Luận văn : KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH part 3 pps

Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của

Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn trong thử nghiệm Gram vật kính 100X

4.2.2 Mối quan hệ với oxy:

Trong thí nghiệm khảo sát mối quan hệ với oxy của các chủng phân lập được Trong tổng số 26 khuẩn lạc (chủng) vi khuẩn đều cho phản ứng catalase dương tính

Từ đó, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn đã phân lập được là vi khuẩn hiếu khí Ngoài ra, trong bốn chủng đại diện cho nhóm đều cho phản ứng oxydase dương tính cũng cho phép chúng tôi xác nhận một lần nữa các chủng này là vi khuẩn hiếu khí Kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu của Green (1992), trước đây [34]

4.2.3 Khả năng đi động

Kết quả thử nghiệm khả năng di động trong bốn chủng kiểm tra đều có khả năng di động (mọc lan ra khỏi đường cấy) Từ đó chúng tôi cũng có thể kết luận răng bốn chủng có roi (hay tiêm mao)

4.2.4 Kết quả khả năng sử dụng các chất cung cấp nguồn cacbon

Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cung cấp carbon và năng lượng các khuẩn lạc thuần được tóm tắt trên bảng 4.2

Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn

Từ các thử nghiệm sinh hóa này chúng tôi tiến hành phân nhóm các khuẩn lạc

có đặc điểm sinh hóa giống nhau Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của các chủng đã được công

bố Có tất cả 4 nhóm và bốn đại diện cho bốn nhóm được sử dụng trong tính toán hệ số tương đồng là: LM2, TS7, TN10, TD15

Hình 4.3: Kết quả khảo sát khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn

Chú thích: 1: arabinose, 2: betaine, 3: citrate, 4: glucose, 5: ethanol, 6: fructose, 7: glutamate, 8: acetate, 9: methylamine, 10: serbacate, 11: trimethylamine, 12: lactose, DC: đối chứng âm

4.2.5 Bộ thử nghiệm IDS 14GRN

Từ các chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa

để có thể khảo sát đầy đủ hơn một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bốn chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành dùng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm

để khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác Kết quả bộ thử nghiệm định danh IDS 14GNR được tóm tắt trên bảng 4.4

Bảng 4.4: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS14GNR

Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào

Các chủng trong thí nghiệm đều có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường trong khoảng nhiệt độ biến thiên từ 20 – 300C Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho ba chủng LM2, TS7, TD15 là 250C và chủng TN10 là 300C kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Green và ctv (1992), [34] Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của các dòng vi khuẩn được biểu diễn trên hình

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của vi khuẩn

y = 1.2566x + 7.165

R 2 = 0.9814

7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8

Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của vi khuẩn

Trong khi đó, từ biểu đồ (hình 4.6) chúng tôi nhận thấy rằng các chủng đều có thể tăng trưởng tốt trong khoảng pH 5,0 – 7.5, tối ưu trong khoảng 6,5 – 7 Chủng TS7 có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ aicd đến trung tính Ngược lai, chủng TD15 lại có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ acid đến pH hơi kiềm

4.2.7 Đường cong tăng trưởng

Dựa vào đường cong tăng trưởng (Hình 4.7)chúng tôi nhận thấy rằng các chủng tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy Và theo Green và ctv (1992), thì vi khuẩn

thuộc chi Methylobacterium tăng trưởng chậm Thời gian để vi khuẩn tăng trưởng tới

pha ổn định có thay đổi giữa các dòng vi khuẩn Dòng LM2 là 32 giờ, dòng TS7 là 40 giờ, dòng TN10 là 44 giờ và dòng TD15 là 36 giờ Từ những dữ liệu này chúng tôi cho rằng thời gian tốt nhất để thu hoạch tế bào là sau 24 giờ

Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn

Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng được tóm tắt trong bảng 4.4

Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

Hình dạng khuẩn lạc Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi

Chú thích: +: có sử dụng hay dương tính, -: không sử dụng hoặc âm tính, Pl: hồng nhạt, P: hồng, Pr: hồng đỏ

