Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay thành phần nước bằng thể tích của 2 cặp primer... Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút Các mẫu khác nhau nhưng
Trang 1Bảng 3.4: Qui trình phản ứng PCR
Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 đến 35
51 hoặc 46 30 giây
72 2 phút 15 giây
3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer
Multiplex PCR rất cần thiết trong nghiên cứu về microsatellite vì nó có thể nghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác nhau cùng một lúc Ngày nay với sự phát triển của các chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu cùng lúc những al có kích thước bằng nhau và được gắn các màu huỳnh quang khác nhau
Để phản ứng multiplex PCR cho kết quả tốt, tất cả các locus phản ánh đúng, chính xác thì các primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần nhau
Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay thành phần nước bằng thể tích của 2 cặp primer Do đó tổng thể tích cho 1 phản ứng
multiplex PCR là 22.2µl với thành phần phản ứng như sau:
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR
Thành phần Dung dịch gốc Thể tích sử dụng
PCR buffer
MgCl2
dNTP
Primer mix 1
Primer mix 2
Primer mix 4
DNA mẫu
10X 25mM 1.5mM 1pmol/µl 1pmol/µl 1pmol/µl 50ng/µl
2.0µl 1.8µl 4.0µl 4.0µl 4.0µl 4.0µl 2.0µl
Trang 2Taq polymerase 5U/µl 0.4µl
Chúng tôi áp dụng qui trình PCR trên cho phản ứng multiplex PCR với 3 primer mTcCIR8, mTcCIR11 và mTcCIR15có cùng nhiệt độ Ta = 46oC Ba primer này được đánh dấu bằng 3 màu huỳnh quang khác nhau: primer mTcCIR8 có màu xanh lá cây, mTcCIR11 có màu vàng và mTcCIR15 có màu đỏ
Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 đến 35
72 2 phút 15 giây
3.2.6 Điện di sản phẩm PCR
Đổ gel agarose với nồng độ 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong 2.5 phút, 500W Trộn 2 µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad) Vận hành máy điện
di ở 100V, 250A trong 15 phút Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút
Các mẫu khác nhau nhưng được khuếch đại bởi cùng loại primer có băng điện di rất giống nhau nên không thể phân biệt được trên gel điện di agarose, cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự DNA
3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được đưa vào phân tích trình tự qua 3 bước chính:
Bước 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard và hidi formamide
Tổng thể tích cho 1 phản ứng trên máy giải trình tự DNA là 10µl với thành phần phản ứng như sau:
Thành phần Thể tích dùng cho 1 phản ứng
Trang 3Size standard Hidi formamide
0.5µl 9µl
Bước 2: Biến tính mẫu ở 95oC trong 5 phút bằng máy PCR để DNA mạch đôi tách thành 2 mạch đơn Sau đó phải giữ lạnh mẫu trong đá ngay để 2 mạch đơn không bắt cặp lại với nhau
Bước 3:Bơm 10µl mẫu vào từng ô trên đĩa, sau đó đưa vào máy giải trình
tự DNA đã được lắp đặt sẵn mao quản thích hợp và cài đặt chương trình phù hợp trong phần mềm Gene Mapper, là phần mềm sẽ phân tích kích thước al chứa trình
tự microsatellite Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên
trong mao quản
Kết quả được phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công ty Master Food cung cấp Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về kích thước và độ tin cậy của các al tương ứng với mỗi loại primer, 5 bin set của 5 loại primer sau khi được thiết lập trong phần mềm Gene Mapper sẽ phân tích kết quả tự động để cho ra dữ liệu của 2 al có độ tin cậy cao nhất của từng mẫu với mỗi loại primer Do đó, có những trường hợp kết quả phân tích có nhiều hơn 2 al microsatellite nhưng bin set chỉ cho ra dữ liệu của 2 al đặc trưng nhất (có độ tin cậy cao nhất)
Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu Hình 3.6: Lắp cappilary vào máy
Một số sản phẩm PCR được tinh sạch để so sánh hiệu quả phân tích giữa
2 nghiệm thức: tinh sạch và không tinh sạch Qui trình tinh sạch gồm các bước sau:
- Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM và 60µl Ethanol 100% Đảo nhẹ ống
và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Bước 2: Li tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4oC
Trang 4- Bước 3: Hút bỏ dịch trong
- Bước 4: Hút 60µl Ethanol 70% cho vào mỗi ống Li tâm 12000 vòng trong 20 phút ở 4oC
