Luận văn : BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR part 7 ppt

Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green Trong thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 2 này, chúng tôi cũng giữ nguyên các thành phần phản ứng và mẫu sản phẩm 10 m

65

hóa học, vật lý như: thao tác kĩ thuật viên, ethidium bromide, tia UV, dòng điện…làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và khả năng ngoại nhiễm cao Mặc khác, việc đánh giá kết quả được thực hiện bằng mắt thường, vì vậy kết quả có thể không đồng nhất, kém thuyết phục Các yếu tố này có thể làm cho việc phân tích kết quả gặp khó khăn

Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green

Trong thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 2 này, chúng tôi cũng giữ nguyên các thành phần phản ứng và mẫu sản phẩm (10 mẫu) Các kết quả phản ứng được thể hiện trên đồ thị DNA quantification như sau:

- Kết quả thí nghiệm trên mẫu đối chứng với cặp mồi đặc hiệu p35S

Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng

Ghi chú:

Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2

phương pháp 2

Đối chứng +

Đối chứng -

27,62 N/A

+

- Đối chứng dương

Đối chứng âm

- Kết quả thí nghiệm trên mẫu sản phẩm:

Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm

Ghi chú:

Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc các mẫu thí nghiệm trong thí nghiệm 2

phương pháp 2

ngưỡng

Kết luận

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

- Bắp giống 1

- Bắp giống 2

- Bắp giống 3

- Bắp giống 4

- Bắp giống 5

- Bắp trái ăn tươi

- Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc

- Thức ăn gia súc 1

- Thức ăn gia súc 2

- Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B9 B10 B11

20,62 41,04 N/A 16,96 N/A 22,22 21,15 N/A 22,22 24,04

+ +

- +

- + +

- + +

67

Qua kết quả nhận được trên đây, chúng tôi rút ra một số nhận xét:

- Các mẫu dương tính có chu kỳ ngưỡng phát hiện khá chênh lệch (16,96-41,04) Một số mẫu có chu kỳ ngưỡng phát hiện khá thấp (mẫu B2, B6, B10, B11) Điều này có thể do sự hiện diện của promoter 35S trong các mẫu có

sự khác biệt do mẫu lấy từ các nguồn sản phẩm khác nhau

- Đường đồ thị các mẫu âm tính (B3, B5, B9) còn chưa rõ ràng, có chiều hướng đi lên Đặc biệt, các đường này không có sự khác biệt quá lớn đối với mẫu B11 Điều này cần phải được phân tích thêm

Bên cạnh đó, trong phương pháp 2, chúng tôi cũng đồng thời tiến hành phân tích đồ thị nhiệt độ nóng chảy (Melt curve analysis) Kết quả thể hiện trên đồ thị như sau:

Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng

Ghi chú:

Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm

Đối chứng dương Đối chứng âm

Bảng 4.7: Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu thí nghiệm

( O C )

Chiều cao của peak (-d(RFU)/dT) Đối chứng +

Đối chứng -

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B9 B10 B11

86,5

- 86,5 86,0

- 86,5

- 86,5 86,0

- 86,0 86,0

47,40

- 23,54

20,72

- 18,8

- 18,93 26,45

- 31,40 24,23

Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy:

- Đồ thị Melt curve của sản phẩm khuếch đại các mẫu dương tính đều xuất hiện peak ở nhiệt độ trùng với nhiệt độ nóng chảy của đối chứng dương (86-86,5oC)

- Độ cao các peak này đều xấp xỉ với độ cao của peak đối chứng dưong (47,40) Sự chênh lệch có thể do số lượng DNA khuếch đại sau cùng của mẫu thí nghiệm gây ra

- Sản phẩm khuếch đại của các mẫu âm tính không xuất hiện các peak nhiệt

độ nóng chảy

Như vậy, ta có thể rút ra một số kết luận như sau:

- Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại các mẫu dương tính là tương đương với đối chứng dương Nói cách khác, sản phẩm khuếch đại promoter 35S của chúng có cùng chiều dài và tương tự với đối chứng

