Luận văn : NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) part 1 pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO

SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ

(PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005

SINH VIÊN THỰC HIỆN: TÔN BẢO LINH

Thành phố Hồ Chí Minh

2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO

SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ

(PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)

CN LƯU PHÚC LỢI

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều

kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp

giảng dạy trong suốt bốn năm qua

- TS Trần Thị Dung và CN Lưu Phúc Lợi đã tận tình hướng dẫn và động viên

trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- TS Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm

phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp HCM

- Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại

học Nông Lâm Tp.HCM

- Trung tâm phân tích môi trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

- Hai bạn Nguyễn Phú Dũng, Lê Thái Bảo Ngọc, chị Trương Bùi Nguyệt Hảo

cùng toàn thể lớp CNSH27 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện

và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tháng 08 năm 2005 Tôn Bảo Linh

TÓM TẮT

TÔN BẢO LINH, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 08/2005

“NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)”

Hội đồng hướng dẫn:

 TS Trần Thị Dung

 CN Lưu Phúc Lợi

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trung tâm phân tích thí

nghiệm Đại học Nông Lâm Tp HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro thuộc 3

giống Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng bắt nguồn từ chồi ban đầu nhiễm virus gây

bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV) Tiến hành tạo chồi dứa Cayenne in vitro sạch PMWaV từ chồi in vitro bị nhiễm virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng (ĐST) Nguồn chồi tái sinh theo phương pháp tạo cây sạch virus sẽ được kiểm chứng bằng kĩ thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu cho PMWaV Trên cơ sở tạo chồi sạch virus, tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy với 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu theo dõi như thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ

số nhân chồi; nghiên cứu sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST với các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ Bằng kĩ thuật RT – PCR, thực hiện kiểm tra PMWaV – 1 và PMWaV – 2 đối với 12 mẫu lá của chồi tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy

Những kết quả thu được:

1 Khả năng tái sinh của ĐST: thời gian và tỉ lệ tái sinh chủ yếu do kích thước mẫu cấy quyết định Mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm tái sinh trong vòng 14 – 15 ngày và tỉ lệ tái sinh vào khoảng 79,63%

3 Việc tạo cây sạch virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST hiệu quả hơn so với phương pháp đối chứng chỉ nuôi cấy ĐST Với phương pháp kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST, tỉ lệ cây sạch PMWaV -1 đạt 66,67% và PMWaV – 2 đạt 100%, trong khi chỉ nuôi cấy ĐST chồi tái sinh vẫn còn nhiễm PMWaV –

1

SUMMARY

TON BAO LINH, Nong Lam University Ho Chi Minh City August, 2005

“Study of producing in vitro free PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus)

Cayenne pineapple plants”

Two free – virus plant producing methods involving heat treatment followed by meristem culture and simply meristem culture were used to eliminate PMWaV-1 and

PMWaV-2 from in vitro PMWaV infected pineapple plants Three Smooth Cayenne

cultivars originated from China, Thailand and Lam Dong were used as culturing materials With the completely randomized design, factors that influenced on the regeneration and growth of propagated meristem tip, especially heat treatment at 370C in

30 days was also studied

The experiment result showed that meristem regeneration was mainly influenced

by the size of the excised tissue Meanwhile, the growth of the regenerative shoots were influenced by cultivar factors Heat treatment did not considerably influence on the regeneration and subsequent growth of propagated meristem All samples (3/3) without heat treatment were still infected with PMWaV-1 and one third of samples (3/9) with heat treatment showed negative infection results with PMWaV-1 Finally, all samples (12/12) had negative results when tested for PMWaV-2 with RT-PCR

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary vi

Mục lục vii

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình và sơ đồ xii

Danh sách các chữ viết tắt xiii PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3.Giới hạn của đề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1.Nguồn gốc của cây dứa 3

2.2 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa 3

2.2.1 Đặc điểm thực vật học 3

2.2.2.Sinh thái cây dứa 4

2.3.Phân loại 5

2.4.Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam 6

2.4.1.Các nhóm dứa chính 6

2.4.1.1 Nhóm Cayenne 6

2.4.1.2 Nhóm Queen 7

2.4.1.3 Nhóm Spanish 7

2.4.2 Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam 7

2.4.2.1 Dứa hoa Phú Thọ 7

2.4.2.2 Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) 8

2.4.2.3 Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phương là “khóm”) 8

2.4.2.4 Nhóm dứa Cayenne 8

2.5 Tình hình sản xuất và sản lượng dứa 9

2.5.1 Tình hình sản xuất và sản lượng dứa trên thế giới 9

2.5.2 Tình hình sản xuất và sản lượng dứa ở Việt Nam 9

2.5.2.1 Tình hình sản xuất 9

2.5.2.2 Sản lượng dứa 10

2.6 Tình hình sâu bệnh trên cây dứa 10

2.6.1 Các loại sâu hại dứa 10

2.6.2 Bệnh hại dứa và phòng trừ 11

2.6.2.1 Bệnh thối lõi và thối rễ 11

2.6.2.2 Bệnh thối mềm 11

2.6.2.3 Bệnh “luộc lá” 12

2.6.2.4 Tuyến trùng hại dứa 12

2.7.Bệnh héo do virus 13

2.8 Phương pháp tạo cây sạch virus 14

2.8.1 Sơ lược về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật 14

2.8.2 Cơ sở của các phương pháp tạo cây sạch virus 15

2.8.3 Các phương pháp tạo cây sạch virus 15

2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST 19

2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 20

2.8.3.5 Vi ghép 21

2.9 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cây do virus 21

2.9.1 Các phương pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học 21

2.9.1.1 Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học 21

2.9.1.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 21

2.9.1.3 Phương pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) 22

2.9.2 Phương pháp hiển vi quang học và vi điện tử 22

2.9.2.1 Quan sát bằng kính hiển vi quang học 22

2.9.2.2 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử 22

2.9.3 Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử 23

2.9.3.1 Cơ sở khoa học của các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử 23

2.9.3.2 Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 23

2.9.3.3 Phương pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) 23

2.9.3.4 Probe đánh dấu (Labelled probes) 24

2.10 Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) 24

2.10.1 Các nghiên cứu ngoài nước 24

2.10.2 Các nghiên cứu trong nước 26

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Nội dung 28

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

3.3 Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí

nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 28

3.3.1 Vật liệu 28

3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy 28

3.3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 28

3.3.1.3 Hóa chất 29

3.3.1.4 Phương pháp tiến hành 29

3.3.1.5 Phương pháp nghiên cứu 30

3.4 Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng 32

3.4.1 Vật liệu 32

3.4.2 Phương pháp tiến hành 32

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1.Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trường MS 35

4.1.1Thời gian tái sinh 35

4.1.2 Tỷ lệ tái sinh 36

4.1.3 Hệ số nhân chồi 36

4.2.Khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trưởng của cây tái sinh từ ĐST 38

4.2.1 Chiều cao chồi 38

4.2.2 Số lá 39

4.2.3 Số rễ 40