xơ của giấy lọc, các chất nhầy, các chất tinh thể lắng ñọng trong nước tiểu thường gây khó khăn khi ñọc tiêu bản

3.1.1.2 Kỹ thuật ly tâm

ða số các nhà nghiên cứu sử dụng phương pháp này Ly tâm nước tiểu giúp phân tách và thu giữ ñược số lượng lớn nhất các tế bào niệu Các tác giả ñã ly tâm nước tiểu với tốc ñộ từ 500-1500 vòng /phút trong 5-10 phút, và nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về số lượng và cấu trúc của các tế bào ly tâm Theo Lencioni, tốc ñộ ly tâm 800/1’ trong 5 phút với ống

3.1.1.4 Kỹ thuật hút

Galli và Abinzano ( 1956) đã dùng ống thủy tinh cĩ đầu nối với một sonde mềm, đầu kia gắn vào một bơm tiêm Người ta gắn đầu sonde với một bấc cotton và nhúng ống sonde vào tận đáy bình chứa nước tiểu Dùng bơm tiêm hút 5- 10cm3 nước tiểu đủ để tách được số lượng tế bào cần thiết

ðể dựng lam tế bào, phải làm khơ bấc cotton và phết đầu bấc vào lam kính nhiều lần

3.1.1.5 Sử dụng phin lọc “ Millipore ”

Dựa trên kỹ thuật phân tách tế bào ung thư từ mơi trường dịch lỏng bằng cách dùng hệ thống hút qua màng , Rosemblatt, Baechler và Volet ( 1967) đã áp dụng vào niệu bào đồ Kỹ thuật này dùng các phin lọc “ Millipore” cĩ đường kính tối đa 5µ, được nối với hệ thống hút khá phức tạp gổm cĩ bĩng cao su rỗng, bơm tiêm kim loại, và hệ thống su-pap để hút dịch Khi hút nước tiểu hay các dịch lỏng cơ quan khác qua lớp phin lọc các

tế bào được giữ lại để cố định và nhuộm màu.Von Haam ( 1961) và Meyer

đã dùng kỹ thuật này nghiên cứu niệu bào đồ cho 100 phụ nũ bình thường và

100 phụ nữ sẩy thai cho kết quả xuất sắc

Eckert và Patterson ( 1963) đã so sánh phương pháp ly tâm với phương pháp dùng phin “ Millipore” cho kết quả tương đương nhau Hơn nữa, trong chẩn đốn tế bào hormon, phương pháp này quá đắt và tiến hành lâu, cần cĩ e-kip đặc biệt, dựng lam tế bào khĩ khăn hơn khi dùng phương pháp ly tâm Cuối cùng khi hút dịch qua lớp lọc sẽ làm tan rã các tế bào cần cho chẩn đốn tế bào –hormon ( Haour, Conti-1970 ; O’Morchoe -1970)

Do vậy kỹ thuật này được dành cho chẩn đốn tế bào của ung thư trong mơi trường dịch cơ thể

3.1.3 Kỹ thuật cố định và làm khơ tiêu bản

Các tế bào sau khi đã được phân tách khỏi nước tiểu sẽ được dàn đều trên lam kính Người ta cĩ thể sử dụng 2 kỹ thuật sau:

- Hoặc cố định bằng alcool-éther

- Hoặc làm khơ tiêu bản một cách tự nhiên trong khơng khí

3.1.3.1 Cố định tiêu bản

Tiêu bản được cố định ngay lập tức bằng hỗn hợp acool – esther với

tỷ lệ ngang nhau Chất cố định phải bao phủ hồn tồn bệnh phẩm Nếu cố định muộn, khi nhuộm màu với kỹ thuật Shorr cĩ thể làm biến đổi tính chất

ưa eosine của bào tương và mất đi các lợi điểm để phân biệt (differenciation tinctoriale) trong chẩn đốn hormon Các tiêu bản cần phải nhúng trong dung dịch cố định ít nhất 5 phút trước khi nhuộm

3.1.3.2 Làm khơ tiêu bản

Thay vì nhúng tiêu bản vào dung dịch cố định, người ta cĩ thể làm khơ nĩ một cách tự nhiên trong khơng khí Với phương pháp này, trên lam kính sẽ tạo thành một lớp tế bào kết dính tốt , và tránh làm hao hụt tế bào khi nhúng lam vào dung dịch cố định Cuối cùng, để ngăn ngừa hiện tượng các

tế bào ngả màu vàng cam, trước khi nhuộm cần phải xử trí tiêu bản theo phương pháp đặc biệt : nhúng nhanh qua nước, tiếp đĩ nhúng qua alcool 300