- Các kết quả nhận được từ đồ thị Melt curve khớp với kết quả của đồ thị DNA quantification Điều này chứng tỏ kết quả của phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I là chính xác

69

- Mẫu B11 tuy có chu kỳ ngưỡng phát hiện khá thấp, nhưng kết quả phân tích trên đồ thị Melt curve cho thấy, đây là một sản phẩm đặc hiệu và có chất lượng tốt của phản ứng khuếch đại bằng PCR

- Đồng thời, các mẫu B3, B5 và B9 là các mẫu âm tính thật sự Đồ thị của các mẫu này (Hình 4.7) không có các đỉnh nhiệt độ nóng chảy đặc trưng cho sản phẩm khuếch đại vùng promoter 35S

- Các kết quả này cũng chứng tỏ mồi đặc hiệu và quy trình phản ứng PCR được thiết kế tại phòng thí nghiệm có chất lượng tốt, độ đặc hiệu cao Điều này cũng phù hợp với kết quả điện di sản phẩm PCR của phương pháp 1

Bảng 4.8: So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trong thí nghiệm 2

Phương pháp

Chỉ tiêu

Phương pháp 1 (PCR và điện di)

Phương pháp 2 (Real-Time PCR với SYBR Green I)

Công cụ Đơn giản, giá thành thấp Phức tạp, giá thành cao Khả năng phát triển thành

Trên đây là một số chỉ tiêu so sánh mà chúng tôi rút ra được từ 2 phương pháp của thí nghiệm 2 Chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:

- Phương pháp Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I cho phép phát hiện các trình tự DNA với độ nhạy cao và kết quả đáng tin cậy (tương đương phương pháp PCR truyền thống) Điều này rất cần thiết cho quá trình

sàng lọc các sản phẩm biến đổi gen Bên cạnh đó, phương pháp này còn có một số ưu điểm sau:

Thời gian thao tác ngắn hơn so với phương pháp 1 (3 giờ so với 5 giờ), số lượng thao tác ít hơn, các quá trình được tự động hóa cao (điều khiển trên máy vi tính), mức độ độc hại thấp (không tiếp xúc với ethidium bromide, tia UV) Điều này giảm thiểu tác động do các yếu tố khách quan bên ngoài, nâng cao độ tin cậy của kết quả

Nếu như các kết quả của phương pháp 1 được đánh giá bằng mắt thường qua ảnh chụp tia UV nên có thể không chính xác, các kết quả của phương pháp 2 được thể hiện bằng biểu đồ với số liệu cụ thể do máy tính thiết lập, rất phù hợp cho công tác lưu trữ và báo cáo

Phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát triển thành phương pháp định lượng DNA

- Về vấn đề giá thành và công cụ, ưu điểm của phương pháp 1 là tiết kiệm chi phí, chủ động trong thí nghiệm (không phụ thuộc bộ kit hóa chất), đã được ứng dụng rộng rãi và quen thuộc trong một thời gian khá lâu Đối với phương pháp 2, do mới xuất hiện gần đây, đồng thời do hệ thống máy móc cần sự đầu tư khá lớn nên phạm vi ứng dụng còn khá nhiều hạn chế Tuy nhiên, một số so sánh về giá thành cho thấy:

Hóa chất và thành phần phản ứng của phương pháp 2 cũng có thể hoàn toàn chủ động như phương pháp 1 truyền thống Các thành phần phản ứng đều có thể được chuẩn bị như bình thường và chỉ cần bổ sung thêm thuốc nhuộm SYBR Green I Theo cách này, giá thành 1 phản ứng Real-Time PCR chỉ còn hơn 20% so với giá 1 phản ứng PCR truyền thống