- Bước 5: Hút bỏ dịch trong Làm khô trong 30 phút
- Bước 6: Hoà tan DNA đã tinh sạch trong 10µl nước cất tinh khiết
Sau đó làm tiếp tục với ba bước phân tích trình tự như trên
3.2.9.Phương pháp phân tính mức độ đồng nhất di truyền bằng phần mềm Cevus
Cervus là một phần mềm phân tích tần số al để kiểm tra sự đồng nhất di truyền của các cá thể và tìm ra đời bố mẹ của cá thể dựa trên các chỉ tiêu được lựa chọn Cervus phân tích tần số al dựa trên dữ liệu về kiểu gen của các codominant- loci
Dữ liệu đưa vào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được xuất ra dưới dạng file text
Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại và
13 mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8
để tiến hành phân tích sự đồng nhất của các cá thể dựa trên sự trùng khớp giữa các loci của chúng (matching loci), từ đó chúng tôi sẽ định danh được các mẫu mã hoá
Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả dựa trên dữ liệu microsatellite của 3 loci
đã loại trừ những allele dropping (xem trang 57) Mỗi loci gồm 2 al đồng hợp (VD: al 292- al 292) hoặc 2 al dị hợp (VD: al 235- al 244), đây cũng chính là đặc
tính của codominant-loci
Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus
CODE 15A 15B 18A 18B 8A 8B
BAL209 252 254 344 346 288 290
BAL244 244 246 337 344 292 292
BR25 235 244 331 344 302 305
KKM225 235 244 331 346 286 286
PBC123 235 244 331 342 288 290
PBC154 232 252 342 344 288 305
PBC157 235 250 331 346 288 302
]PBC159 235 244 331 346 290 302
PBC230 235 250 331 342 286 288
PBC236 235 250 342 344 290 305
QH1213 252 254 344 346 288 290
QH22 232 252 342 344 288 302
QH441 232 254 342 344 288 288
Trang 5A2 244 244 337 344 292 292
A3 235 250 331 342 288 290
A4 232 252 342 344 288 302
A5 235 244 331 346 286 286
A6 235 250 342 344 290 305
A7 252 254 344 346 288 290
A8 235 244 331 346 290 302
A9 235 244 331 344 302 305
A10 252 254 344 346 288 290
A11 235 250 331 346 288 302
A12 232 252 342 344 288 305
A13 235 250 331 342 286 288
A14 232 254 342 344 288 288
Chọn các chỉ tiêu phân tích để tìm ra các cá thể có sự đồng nhất di truyền bằng công cụ “Identity Check” trong phần mềm Cervus Dựa trên các chỉ tiêu phân tích này, Cervus sẽ tiến hành kiểm tra tất cả các cá thể và đưa ra dữ liệu của những cặp
cá thể có sự đồng nhất về mặt di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu đề ra Có 3 chỉ tiêu chính sau:
Số lượng loci phân tích
Số lượng loci đồng nhất tối thiểu
Số loci sai khác cho phép
Chúng tôi dựa trên kết quả kiểm tra và nhận diện các cặp cá thể có sự đồng nhất di truyền do Cevus phân tích để định danh các mẫu mã hóa Do đó việc định danh sẽ chính xác và khách quan
3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix
Genetix là một phần mềm tiếng Pháp dùng cho nghiên cứu di truyền quần thể dựa trên định luật Hardy-Weinberg và xử lý bằng phép toán thống kê Fichier (Weir & Cockerham,1984) thông qua giá trị thống kê F Giá trị này xác định mối quan hệ giữa các al của các cá thể và nó liên quan đến hệ số cận huyết Hệ số này
có thể đánh giá mối quan hệ không ngẫu nhiên giữa các al trong quần thể, nó cũng đánh giá sự giao phối thân cận giữa các đơn vị dưới quần thể và quần thể
Từ 21 dòng cacao khảo sát, căn cứ vào tên giống, chúng tôi có 6 quần thể với
dữ liệu microsatellite tương ứng với 5 primer của mỗi cá thể được đưa vào phần mềm Genetix để tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể dựa trên biểu đồ 3D (3 chiều)
Trang 6Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng cách di truyền giữa các quần thể Hai quần thể càng tách biệt nhau về mặt di truyền thì tần số các al khác nhau càng rõ rệt Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa các quần thể có sự giao phối ngẫu nhiên và có sự phân ly ít trong quá trình di truyền sẽ giúp chỉ ra cấu trúc của quần thể và dưới quần thể
Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix
Trang 7Biểu đồ 3.1: 6 quần thể với số lượng cá
thể tương ứng
Biểu đồ 3.2:5 primer với số lượng al
tương ứng
Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer
Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer
Trang 8Phần 4
Kết quả và thảo luận
4.1.Sản phẩm DNA li trích
Li trích DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này Đối với lá cacao, việc li trích gặp một số khó khăn
