Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thước mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần Qua bảng 4.9 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê sinh học P0,05, t
Trang 1Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trường MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml
dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4)
4.8 Thí nghiệm 8: “ Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy
Nghiệm
thức
Vml dung dịch khuẩn
Số chồi trên mẫu
Số rễ trên mẫu
* Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau
không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05)
1 cm
Trang 2Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thước mô sẹo ở các nghiệm
thức khác nhau sau 4 tuần
Qua bảng 4.9 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê sinh học (P<0,05) giữa các nghiệm thức có bổ sung khuẩn với nghiệm thức đối chứng và giữa các nghiệm thức có bổ sung khuẩn với nhau Số chồi trên mẫu ở nghiệm thức
bổ sung là nhiều nhất, nghiệm thức (8.2) cũng có chồi hình thành nhưng số lượng rất ít, các nghiệm thức còn lại mẫu không tái sinh chồi, như vậy chủng 1019 ức chế sự tái sinh chồi từ mô sẹo Nhưng bên cạnh đó, khuẩn lại kích thích sự tạo rễ ở nghiệm thức (8.3), số rễ hình thành ở nghiệm thức này nhiều hơn so với nghiệm thức đối chứng (sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học, P>0,05), tuy nhiên rễ ở nghiệm thức đối chứng mọc dài và chắc hơn so với rễ cúa các nghiệm thức có bổ sung khuẩn Ở thí nghiệm 4, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rõ ràng về sự phát triển kích thước mô sẹo, nhưng ở thí nghiệm này không có sự khác biệt về mặt thống kê sinh học giữa các nghiệm thức Do đó, có thể trên môi trường nuôi cấy không có bổ sung các chất sinh trưởng thưc vật thì chủng 1019 không ảnh hưởng đến sự phát triển mô sẹo Các mô sẹo ở nghiệm thức
Trang 3đối chứng ở dạng chắc, màu nâu vàng, có khả năng tái sinh, còn các mẫu mô sẹo ở
các nghiệm thức có bổ sung khuẩn có dạng xốp Như vậy tuy không ảnh hưởng
đến kích thước của mô sẹo nhưng Methylobacterium sp ảnh hưởng đến quá trình
trao đổi chất, làm thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo
Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trường MS không bổ
sung hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn,
(c) bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4
tuần nuôi cấy
1 cm
1 cm
1 cm
1 cm
Trang 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Từ các kết quả trên, chúng tôi có một số kết luận như sau:
- Chủng 1019 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo Chứng tỏ chủng khuẩn có tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào mô sẹo, ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan của sẹo Tuy không có sự khác biệt rõ với đối chứng nhưng chứng tỏ khuẩn có khả năng tổng hợp một lượng cytokinin cho sự phát triển rễ của mô sẹo, ảnh hưởng đến tỷ lệ auxin/cytokinin có trong môi trường dẫn đến sự thay đổi của mẫu so với đối chứng
- Chủng 1019 có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20 , chiều hướng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mô cấy và loài thực vật
- Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hoàn toàn mô sẹo, không thấy được sự phát sinh
cơ quan từ mô sẹo
Như vậy, chủng 1019 có khả năng ảnh hưởng đến chiều hướng phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20, nhưng khuẩn chỉ có khả năng kích thích sự tái sinh rễ từ
mô sẹo nhưng lại ức chế khả năng tái sinh chồi- sự tái sinh chồi là chiều hướng biệt hoá quan trọng nhất, được áp dụng nhiều trong các phương pháp chọn lọc giống, phương pháp chuyển gen… trên cây lúa Do đó ta có thể kết luận rằng chủng 1019 không có tác động tích cực lên sự phát sinh cơ quan của cây lúa Tuy nhiên từ những kết quả mà các tác giả [9], [46] đã đạt được bằng việc sử dụng vi
khuẩn Methylobacterium sp trên thực vật, chúng ta có thể tin tưởng rằng
Methylobacterium sp sẽ là một loài vi sinh vật tiềm năng tạo ra các cây giống in vitro có phẩm chất tốt, góp phần làm tăng hiệu quả trong sản xuất nông nghiệp