Giá thành 1 bộ kit là 300USD/100 phản ứng với 50 µl/1 phản ứng Mức giá này là không quá đắt so với phương pháp PCR truyền thống Như vậy, với các ưu điểm nêu trên, hiệu quả của phương pháp Real-Time PCR trong chuẩn đoán sản phẩm biến đổi gen là rất ưu thế so với phương pháp 1 truyền thống Đặc biệt, đối với quá trình sàng lọc các mẫu sản phẩm biến đổi gen vốn đòi hỏi cần thực hiện trên số lượng mẫu lớn, trong một thời gian ngắn, với các kết quả chính

71

xác, phù hợp cho việc báo cáo và lưu trữ, việc áp dụng phương pháp này là rất thuận lợi và hiệu quả

3 Thí nghiệm 3: Xác định phương pháp định lượng GMO

Trong thí nghiệm này, chúng tôi so sánh khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR bằng 2 loại hóa chất khác nhau: thuốc nhuộm SYBR Green I (Phương pháp 1) và mẫu dò Taqman có gắn chất phát quang FAM 490 (Phương pháp 2) Các kết quả thu nhận được trình bày bên dưới

Xây dựng đường chuẩn:

Đây là yếu tố quyết định đến kết quả định lượng p35S Trong cả hai thí nghiệm, chúng tôi cùng sử dụng các mẫu chuẩn 35S của công ty GeneScan để xây dựng đường chuẩn Kết quả như sau:

Trái: Phương pháp 1, Phải: Phương pháp 2 Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp

Ghi chú:

Bảng 4.9: Chu kỳ phát hiện mẫu chuẩn của 2 phương pháp

Chu kỳ phát hiện Mẫu chuẩn

SYBR Green I

Taqman

Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3

22,99 24,32 25,26

26,83 30,04 33,07 Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3

Mẫu chuẩn Mẫu chưa biết

Trên: Phương pháp 1 Dưới: Phương pháp 2 Hình 4.9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S

Ghi chú:

Thông số từ việc xây dựng đường chuẩn như sau:

Bảng 4.10: Các thông số xây dựng đường chuẩn Thí nghiệm định lượng

Thông số

Phương pháp 1 SYBR Green I

Phương pháp 2 Taqman

Hệ số tương quan (Correlation Coefficient)

Hiệu quả PCR (PCR Efficiency) (%)

0,995

527, 0

1,000 94,8

Trong phương pháp 1, chúng tôi còn tiến hành phân tích Melt curve Kết quả thu nhận như sau:

73

Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3

Hình 4.10: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phương pháp 1

Ghi chú:

Từ các kết quả trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:

- Hai phương pháp đều có khả năng xây dựng được một đường chuẩn có chất lượng tốt từ các mẫu chuẩn đã biết trước Điều này được chứng minh qua các thông số xây dựng đường chuẩn chúng tôi thu nhận được ở Bảng 4.10

- Tuy nhiên, phương pháp 2 (Real-time PCR với mẫu dò Taqman) có kết quả dựng đường chuẩn tốt hơn, thể hiện qua các thông số sau:

Hệ số tương quan của phương pháp 2 cao hơn phương pháp 1 (1,000 so với 0,995) (Bảng 4.10)

Hiệu quả PCR của phương pháp 2 nằm trong ngưỡng cho phép (90-120 %) Còn phương pháp 1 vượt ngưỡng, nguyên nhân của vấn đề này sẽ được phân tích sau

Ta biết các mẫu chuẩn có số lượng lý thuyết hơn kém nhau một khoảng nhất định (gấp 8 lần), như vậy, chu kỳ phát hiện cũng phải hơn kém nhau một khoảng tương ứng Các kết quả thu nhận được ở Bảng 4.9 cho thấy, chu kỳ phát hiện các mẫu chuẩn ở phương pháp 2 là rất tốt, hơn kém nhau một khoảng là 3 chu kỳ Điều này cũng được quan sát rõ trên đồ thị DNA quantification của phương pháp 2 (Hình 4.8) Trong khi đó, các thông số của phương pháp 1 thì không tốt bằng (hơn kém nhau khoảng 1 chu kỳ)

