Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 2 doc

coli 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định.. Dựa vào khả năng này người t

- Đôi khi còn có thêm một chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng

Ví dụ:

Escherichia coli Ry13

Giống Loài Chủng

EcoRI: enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E coli

EcoRV: enzyme thứ 5 được tìm thấy ở E coli

2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn

Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định

Dựa vào khả năng này người ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn:

Loại 1: Khi enzym nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide

Loại 2: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó

Loại 3: Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide Trong các thí nghiệm người ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại II

2.3.1.4 Các RE loại II

Trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide

đặc trưng Các trình tự này thường bao gồm từ 4-8 nucleotide (thường là 4 hay 6) Các

RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers Đối với một số RE, trình

tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác

Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tư có thể là C, A, hay T

Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào

Đặc trưng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ 3’ Như vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch

Hình 2.4 Hiện tượng giới hạn ở vi khuẩn

(a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đưôc nhận biết bởi enzym cắt

Các kiểu cắt của RE loại 2

Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một

điểm Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 ligase

Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch

Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau khi được cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành

một thông qua các đầu dính

EcoRI

không cắt DNA được methyl hoá DNA

được methyl hoá

Enzym cắt

giới hạn

EcoRI

Enzym cắt giới hạn

EcoRI

DNA không được methyl hoá

DNA không

được methyl

hoá

Phân cắt Đầu dính

Một số qui tắc cần chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE

Mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyên cáo của hãng sản xuất Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thường cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl

Do đó khi trong một phản ứng cần sử dụng nhiều RE:

Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể được sử dụng đồng thời

Nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải được cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp trước, sau đó thêm NaCl để đạt nồng

độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục phản ứng thủy giải

RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn được bảo quản ở -200C Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cắt trở lại vào -200

C

Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất Tuy nhiên để đảm bảo RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme

Ứng dụng

Việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử eukaryote Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh vật eukaryote Các enzyme cắt giới hạn chủ yếu được sử dụng trong phương pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lượng lớn Ngoài ra, chúng còn được dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân tích so

sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kĩ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism – tính đa hình kích thước của các trình tự)

2.3.2 Các enzym thông dụng khác

2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)

Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn được tổng hợp, nhờ một enzyme sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hướng 5’P 3’OH Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA được gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trường phản ứng một mồi axit nucleic

DNA polymerase I (từ E coli) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt

động enzyme: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải),

3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’

Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn

vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’ Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’

2.3.2.2 Taq polymerase

Là một loại DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn suối

nước nóng, Thermus aquaticus Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và

xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng

2.3.2.3 Terminal transferase

Enzym này được ly trích từ tuyến ức của bê Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng

Enzym này được sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phương pháp xác định trình

tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert

2.3.2.4 Các DNase

Các DNase thường được cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp

các oligonucleotide Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+

hay Mg2+ Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần như ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide) Khi có Mg2+, DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ

2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa

Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA Người ta thường khử phosphoril hoá vector vừa được mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector Enzym loại này thường được sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ như là yếu tố hoạt hoá Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bằng cách thêm vào một lượng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril được tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek

và cộng sự, 1973)

2.3.3 Các enzym nối DNA

Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề Sự hình thành liên kết này có thể

được xúc tác bởi hai loại enzym là E coli DNA ligase hay T4 DNA ligase

2.3.3.1 E coli DNA ligase

Enzym được ly trích từ E coli xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu so le

2.4 Các phương pháp sử dụng trong biến nạp

2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp

Vi khuẩn là vật chủ lý tưởng nhất cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào và biến

chúng thành những nhà máy sản xuất ra những sản phẩm mà ta mong muốn Những ưu

điểm cơ bản của vi khuẩn khi sử dụng chúng như những vật chủ để đưa DNA tái tổ

hợp vào như sau:

- Vi khuẩn có khả năng biến nạp Khả năng này được Federick Griffith đưa ra

từ năm 1928 Tuy nhiên khả năng này không phải tất cả vi khuẩn đều có mức độ như

nhau

- Vi khuẩn là cơ thể đơn bào, chúng có khả năng sinh sản, phát triển và trao đổi

chất rất mạnh Do đó nếu đưa DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn và chúng có khả năng biểu

hiện đựoc tính trạng hợp lí mà ta mong muốn thì chỉ trong thời gian rất ngắn ta có thể

thu nhận một lượng vật chấ lớn khổng lồ

- Vi khuẩn phát triển mạnh trong các nồi lên men Do đó ta hoàn toàn có khả

năng tự động hóa, cơ giới hóa quá trình sản xuất

Từ những ưu điểm nổi bật trên mà các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra

những phương pháp chuẩn bị tế bào khả nạp hợp lý và rất dễ thực hiện

2.4.1.1 Phương pháp hóa biến nạp

Phương pháp này có sự trợ giúp của CaCl2 kèm với làm sốc nhiệt để làm tăng

khả năng biến nạp của vi khuẩn Theo đó vi khuẩn chủ sẽ được trộn với DNA tái tổ

hợp Người ta cho vi khuẩn vào dung dịch CaCl2 lạnh và làm sốc nhiệt (nâng nhanh

đến 420C trong 2 phút) sẽ làm tăng khả năng biến nạp lên nhiều lần

Đối với tế bào động vật ta có thể thực hiện phương pháp biến nạp bằng cách

hấp thụ DNA tái tổ hợp qua trung gian phosphate calcium

Đối với tế bào thực vật, ta cũng có khả năng tạo biến nạp Tuy nhiên, việc đầu

tiên là tạo tế bào trần (protoplast) thực vật bằng cách dùng enzyme cellulose phân hủy

thành tế bào thực vật Sau đó trộn tế bào trần này với DNA tái tổ hợp với sự có mặt

của CaCl2 và polyethylenglycol Tiếp theo ta lại nuôi tế bào trần trong môi trường

thích hợp để tái tạo lại thành tế bào nguyên thủy Khi đó tế bào này mới phát triển

thành cây trong những điều kiện tương ứng

2.4.1.2 Phương pháp điện biến nạp

Ta có thể sử dụng xung điện để tế bào thực vật hấp thụ DNA tái tổ hợp Bằng phương pháp này ta thu được hiệu quả biến nạp rất cao

2.4.2 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp

Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trưởng trên môi trường có kháng

sinh Do đó, khi trải E coli biến nạp lên môi trường chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào

đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trưởng Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trưởng được

Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã được mở vòng

là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh nhưng không mang gen mục tiêu Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu được tiến hành theo nhiều phương pháp Phổ biến là các phương pháp sau:

- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation

- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp lai (lai khuẩn lạc)

- Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc) Thông thường, để phân tích một dòng người ta dung hai phương pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích

Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có

nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E coli chứa những

trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin) Việc chèn vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hưởng tới chức năng của lacZ Các vector loại này sẽ được sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase Hiện tượng α-complementation xảy ra khi hai protein

bất hoạt của β-galactosidase E coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một

enzym có chức năng Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng được phát hiện

vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trường có chứa cơ chất tạo màu X-gal

(5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside) Hợp chất không màu X-gal

bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl Dẫn xuất này, đến lượt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro

có màu xanh Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò như là chất kích hoạt của gen lacZ

Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin Do đó, hiện tượng α-complementation không thể xảy ra Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng

2.4.3 Chiết tách DNA plasmid

Với mong muốn thu nhận một số lượng lớn các bản sao plasmid, người ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ Thông qua đó, plasmid được sao chép với

số lượng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trưởng của tế bào chủ Trước hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trường chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dưới dạng tinh Các quy trình tách chiết đều có các bước chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA Tuỳ theo từng phương pháp cụ thể người ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết

Có nhiều phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn như:

- Phương pháp nhiệt độ cao

- Phương pháp Lythium

- Phương pháp SDS-kiềm

2 5 Điện di (Electrophoresis)

Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì

đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide Điều đó

có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thước

Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid

Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr) Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang

Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, tức là dưới 1000 cặp base Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose Do đó, gel này chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là:

- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp

- Xác định trình tự DNA

- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base

Gel đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng

Thực hiện nạp mẫu điện di

Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu nucleic acid đã được trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó Trạng thái đó được duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel Sau đó, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dưới UV

2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nước và ngoài nước

2.6.1 Ngoài nước

Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế

bào vi khuẩn E coli bằng phương pháp Calcium chloride

Sambrook và cộng sự (1989), đưa ra phương pháp chuẩn bị tế bào E coli khả

nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phương pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đưa ra công thức tính hệ số biến nạp

N = A x10n x OV/PV

N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm được trên môi trường chọn lọc n: hệ số pha loãng

OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn được trải trên đĩa (µl) Inoue và cộng sự(1990), đưa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp như sau:

10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phương pháp chuẩn bị tế

bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E coli khác

nhau Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hưởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn như sau: XL-blue là

từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45 Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dịch TB tối ưu là 75mM Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lưu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày

2.6.2 Trong nước

Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn

E coli DH5α” bước đầu xây dựng được quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình

tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid

đã chèn

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Thời gian : Khoá luận được tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày

14 tháng 08 năm 2006

Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực

Vật-Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Vi khuẩn E coli DH5α

Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lượng bản sao plasmid hoặc cosmid

Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)

hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1

Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tượng α-complementation với

tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase được mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)

3.2.2 pBluescript II SK(+/-)

pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, được thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự pBluescript chứa MCS với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA

polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro Trình tự của T7, T3 còn

có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phương pháp đọc trình tự

pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngược lại