do lá cacao có lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh, bên trong mô lá chứa hàm lượng lớn polysaccharide, polyphenol và các sắc tố khác (Hoàng Thị Liễu, 2004)
Qui trình li trích DNA của chúng tôi đạt hiệu quả vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ Vì ở qui trình li trích này, trong dịch trích DNA
có chất mercapto có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh Bước ủ Rnase sẽ phân hủy RNA có trong mẫu li trích, góp phần hạn chế lượng DNA tạp tổng hợp từ RNA trong phản ứng PCR sau này Đặc biệt sự có mặt của muối sodium acetate có khả năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA Mặt khác, bước sử dụng Chloroform được lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu Do đó, DNA thu được rất tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra
Kết quả định lượng DNA bằng quang phổ kế cho thấy DNA của các mẫu đem li trích có độ tinh sạch tương đối cao với tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.5 đến 2.2 và lượng DNA có trong mỗi mẫu trung bình khoảng 50ng/µl
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA
Trang 9 Những mẫu có tỉ lệ OD thấp, độ tinh sạch không cao, chúng tôi vẫn có thể chạy PCR đạt kết quả tốt bằng cách xử lý như sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, rồi li tâm
ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4oC để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trường hợp này thể tích DNA trong phản ứng PCR được tăng lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) và giảm thể tích nước đi 2µl
Bước pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bước li tâm tiếp theo sẽ giúp thu được DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống
4.2.Sản phẩm PCR
Qui trình PCR cho kết quả ổn định với cả 5 cặp primer Tuy nhiên primer mTcCIR11 thường cho những band rất mờ do mức độ khuếch đại thấp hơn các primer khác Vì vậy khi pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7
Qui trình PCR cho kết quả tương đối ổn định Những mẫu có nồng độ DNA
li trích cao sẽ cho kết quả tốt khi chạy multiplex PCR, cho các band điện di sáng,
rõ Do đó khi thực hiện phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp đôi
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR
Trang 104.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao
Sản phẩm PCR có thể đưa vào phân tích ngay trên máy giải trình tự DNA mà
không cần phải qua bước tinh sạch Vì kết quả so sánh giữa 2 nghiệm thức tinh sạch
và không tinh sạch cho kết quả phân tích như nhau Do đó sản phẩm PCR không
cần phải tinh sạch trước khi phân tích để giảm tốn kém
Ngoài ra để giảm thời gian (1 giờ cho mỗi 16 giếng trên đĩa) và hóa chất
phân tích (size standard và hidi formamide), chúng tôi tiến hành trộn 3 sản phẩm
PCR riêng biệt (0.5µl/1sản phẩm) với cùng một lượng size standard và hidi
formamide như với 1 sản phẩm Điều này giúp giảm chi phí xuống 3 lần mà vẫn cho
kết quả phân tích tốt
Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất hiện band nào trên gel điện di
hoặc band điện di quá mờ vẫn có thể cho kết quả khi phân tích trên máy giải trình tự
DNA bằng cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đôi (1µl thay vì 0.5µl) trong hỗn hợp
mang điện di
Trong trường hợp không nhận được kết quả khi phân tích microsatellite (No
data), chúng tôi tiến hành hoàn thiện phản ứng bằng cách nâng lượng mẫu trong
phản ứng PCR lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) Do đó chúng tôi thu được kết quả phân
tích của tất cả các mẫu với 5 primer
Kết quả phân tích 21 dòng cacao khảo sát với 5 cặp pimer được tóm tắt ở
2 bảng 4.1 và 4.2 với các cặp al đặc trưng sau khi đã loại trừ những allele dropping
(xem trang 54) Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy 5 primer sử dụng có thể phân
biệt được 21 kiểu gen khác nhau
Với đặc tính đồng trội (codominant), những cặp al khác nhau được gọi là dị
hợp (VD: al 235- al 250), còn những cặp al giống nhau được gọi là đồng hợp (VD: al 288- al 288)
Dựa vào 2 bảng dữ liệu dưới đây chúng tôi có thể định danh được 21 dòng
cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được
bảng dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và
phân tích đa dạng di truyền
