Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 3 pptx

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặ

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR

Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym

Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử

Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta

sẽ thu được sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính Do điều kiện của thí nghiệm phải

thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng

tôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA

polymerase I large fragment (Klenow)

Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA

Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần như sau:

DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg)

DNA fragment Klenow 1 unit (1µl)

Thêm nước cho tới 20µl

Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm

EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút

Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid

Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo qui

DNA fragment Klenow 1 unit (1µl)

Thêm nước cho tới 20µl

Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm

EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút

3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng

nối blunt-end)

T4 DNA ligase không giống như E coli DNA ligase, nó có thể xúc tác phản

ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và

Ehrlych 1978) Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có được hiệu suất cao và cần

phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981),

nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lượng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol

của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10

Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lượng cao như

PEG hay Hexamminecobalt chloride Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng

ligation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lượng DNA và nồng độ ligase giảm xuống và

không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử được ngăn chặn, khi đó

chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra

Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn

Thêm nước cho tới 10µl

Ủ phản ứng ở 160C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng

cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer

3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α khả nạp (theo

quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa)

Thực hiện biến nạp theo quy trình sau:

- Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã được chuẩn bị cho vào

eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh

trong đá trong 20 phút

- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây

- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nước đá, giữ trong 2 phút

- Thêm 200µl môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ

- Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trường LB có chứa

kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều

trên bề mặt môi trường

- Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt

- Lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ)

- Quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri, bắt những khuẩn lạc trắng cấy sang môi

trường LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ

Thực hiện biến nạp theo quy trình trên plasmid chưa tái tổ hợp để làm đối

chứng Bắt những khuẩn lạc xanh cấy sang môi trường LB lỏng có kháng sinh

Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ

Thực hiện tách chiết plasmid theo qui trình ở mục 3.4.6.1

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5

(A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 10:1.5 phục

hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa

môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37 0 C; (B) Hình chụp gần; (C)

Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả

nạp) phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100 µl dịch phục

hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37 0 C

C

Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5

(A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục

hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1giờ, cấy 10 µl (nồng độ pha loãng ½)

dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37 0 C; (B)

Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là

10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy

100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB

agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37 0 C; (D) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid

theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200 µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy

100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB

agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37 0

C

Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến

nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo

quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên

đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5)

Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất

nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trường Điều này có thể giải thích là do trong quá

trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với

kháng sinh hoặc là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào

đã tiếp nhận plasmid nhưng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc

trắng hoặc tế bào đã tiếp nhận plasmid nhưng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen

LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt)

Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc

trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1 Như vậy cho thấy quy trình 2

hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp như vậy là hợp lí Khuẩn lạc mọc rời

rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trường lỏng nhân sinh

khối để li trích được plasmid

Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho

nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2 Khuẩn lạc xanh tuy nhiều

nhưng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trường lỏng

Như vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trường LB

agar/Amp/X-gal/IPTG chúng tôi thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp

4.2 Tách chiết DNA plasmid

4.2.1 Tách chiết DNA plasmid

Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trường đĩa và tiến hành cấy sang ống

nghiệm chứa 3ml môi trường LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc

ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu được kết

quả như sau:

Kết quả tách chiết plasmid lần 1 còn lẫn rất nhiều DNA của genome vi khuẩn

Có thể điều này là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA

của bộ gen đều hoàn tính

Với nhận định trên tôi đã tiến hành tách chiết plasmid lần 2 để khẳng định lại

quy trình Nhờ khắc phục những sai sót của lần 1 kết quả của lần tách chiết này cho

thấy đã loại đƣợc DNA của genome, thu đƣợc plasmid Nhƣ vậy, đây là quy trình tách

chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục Kết quả tách chiết chủ

yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản Sản phẩm tách chiết có

thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra

kết quả biến nạp

DNA genome

DNA

plasmid

3.0kb

Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1)

Những điểm cần lưu ý khi chiết tách plasmid

Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngược eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải

thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II

Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ

phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen

Ở bước 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ

nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không được hút xuống phần bên dưới

4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng Aurum TM

Plasmid Mini Kit

Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lượng plasmid thu

được nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh Sản phẩm tách chiết không

cần phải qua bước tinh sạch để sử dụng cho các bước tiếp theo trong quá trình cloning

4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV

DNA

plasmid

3.0kb

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit

trên gel agarose 1%

Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thước, vector

đã được mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhưng chỉ có sản phẩm tách

chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là được cắt Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt

lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu được kết quả như sau:

Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV

trong khi mẫu (3), (4) được cắt hoàn toàn

Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản

phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu được kết quả như

Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng như kích thước của plasmid đối chứng Do đó

có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hư site cắt EcoRV trên

vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết được vị trí

site cắt EcoRV trên vùng MCS

Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản

phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối

Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt

RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn

luôn được bảo quản ở -200C Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút

chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng

tốt trước khi cất trở lại vào -200C

Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi

cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất Tuy nhiên để đảm bảo RE không vượt quá 1/10 thể

tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme

4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII

4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA

Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào

plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA sau đó tinh

sạch đoạn DNA trên

Kết quả điện di cho thấy quá trình tinh sạch đã loại hết các thành phần tạp trong

sản phẩm PCR Tuy nhiên, phương pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm

PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản

phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel

Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzyme Klenow Fragment không

kiểm tra được bằng phương pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể kiểm

tra khi đã chèn vào được plasmid và biến nạp vào vi khuẩn

Một số điều cần lưu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution

buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên

thành của cột, cân eppendorf trước khi để gel cắt vào, gel phải được cắt vụn ra sau khi

cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy

thấp (low melting agar)

Chuẩn bị trước khi tinh sạch: máy điện di cần được rửa sạch, bảng gel cần được

rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới

Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thường, phải đựng hộp riêng, phải

thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trước khi chạy điện di, đổ gel tương ứng số

mẫu và giữ trong buffer

4.4.2 Tinh sạch plasmid

Plasmid sau khi dùng enzyme HindIII cắt mở vòng mới tinh sạch

Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản

phẩm

Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm

tinh sạch đoạn DNA bằng phương pháp

cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX

(1), (2): sản phẩm PCR kích thước

900bp; (3): ladder 100bp

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phương pháp

cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX

(1): sản phẩm PCR kích thước 223bp;

(2), (3): sản phẩm PCR kích thước 900bp

Từ sản phẩm trên tiến hành phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid và tinh sạch lại

bằng qui trình tinh sạch sử dụng RNAse

Sau đó tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối

4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp

Thực hiện phản ứng phủ đầu bằng cho sản phẩm PCR và plasmid sau khi cắt

HindIII, tinh sạch sản phẩm, nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid Biến nạp plasmid

đã nối này vào vi khuẩn E coli DH5α khả nạp,và thực hiện tương tự với plasmid chưa

tái tổ hợp để làm đối chứng thu được kết quả như sau:

Cả hai trường hợp biến nạp đọan DNA 900bp và 223bp đều cho toàn khuẩn lạc

màu trắng trên môi trường LB agar/Amp/X-gal/IPTG

TS

DC

Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1%

(DC) plasmid cắt bằng HindIII chưa tinh sạch; (TS) plasmid cắt bằng

HindIII tinh sạch bằng cột GFX

Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp

(A) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid

đã chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp

C

Kết quả trên có thể là đã biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn

hoặc những khuẩn lạc màu trắng trên là do các tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng

kháng sinh tạo thành

Còn trên đĩa đối chứng xuất hiện cả khuẩn lạc màu xanh và trắng

4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp

Chọn lọc những khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trường LB

lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình ở

mục 3.4.6.1 Chạy điện di chỉ thu được toàn genome của vi khuẩn

Còn kết quả li trích plasmid của khuẩn lạc xanh trên đĩa đối chứng thì thu được

DNA plasmid

Như vậy biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α chưa thành công

Điều này có thể là do nồng độ plasmid sau khi cắt và nối sử dụng để biến nạp là chưa phù

hợp, vì chúng tôi đã không thể tính toán được nồng độ plasmid hao hụt sau khi thực hiện

phản ứng cắt và nối Hoặc cũng có thể thời gian sốc nhiệt quá ngắn nên plasmid không thể

biến nạp vào tế bào vi khuẩn

Do đó, trong quá trình phủ đầu bằng cho đoạn DNA và plasmid phải luôn chú ý

cẩn thận tính toán các thành phần trong phản ứng cho phù hợp Còn trong quá trình thiết

lập phản ứng nối phải chú ý đến việc tính toán tỉ lệ thể tích giữa vector và đoạn DNA,

nhiệt độ ủ của phản ứng sao cho phù hợp và nên thêm các chất xúc tác cho phản ứng nối

như: PEG hay Hexamminecobalt chloride Biến nạp vào vi khuẩn nên sốc nhiệt ở thời

gian lâu hơn, thử nghiệm nhiều qui trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt và kèm theo

đối chứng

Vì thời gian giới hạn chúng tôi đã không thử nghiệm nhiều quy trình khác

nhau nên đã không cho ra được kết quả như mong muốn