và 700 với 2% axit acetic

3.1.4 Kỹ thuật nhuộm màu

3.1.4.1 Kỹ thuật nhuộm màu Shorr

Thuốc nhuộm Shorr được chọn lựa sử dụng trong kỹ thuật nhuộm màu niệu bào đồ Lencioni đã thực hiện hơn 30 000 tiêu bản trong 20 năm Với kỹ thuật này, các tế bào ưa eosine bắt màu đỏ, các tế bào ưa kiềm (cyanophile) cĩ màu xanh da trời pha lẫn màu xanh lá cây nhạt Cĩ thể phân biệt dễ dàng hồng cầu và bạch cầu, các cấu trúc bào tương và hạt nhân nổi bật rõ Bào tương được nhuộm bởi chất Orange G và Fast Green, cịn hạt nhân được nhuộm bởi Biebrich ecarlate Ngồi ra cịn cĩ các axit phosphotungstic và phosphomolybdic

3.1.4.2 Kỹ thuật Papanicoulaou

Kỹ thuật Papanicoulaou cĩ thể dùng được trong niệu bào đồ, tuy nhiên nĩ cĩ giá trị đặc biệt trong chẩn đốn ung thư cổ tử cung vì cho phép quan sát thấy tốt nhất các chi tiết của hạt nhân, bào tương mà các phương pháp khác khơng cĩ Trong kỹ thuật Papanicolaou hạt nhân được nhuộm bởi Hematoxylin de Harris và bào tương bắt màu của Orange G và Fast Green

ðối với niệu bào đồ, Shorr là thuốc nhuộm lý tưởng trong chẩn đốn tế hormon, chỉ cĩ thuốc nhuộm Shorr mới đánh giá được mức độ hoạt động của estrogen Trái lại, Papanicolaou cho phép thực hiện các nghiên cứu tế bào tin cậy nhất

bào-3.1.4.3 Kỹ thuật Hematoxyline de Harris

Hematoxyline de Harris là thuốc nhuộm được sử dụng trong phiến đồ

âm đạo, cho phép thấy được các chi tiết của hạt nhân Gonzales Ramos ( 1956) là người đầu tiên đã dùng kỹ thuật này trong niệu bào đồ Bổ sung thuốc nhuộm này là một bước tiến trong kỹ thuật niệu bào đồ, cho phép nâng cao một cách tốt nhất việc đánh giá chỉ số nhân đơng, yếu tố quan trọng trong niệu bào đồ

3.1.5 Sơ lược giới thiệu về tiến triển của kỹ thuật nhuộm niệu bào đồ 3.1.5.1 Phương pháp của de Del Castillo, Argonz và Galli Maini (1946- 1948) và Galli Mainini (1956)

Nhuộm với thuốc nhuộm Shorr trong 3 đến 4 phút Nhúng vào cồn 95

độ trong 2 phút Rửa trong cồn 100 độ trong 2 phút Cố định với xylol [30], [31], [36], [40], [49]

3.1.5.2 Kỹ thuật của Papanicolaou (1946)

Trộn 40 ml nước tiểu với một thể tích tương đương cồn 95 độ Sau đĩ quay li tâm và lấy cặn nước tiểu, sử dụng cồn để tránh làm biến chất nước tiểu.[13],[14], [19]

3.1.5.3 Kỹ thuật của MacCallin, Stewart, Taylot, Whintehead (1950)

Tương tự như kỹ thuật của Papanicolaou Mẫu nước tiểu ñược phủ bởi một lớp ovalbumine ñể ñạt ñược ñộ kết dính tốt nhất các tế bào trên mặt lam kính Nước tiểu ñược trộn theo tỷ lệ 1 :1 với cồn 95 ñộ, 2- 3 giờ sau ñược quay li tâm với tốc ñộ chậm, lấy mẫu cặn nước tiểu phết lên lam ñã phủ chất gắn ovalbumine Người ta cố ñịnh trong 15 phút với cồn ête, rồi nhuộm màu [13], [14], [19]

3.1.5.4 Kỹ thuật của Gonzalez Ramos (1956)

Nhuộm màu với thuốc nhuộm hematoxylin Harris trong 2 phút Rửa với nước ngọt 2 lần ðây là bước tiến lớn trong kỹ thuật nhuộm màu, nhờ sử dụng thuốc nhuộm hematoxylin và các chất cố ñịnh ñặc biệt, các nhân tế bào chưa bị teo ñặc có màu tím nhạt trái lại các nhân tế bào ñã teo ñặc tụ thành dạng chấm (pycnose) có cấu trúc ñồng nhất Các tế bào bề mặt ưa axit có màu hồng ñậm hay nhạt, các tế bào ưa kiềm có màu xanh da trời [13]

3.1.5.5 Phương pháp của Feo Codecido ( 1961)

Nhuộm màu với thuốc nhuộm hematoxylin của Papamiltiades trong 2 phút Nhuộm màu với thuốc nhuộm Shorr trong 1 phút Rửa với cồn isopropilique và axit acetique ðể khô tiêu bản và phủ một lớp chất cố ñịnh không màu