Từ hệ số tương đồng Jaccard chúng tôi có thể kết luận rằng chủng TS7 có quan hệ gần

với bốn loài: M variabile, M populi, M hispanicum và M aquaticum Chủng TD15

có quan hệ gần với loài M hispanicum Chủng LM2 rất có thể thuộc loài M

chloromethanicum Chủng TN10 có quan hệ gần với chủng 1019, loài M variabile,

M fujisawaense, M aquaticum, M hispanicum M mesophilicum Tuy nhiên, kết quả

định danh dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chưa thể định danh chính xác các

chủng có thuộc chi Methylobacterium hay không và phương pháp định danh bằng sinh

lý, sinh hóa cũng không thể định danh các dòng vi khuẩn đã phân lập thuộc loài nào Nên việc định danh vi khuẩn đã phân lập bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần thiết

300 base

234 base

4.3.2 Kết quả PCR

4.3.2.1 Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium

Khi khuếch đại DNA bộ gen bằng cặp mồi 2R và 2F các chủng điều tạo ra đoạn DNA đăc trưng khoảng 234base Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nishio và ctv (1997), [68] cho rằng cặp mồi 2F và 2R cho kết quả dương tính với 7 chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp Ngoài ra, ở chủng E.coli đối chứng âm không có đoạn DNA đặc

trưng Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng các chủng đã phân lập thuộc chi

Methylobacterium

Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R

Chú thích: 1: E.coli, 2: LM2, 3: TS7, 4: TN10, 5: TD15, M: thang chuẩn

(Ladder)

4.3.2.2 Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn

Do kết quả đoạn DNA đặc trưng chỉ có thể định danh các dòng vi khuẩn có

thuộc chi Methylobacterium hay không, mà không cho kết quả định danh đến mức độ

loài Vì vậy, chúng tôi tiếp tục khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn của vi khuẩn bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 [9] Tuy nhiên, cặp mồi này tạo ra trình tự tương đối lớn gây khó khăn cho quá trình giải trình tự, nên chúng tôi sử dụng phối hợp với cặp mồi 2F và 2R sản phẩm tạo ra là hai đoạn khoảng 500base và 1200base (hình 4.9)

1200 base

500 base

Chú thích: 1: LM2, 2: TS7, 3: TN10, 4: TD15, M: Ladder (Thang DNA chuẩn)

Hình 4.9: Sản phẩm điện di trên gel với cặp mồi FPGS6 với 2R và

FPGS1509 với 2F

4.3.3 Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài

Methylobacterium đã công bố

Kết quả giải trình tự được xác định độ chính xác bằng phần mềm fastPCR Kết

quả cho thấy rằng trong các mẫu giải trình tự chỉ có hai mẫu chính xác ở mức tinh cậy

được là đoạn DNA 500base của mẫu LM2 và TN10, còn các mẫu còn lại có sự sai sót

đáng kểtrong quá trình giải trình tự do mẫu chưa được tinh sạch Do đó, chúng tôi chỉ

tiến hành lấy hai trình tự đúng để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của BCBI

Kết quả so sánh trình tự với dữ lệu trên ngân hàng gene của NCBI (Mỹ)

Bảng 4.6: Hệ số tương đòng Sj của chủng TN10 so với các chủng công bố

Tên loài Độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj)

chú thích: Hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%), N: không xác định

Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các chủng đã công bố

Tên loài Mức độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj)

Mối quan hệ của trình tự hai chủng so với các chủng trên ngân hàng gen NCBI và của

phòng thí nghiệm được biểu diển trên cây sinh loài được vẽ bằng phần mềm CluxtalX

và Treeview

Hình 4.10: Cây sinh loài của các chủng trong chi Methylobacterium

Từ những số liệu so sánh này có thể thấy rằng mức độ tương đồng trình tự giữa chủng thí nghiệm với chủng đã công bố tương đối lớn Nên chúng tôi có thể kết luận

chính xác hơn là hai chủng đã giải trình tự đúng thuộc chi Methylobacterium Chủng