Trang 55.2 Đề nghị
Trong phạm vi đề tài này, do thời gian tiến hành có hạn chúng tôi chỉ đạt được một số kết quả nhất định về sự phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20 dưới
sự tác động của Methylobacterium sp trong điều kiện nuôi cấy in vitro, chưa khảo
sát được khả năng sống sót cũng như phát triển của các mẫu nhiễm khuẩn tái sinh trong giai đoạn vườn ươm để xác định rõ hơn nữa ảnh hưởng của
Methylobacterium sp lên giống lúa này Vì thế chúng tôi có những đề nghị để
củng cố thêm kết quả mà đề tài đạt được và hướng phát triển trong tương lai:
- Khảo sát ảnh hưởng của Methylobacterium sp lên sự tăng trưởng của
giống lúa VĐ20 trong giai đoạn vườn ươm
- Khảo sát ảnh hưởng của các chủng Methylobacterium khác lên các giống
lúa khác nhau để xác định chính xác hơn khả năng ảnh hưởng của khuẩn lên cây lúa
- Bên cạnh đó khảo sát ảnh hưởng của các chủng Methylobacterium khác
nhau lên các đối tượng thực vật khác nhau để xác định chủng mạnh nhất và đối tượng mà khuẩn có tác động tốt nhất
- Phân tích xác định rõ khả năng tổng hợp và hàm lượng các vitamine,
enzyme, chất kích thích tăng trưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp để
tìm hiểu rõ cơ chế tương tác giữa vi khuẩn với thực vật
Trang 6
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1 Bùi Bá Bổng và Nguyễn Duy Bảy, 1997 Nghiên cứu biến dị soma trên giống lúa Một Bụi và Khao Dawk Mali 105 Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long
2 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1995 Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến giống lúa (Giáo trình cao học nông nghiệp) NXB Nông nghiệp
3 Bùi Trang Việt, 2000 Sinh lý thưc vật đại cương Phần II: Phát triển NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
4 Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (Biên soạn), 2006 Ứng dụng công nghệ trong sản xuất lúa NXB Lao động Hà Nội
5 Dương Tấn Nhựt, Lê Thị Châu, Nguyễn Thị Thu Vân, Dương Ngọc Hiệp,
Phạm Thành Hổ, Phạm Thi Lệ Hà Ảnh hưởng của Bacillus spp lên sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy in vitro Hội nghị CNSH toàn quốc,
Hà Nội, 2003 NXB Khoa học và Kỹ thuật
6 Đoàn Thị Phương Thuỳ, 2001 Tìm hiểu một số đặc tính hình thái và sinh
lý của mô sẹo và dịch treo tế bào các dòng lúa Nàng Hương, Trắng Hoà
Bình và Bằng Ngọc (Oryza sativa L) Khóa luận cử nhân khoa học Đại học
Khoa học Tự nhiên
7 Đỗ Khắc Thịnh, 2003 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác
và yếu tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sông Cửu Long Luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm TPHCM
8 Hiệp hội Lương thực Việt Nam, 2003 Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động năm 2002 và phương hướng năm 2003 TPHCM, Việt Nam
Trang 79 Kiều Phương Nam, 2005 Phân lập, định danh và khảo sát sự tác động vi
khuẩn Methylobacterium sp lên sự phát sinh hình thái ở thực vật Luận văn
thạc sĩ sinh học Đại học Quốc gia TPHCM Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
10 Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2005 Quản lý rơm rạ trong ruộng lúa
11 Mai Trần Ngọc Tiếng và Bùi Trang Việt, 1991 Giáo trình sinh lý thực vật
Tủ sách Đại học Tổng hợp TPHCM
12 Nguyễn Vũ Hà Châu, 2005 Nhân giống invitro cây họ Zinnia (Zinnia
elegans) và cây hoa Viola (Viola sp.) Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông học Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
13 Nguyễn Đức Lượng (chủ biên)- Lê Thị Thủy Tiên, 2002 Công nghệ tế bào NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
14 Nguyễn Đức Lượng Công nghệ sinh học Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
15 Nguyễn Hữu Tâm, 1997 Khảo sát sự tạo mô sẹo và bước đầu thu nhận dịch
treo tế bào có khả năng sinh phôi từ hột lúa (Oryza sativa L.) Luận văn
Thạc sĩ khoa học Sinh học Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc gia TPHCM
16 Nguyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội
17 Nguyễn Văn Uyển, 1993 Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng NXB Nông Nghiệp TPHCM
18 Phạm Hoàng Hộ, 1972 Sinh học thực vật Bộ giáo dục và Trung tâm học liệu
19 Phạm Hoàng Hộ, 1972 Thực vật chúng NXB Giáo dục
20 Trần Văn Minh, 1994 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật (plant cell and tissue culture) Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Viện Sinh học nhiệt đới
Trang 821 Trần Thị Bích Trinh, 2000 Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào ở dòng lúa Bằng Ngọc (Oryza sativa L.) Khoá luận cử nhân khoa Sinh học Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM
Tài liệu nước ngoài
22 Abdoulaye Sy, Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson C., Dreyfus B., 2001
Methylotropic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in
symbiosis with legumes Journal of Bacteriology Vol 183, No 1, pp
214-220
23 Anesti V., McDonald I R., Ramaswamy M., Wade W G., Kelly D P., Wood A P., 2005 Isolation and molecular detection of Methylotropic bacteria occurring in the human mouth Enviromental Microbiology, Vil 7,
No 8, pp 1227-1238
24 Austin B and M Goodfellow, 1979 “Pseudomonas mesophilica, a new
species of pink bacteria isolated from leaf surfaces” Int J Syst Bacteriol
25 Collin H A and Edwards S., 1998 Plant tissue culture Bios Scientific Publishers
26 Corpe W.A and D.V Basile, 1982 “Methanol- utilizing bacteria associated with green plants” Dev Indust Microbiol
27 De Marco P., Pacheco C.C., Figueiredo A.R., Moradas-Ferreria P., 2004
bioremadiation” FEMS Microbiology Letters, Vol 234, pp 75-80
28 Department of health and ageing office of the gene technology regulator,
2005 The biology and ecology of rice (O sativa) in Australia
29 Doronina N.V., Trotsenko Y.A, Kuzentsov B.B., Tourova T.P.,
Salkinoja-Salonen M.S., 2002 “Methylobacterium suomiense sp nov and
Methylobacterium lusitanum sp nov., aerobic, pink-pigmented,
Trang 9facultatively methylotropic bacteria” International Journal of Systemmatic
and Evolutionary Microbiology, Vol 52, pp 773-776
30 Eggum B O., 1989 The nutrient value of rice in comparison with other cereals In: Chemical aspects of grain quality Manila, Philippine, IRRI, p 83-90
31 Gallego V., García T.M., Ventosa A., 2005 “Methylobacterium hispanicum nov and Methylobacterium aquaticum sp nov., isolated from drinking
water” International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp 281-287
32 Gallego V., García T.M., Ventosa A., 2005 “Methylobacterium hispanicum nov and Methylobacterium aquaticum sp nov., isolated from an aquatic
enviroment” International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp 281-287
33 George E F., 1993 Plant propagation by tissue culture Part I: In practice
Exegetic limited
34 Green P.N, 1992 “The Genus Methylobacterium”, pp 2342-2345 In Ballows A., Tiper H.G., Dworkin M., Harder V.,Schleifer K.H (ed.) The
Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin
35 Holland M.A., Polacco J.C., 1994 “PPFMs and other covert contaminants:
is there more to plant physiology than just plant?” Plant Physiology, Vol
45, pp 197-209
36 Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U., 2002 Epiphytic bacteria
associated with the bryophyte Funaria hygrometrica: effects of
Methylobacterium strains on protonema development Plant biol (Stuttg)
Trang 1038 IRRI, 2002 IRRI rice almanac, Third edition, Manila, Philippine, IRRI P
253
39 Kalyaeva M A., Zacharchenko N S., Doronina N V., Rukavtsova E B., Ivanova E G., Alekseeva V V., Trotsenko Yu A., Bur’yanov Ya I., 2000
“Plant growth and morphogenesis in vitro is promoted by associative
methylotropic bacteria” Russian Journal of Plant Physiology, Vol 48, No
4, pp 514-517 Translated from Fiziologiya Rastenii, Vol 48, No 4, pp
596-599
40 Kalyaeva M A., Ivanova E G., Doronina N V., Zakharchenko N S., Trotsenko Yu A., Burryanov Ya I., 2003 “Stimulation of wheat
morphogenesis in vitro by Methanotropic bacteria” Doklady Biological
Sciences, Vol 388, pp 76-78 Translated from Doklady Akademii Nauk,