Phương pháp này ñược áp dụng thành công tại Ac-hen-ti- na ( 1963) [30], [31], [36], [40], [49]

3.1.5.6 Phương pháp của Lencioni ( 1967)

Lencioni ñã xây dựng phương pháp thực hiện niệu bào ñồ hết sức chi tiết và ñã thực hiện hơn 30 000 tiêu bản trong 20 năm [13] Các tác giả khác

ñã cải tiến một số phương cách khác dựa trên phương pháp này

Gồm các bước sau:

- Lấy nước tiểu ñầu tiên vào buổi sáng, theo tác giả có giàu tế bào nhất, cần phải sử dụng trong vòng 5 giờ sau khi ñi tiểu Tuy nhiên nhiều tác giả sử dụng nước tiểu trong ngày và nhận thấy lượng tế bào thu ñược phụ thuộc vào vấn ñề kỹ thuật hơn là thời ñiểm lấy nước tiểu

Cho nước tiểu vào ống ly tâm trong 5 phút tốc ñộ 800 vòng/1’

- ðổ phần váng nước tiểu ở trên bề mặt và úp ngược ống ly tâm cho ñến khi phần cặn lắng hết nhỏ giọt

- Thêm vào ống dung dịch Ringer lactate hòa loãng 50% với nước tinh khiết, lắng nhẹ cho ñến khi cặn lắng tan ñều trong dung dịch Ringer

- Quay ly tâm lần nữa như bước ñầu tiên

- ðổ bỏ phần dịch ở trên và úp ngược ống cho ñến khi phần lắng cặn hết nhỏ giọt

- Nhỏ 3 giọt dung dịch Rinhger vào ống, lắc nhẹ cho ñến khi phần cặn tan ñều

- Úp ngược ống ly tâm và cho dịch nhỏ giọt theo thành ống xuống lam kính Dàn ñều tiêu bản về phía trung tâm lam kính Có thể dùng pipette Pasteur ñể lấy hết cặn dưới ñáy ống

- ðể tiêu bản khô tự nhiên theo nhiệt ñộ không khí

- Nhúng lại tiêu bản vào nước sạch trong 10 phút, thao tác này cần thực hiện nhẹ nhàng ñể tế bào không bong ra

Những nơi có ñộ ẩm cao, không cần làm khô tiêu bản hoàn toàn và có thể

bỏ qua công ñoạn nhúng nước tiêu bản

- Nhúng tiêu bản vào Hematoxyline de Harris trong 10 phút

- Rửa nhẹ nhàng tiêu bản liên tiếp trong 2 bình nước sạch khác nhau

- Nhúng tiêu bản vào dung dịch acool tuyệt ñối ammonium trong nửa phút

- Rửa tiêu bản liên tiếp trong 2 bình nước khác nhau

- Nhúng tiêu bản vào alcool 30o với 2% axit acetic trong 2 phút

- Nhúng tiếp tiêu bản vào alcool 70o với 2% axit acetic

- Phủ dung dịch nhuộm Shorr trong 4 phút

Thời gian này có thể thay ñổi, và trước khi bắt ñầu sử dụng dung dịch Shorr mới cần có các thử nghiệm ñể xác ñinh thời gian tối ưu cho công ñoạn này, ñôi khi thời gian này có thể tăng gấp ñôi

- Rửa tiêu bản trong nước

- Rửa tiêu bản trong alcool 70o hay 90o

Nếu dùng xylol cần phải rửa lam trước bằng alcool tuyệt ñối

- ðể tiêu bản khô tự nhiên

3.1.7.7 Phương pháp của P Haour ( 1971)

Lấy 60 ml nước tiểu vào buổi sáng Bảo quản bằng cách cho nước tiểu vào chai sạch, ñổ vào 10 ml borate diphenyl thủy ngân, có thể giữ các tế bào niệu trong 1 tháng ở nhiệt ñộ thường

Quay li tâm nước tiểu tốc ñộ 2500 vòng / phút trong 5 phút Rửa cặn nước tiểu trong nước tinh khiết ñể loại bỏ các tế bào nhầy Phết cặn nước tiểu lên lam kính phủ một lớp ê-te hoà với cồn 90 ñộ theo tỷ 1/1[19]

3.1.5.8 Phương pháp nhuộm màu Harris-Shorr

ðược Lecionie chỉnh lý vào năm 1967 [27] và Haour và Conti [19], áp dụng tại Pháp từ năm 1971

Bệnh nhân tự lấy 60 ml nước tiểu, tốt nhất là nước tiểu vào buổi sáng giàu tế bào nhất bảo quản nước tiểu ñể tránh sự hư hại các tế bào bằng 3ml