LM2 có quan hệ gần với chủng 1019 và TN10 cả ba chủng này cùng xếp trong cùng

một nhánh lớn với M thiocyanatum Kết hợp với độ tương đồng sinh hóa thì chủng

LM2 và chủng 1019 (0,462), chủng TN10 với chủng 1019 (0,769) là tương đối nhỏ Nên chúng tôi cho rằng hai chủng LM2 và TN10 khác biệt lớn với chủng 1019 và các

loài Methylobacterium sp đã công bố nên chúng tôi cho rằng có thể hai chủng LM2 và

TN10 là hai chủng mới Tuy nhiên, những kết luận này chưa chính xác 100% bởi vì

trình tự 500 base chỉ có thể định danh vi khuẩn Methylobacterium tới mức độ chi và

các đặc điểm sinh hóa cũng không thể định danh chính xác đến mức độ loài

4.4 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp

4.4.1 Kết quả định tính auxin

Kết quả định tính auxin bằng thuốc thử Salkowski cải tiến Trong bốn chủng thí nghiệm chỉ có hai chủng TS7 và TN10 có phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowski cải tiến Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), Ivanova và

ctv (2001), một số chủng thuộc chi Methylobacterium có thể tổng hợp auxin Từ đó có

thể khẳng định rằng hai chủng này có khả năng tổng hợp auxin ở nồng độ đủ phát hiện, còn hai chủng LM2 và TD15 có thể chúng không thể tổng hợp auxin hoặc nồng

độ auxin tạo ra của hai chủng này không đủ lớn để có thể phản ứng với thuốc thử Salkowski cải tiến

Chú thích:

DC1: Đối chứng âm chủng E.coli

DC2: Đối chứng dương IAA chuẩn

Hình 4.11: Kết quả định tính auxin

4.4.2 Kết quả định tính PHB

Trong bốn chủng đã thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với thuốc thử Nile Blue A Trong khi đó, theo Trâm (2006) [8], thì các chủng thuộc chi

Methylobacterium có khả năng tổng hợp PHB Từ kết quả này chúng tôi có thể kết

luận rằng, tất cả các chủng đã thử nghiệm có khả năng tổng hợp PHB Với các hạt sáng khác nhau chúng tôi cũng có thể khẳng định rằng các chủng có thể tổng hợp PHB

ở nồng độ khác nhau

Chú thích: DC: Mẫu đối chứng chủng E.coli

Hình 4.12: Sự phát sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang

Phần V: Kết luận và đề nghị

Sau thời gian nghiên cứu mặc dù có nhiều cố gắng Tuy nhiên, do thời gian tiến hành

có giới hạn nên chúng tôi chỉ đạt được một số kết quả nhất định và những kết quả này chỉ là kết quả bước đầu Các kết quả đạt được:

- Phân lập và làm thuần và khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa tổng số

26 khuẩn lạc, trong đó chia thành bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý,sinh hoá

- Đã định danh được các chủng thuộc chi Methylobacterium bằng các phương

pháp Sinh học Phân tử Trong đó, có hai chủng TS7 và TD15 chỉ định danh được ở mức độ có đoạn DNA đặc trưng và hai chủng LM2 và TN10 định danh được tới mức độ so sánh trình tự đoạn DNA 500base trong vùng 16S rDNA

- Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn Trong đó, bốn chủng đều có khả năng tổng hợp PHB và có hai chủng LM2 và TN10 có khả năng tổng hợp auxin là TS7 và TN10

Từ những kết quả đó chúng tôi có những đề nghị sau:

Cần tiến hành giải trình tự lại đoạn 1200 base của hai chủng trên cũng như các chủng đã giải sai để có thể định danh chính xác hơn đến mức độ loài

Định lượng lượng PHB tạo ra là bao nhiêu để có thể ứng dụng trong thực tế Kiểm tra khả năng tổng hợp auxin, cytokinins, khả năng kích thích sự nẩy mầm

của hạt, khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật ở điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro của các loài thuộc chi Methylobacterium trên để có thể ứng

dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, sử dụng làm nguyên liệu trong nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác

Phần V: Tài liệu tham khảo

Tài liệu tiếng việt

[1] Bùi Huy Đáp Một số vấn đề về cây lúa, NXB Nông Nghiệp, 1999

[2] Trương Đức Kỹ thuật trồng các giống lúa mới, NXB Nông Nghiệp, 2000

[3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật

học, NXB giáo dục 1998

[4] Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm Sổ tay kiểm

nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB nông nghiệp Hà Nội 2005 [5] Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu Sinh học phân tử giới thiệu phương

pháp và ứng dụng NXB Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 2005 [6] Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phượng Trang,

Phạm Thị Hồng Tươi Thực tập vi sinh vật học NXB Đại Học Quốc Gia

thành phố Hồ Chí Minh, 2001

[7] Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng

Thực tập vi sinh cơ sở NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh

2001

[8] Lê Thị Thuỳ Trâm 2006 Nghiên cứu thu nhận nhựa phân huỹ sinh học

poly- -hydroxybutyrate (PHB) từ vi khuẩn Methylobacterium sp phân

lập tại Việt Nam luận văn thạc sĩ sinh hóa, Đại Học Khoa Hoc Tự Nhiên

Tài liệu tiếng nước ngoài

[9] Abdoulaye Sy, Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De

Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson C., Dreyfus

B (2001) “Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix

nitrogen in symbiosis with legumes”, Journal of Bacteriology, Vol 183,

No 1, pp 214–220

[10] Ackermann J.-U., Müller S., Lösche A., Bley T., Babel W (1995)

“Methylobacterium rhodesianum cells tend to double the DNA content under growth limitations and accumulate PHB”, Journal of

Biotechnology, Vol 39, pp 9-20

[11] Anesti V., McDonald I R., Ramaswamy M., Wade W G., Kelly D P.,

Wood A P (2005) “Isolation and molecular detction of Methylotrophic

bacteria occurring in the human mouth”, Enviromental Microbiology, Vil

7, No 8, pp 1227-1238

[12] Anesti V., Vohra J., Goonetilleka S., McDonald I R., Str bler B.,

Stackebrandt E., Kelly D P., Wood Ann P (2004) “Molecular

detection and isolation of facutatively methylotrophic bacteria, including

Methylobacterium podarium sp nov., from the human foot microflora”, Environmental Microbiology, Vol 6, Iss 8, pp 820-830

[13] Arauujo W L., Maccheroni W Jr., Aguilar-Vildoso C I., Barroso P

A V., Saridakis H O., Azevedo J L (2001) “Variability and

interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf

tissues of citrus rootstocks”, Cannada Journal Microbiol, Vol 47, pp

220-236

[14] Arauujo W L., Marcon J., Maccheroni W Jr., Van Elsas J D., Van

Vuurde J W L., Azevedo J L (2002), “Diversity of endophytic

bacterial populations and their interaction with Xyllella fastidiosa in citrus plants”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol 68, No 10,

pp 4906-4914

[15] Arthi K., Appalaraju B., Parvathi S (2003) “Vancomycin sensitivity

and KOH string test as an alternative to gram staining of bacteria”, India

Journal of Medical Microbiology, Vol 21, pp 121-123

[16] Axel Ehmann (1977) “The van urk-salkowski reagent - a sensitive and

specific chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic

detection and identification of indole derivatives”, Journal of

Chromatography, Vol 132, pp 267-276

[17] Aziz N.H, El-Fouly M.Z, El-Essawy A.A, and Khalaf M.A Influence

of bean seadling root exudates on the rhizophere colonization by

Trichoderma lignorum for the control of Rhizoctonia solani Bot Bull Acad Sin 1997, 38: 33 – 39

[18] Benchimol R., Chu E., Yuimuto R., Dias-Filho M B (2000)

“Fusariosis control in black perper plants with bacterial endophytes

survival and morphophylogical responses”, Pesq Agropec Bras.,

Brasília, Vol 35, No 7, pp 1343-1348