- Phân tích đồ thị Melt curve của phương pháp 1, ta thấy rằng bên cạnh các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu với nhiệt độ nóng chảy 86oC, còn có các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu

ở nhiệt độ 58-58,5oC Nguyên nhân là do hiện tượng primer-dimer (Tổng quan Tài Liệu, mục 8.1.1.1.) Điều này cũng dẫn đến hiệu quả PCR của phương pháp 1 đạt 527,0 % (vượt ngưỡng cho phép), là do bên cạnh sản phẩm đặc hiệu, quá trình còn tổng hợp cả sản phẩm không đặc hiệu do 2 mồi tự bắt cặp với nhau Đây là một khuyết điểm của phương pháp 1 ảnh hưởng đến kết quả định lượng do tín hiệu huỳng quang thu nhận từ thuốc nhuộm SYBR Green I là tín hiệu từ tất cả DNA mạch đôi trong mẫu kể cả sản phẩm khuếch đại đặc hiệu

và không đặc hiệu Còn ở phương pháp 2, do tín hiệu huỳnh quang chỉ thu nhận từ DNA khuếch đại đặc hiệu (mẫu dò đặc hiệu) nên hoàn toàn không xảy ra sự sai lệch ảnh hưởng đến kết quả định lượng

Đánh giá kết quả định lượng

Kết quả thu nhận được từ 2 phương pháp như sau Đơn vị tính ở đây được quy định là copy 1 copy tương ứng với số lượng 1 gen đích trong mẫu thí nghiệm

Bảng 4.11: Kết quả thu nhận từ 2 phương pháp trong thí nghiệm 3

Mẫu

1 copy

Chu kỳ phát hiện Kết quả thực tế (copy)

SYBR Green I Taqman

SYBR Green I Taqman

1

2

27.58 26.18

36,22 35,96

1,28 16,5

1,11 1,38 Nhận xét:

- Các kết quả thu nhận được cho thấy (Bảng 4.11), cả hai phương pháp đều có độ nhạy khá tốt, có khả năng phát hiện 1 copy gen đích trong mẫu Tuy nhiên, kết quả định lượng của phương pháp 1 có sự sai lệch lớn giữa hai lần lặp lại (1,28 copy và 16,5 copy) Điều này có thể do hiện tượng primer-dimer đã ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Nguyên nhân sự sai lệch này là do hàm lượng DNA khuông trong phản ứng định lượng quá thấp, dẫn đến số lượng mồi tự do, không tham gia phản ứng khuếch đại còn nhiều, vì vậy chúng có thể tự bắt cặp với nhau theo hiện tượng primer-dimer Do thuốc nhuộm SYBR Green I định lượng

75

Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3 Mẫu 1 copy 1 và 2

DNA bằng tín hiệu huỳnh quang từ DNA mạch đôi, không phân biệt đó là sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu, đã dẫn đến kết quả sai lệch như trên

Nhận xét về 2 phương pháp như sau:

Hình 4.11: Đồ thị Melt curve của phương pháp SYBR Green I ở thí nghiệm 3

Ghi chú:

- Cả hai phương pháp đều thể hiện khả năng định lượng DNA Chúng đều có khả năng xây dựng đường chuẩn có chất lượng, độ nhạy và độ chính xác cao

- Tuy nhiên, các kết quả định lượng thu nhận được từ phương pháp 2 có độ chính xác và lặp lại cao hơn phương pháp 1 Điều này là do độ đặc hiệu của hóa chất định lượng mang lại

- Khuyết điểm của phương pháp 1 chính là độ đặc hiệu của hóa chất định lượng (SYBR Green I) Nhìn trên Hình 4.11 ta thấy hầu như tất cả các sản phẩm khuếch đại của phương pháp 1 đều xảy ra hiện tượng primer-dimer Hiện tượng này sẽ ảnh hưởng đến lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra từ sản phẩm khuếch đại và có thể làm sai lệch kết quả thí nghiệm Như vậy, tuy hai phương pháp đều có khả năng định lượng, phương pháp 2 vẫn thể hiện độ đặc hiệu và độ lặp lại cao hơn qua các lần thí nghiệm khác nhau Vì vậy, chúng tôi đề nghị sử dụng phương pháp 2 (Real-Time PCR với mẫu dò Taqman) cho các thí nghiệm định lượng sản phẩm biến đổi gen

4 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR

Trong thí nghiệm này, mục tiêu của chúng tôi là đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR với mẫu dò Taqman Các kết quả thí nghiệm như sau:

Độ nhạy của phương pháp:

Mẫu thí nghiệm: mẫu 1 copy gen đích

Chuẩn 1 Chuẩn 2 Chuẩn 3 Chuẩn 4 Mẫu 1 copy 1và 2

Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy

Ghi chú :

Bảng 4.12: Kết quả định lượng mẫu 1 copy Mẫu pha loãng

1 copy

Chu kỳ phát hiện Kết quả thực tế

(copy) Lần 1

Lần 2

36,22 35,96

1,21 1,38

Nhận xét :

- Các kết quả định lượng ở Bảng 4.13 cho thấy không có sự sai khác đáng kể giữa kết quả định lượng thực tế với số lượng lý thuyết (1,25 copy so với 1 copy) Sự sai khác (0,21 và 0,38 copy) xảy ra có thể do thao tác của người thực hiện khi bơm hút mẫu

- Các kết quả định lượng của 2 lần lặp lại khác nhau cũng cho thấy không có sai khác đáng

kể Khác biệt này (0,17 copy) có thể cũng do nguyên nhân trên

Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy phương pháp Real-Time PCR có thể cho phép định lượng sự hiện diện của gen đích ở mức thấp nhất là 1 copy Điều này chứng tỏ độ nhạy của phương pháp là rất tốt

Độ chính xác của phương pháp

77

Bảng 4.13: Kết quả định lượng mẫu Bt 176 1%

Độ lặp lại

Chu kỳ phát hiện Kết quả định lượng

chuyển gen (%) Promoter

35S

Gen tham chiếu

Promoter 35S

Gen tham chiếu Lần 1

Lần 2

32,59 28,56

28,93 24,51

200

124

20300

12500

0,985 0,992

Nhận xét thí nghiệm định lượng mẫu bắp Bt 176 1%:

- Kết quả định lượng bắp chuyển gen Bt 176 1% (Bảng 4.14) khá tốt Các kết quả này có sự sai khác không đáng kể so với tỷ lệ phần trăm chuyển gen 1% của mẫu (sai lệch 0,015 % và 0,008 %) Sự sai lệch này là rất nhỏ và không đáng kể

- Kết quả định lượng của 2 lần lặp lại cũng có sự khác biệt không đáng kể (sai lệch 0,007 %) Sai lệch này rất thấp, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt

Như vậy, các kết quả ở thí nghiệm 4 đã chứng minh được độ nhạy và độ chính xác của phương pháp Real-Time PCR:

- Định lượng được 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm

- Xác định chính xác tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một mẫu biết trước qua các lần lặp lại khác nhau

Hiệu quả của phương pháp đặc biệt quan trọng trong định lượng sản phẩm biến đổi gen, do các quy định hiện nay về mức ngưỡng cho sự hiện diện thành phần biến đổi gen trong thực phẩm (đặc biệt tại châu Âu) là rất thấp Các mức ngưỡng được quy định hiện nay là 0,5 % và 0,9 % đòi hỏi phương pháp định lượng phải có kết quả hết sức chính xác Các kết quả thu nhận được đã chứng minh khả năng áp dụng của phương pháp Real-Time PCR trong định lượng sản phẩm biến đổi gen

5 Thí nghiệm 5: Ứng dụng phương pháp định lượng Real-Time PCR