44 Lidstrom M.E., Chistoserdova L., 2001 “Plant in pink: cytokinin
production by Methylobacterium” Journal of bacteriology, Vol 184, No 7,
pp 1818
45 Luo Z and R W, 1988 A simple method for the transformation of rice via
the pollen tube pathaway Plant Mol Biol Rept 6: 165-174
46 Maliti, Charles Mysyoki, 2000 “Physiological and biochemical effects of
Methylobacterium sp strains and foliar-applied methanol on growth and
Trang 11development of rice Oryza sativa L” Ph D thesis, The city University of
New York, USA
47 M.Maihaidan, S.Poonguhali, M.Senthilkumar, S.Seshadri, H.Chung, J.Yang, S.Sundaram and T.Sa,2004 “Growth promotion and induction of
systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L)” by
Methylobacterium spp Bot Bull Acad Sin
48 McDonald I.R., Doronina N.V., Trotsenko Y.A., McAnulla C and Murrel
J C., 2001 “Hyphomicrobium chloromethanicum sp nov and
Methylobacterium chloromethanicum sp nov, chloromethane-utilizing
bacteria isolate from a polluted enviroment” International Journal of
Systemmatic and Evolutionary Microbiology, Vol 51, pp 119-122
49 Narayanaswamy S , 1994 “Plant cell and tissue culture” Published by Tata McGraw – Hill Publishing Company Limited New Delhi
50 Omer Z.S., Tombolini R., Gerhardson B., 2004 “Plant colonization by pink-pigmented faculative methylotrophic bacteria (PPFMs)” FEMS
Microbiology Ecology, Vol 47, pp 319-326
51 Oono, K., 1981 Invitro methods applied to rice P 273-298 In: Plant Tissue culture T A thorpe (ed) Academic Press, New York
52 Oono, K., 1983 Genetic variability in rice plants regenerated from cell culture P 95-104 in: Cell and Tissue culture technique for Cereal Crop
Improvement IRRI Manila-Philippines
53 Patt T.E, G.C Cole and R.S Hanson, 1976 “Methylobacterium, a new
genus of facultatively methylotropic bacteria” Int J Syst Bacteriol
54 Pierik R L M, 1987 In vitro culture of higher plants Martius Nijhoff
Publishers, Dordecht, Netherlands
55 Razdan M K, 1993 An Introduction to Plant Tissue Culture Raju Primlani
for Oxford and IBH publishing Co Pvt Ltd
Trang 1256 Schaeffer, G W F Tescharpe and P B Cregan, 1984 Variation for improved protein and yield from rice anther culture Theor Appl Genet 67:
383-389
57 Shen J., P C Ni and P B Cregan, 1981 Studied on rice varities to blast
Sci Agric Sin (3): 10-15
58 Suenaga K., R Terada, T Izawa and H Fujimoto, 1989 Fertile transgenic
rice plants regenerated from transformed protoplasts Nature 338: 274-276
59 Torres K.C, 1989 Tissue culture technique for horticultural crops
Chapman and Hall New York- London, America
60 Toriyama K., Y Arioto, H Uchimiya and K Hinata, 1988 Transgenic rice plants after direct gene transfer into protoplasts Biotechnology 6: 1072-
methylotroph Methylobacterium thiocyanatum sp nov., capable of growth
on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources” Arch Microbiol, Vol
169, pp 148-158
Trang 14
Phụ lục 3
Môi trường Glycerol-Pepton Agar
Thành phần môi trường Glycerol-Pepton Agar
Trang 15Phụ lục 4
Phụ lục 4.1: Thí nghiệm 1
Analysis of Variance for ANH.kty - Type III Sums of Squares
-
Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -
COVARIATES
ANH.bdx .0563055 1 0563055 27.378 0034
MAIN EFFECTS
A:ANH.dot .0007884 2 0003942 .192 8314
B:ANH.nt 0467431 3 0155810 7.576 0262
RESIDUAL 0102831 5 0020566
-
TOTAL (CORRECTED) .7163932 11
-
0 missing values have been excluded
All F-ratios are based on the residual mean square error
Table of Least Squares Means for ANH.kty
-
95% Confidence
Level Count Average Stnd Error for mean
-
GRAND MEAN 12 7614583 0130914 7277950 7951217
A:ANH.dot
d1 4 7668478 0254613 7013762 8323194
d2 4 7500000 0226749 6916934 8083066
d3 4 7675272 0254613 7020556 8329988
B:ANH.nt
t0 3 9144248 0507119 7840236 1.0448260 t1 3 6382473 0299184 5613147 7151798
t2 3 7805480 0282532 7078975 8531985
t3 3 7126132 0319654 6304170 7948094
-
Multiple range analysis for ANH.kty by ANH.nt
-
Method: 95 Percent Duncan
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-
t1 3 6382473 X
t3 3 7126132 XX
t2 3 7805480 X
t0 3 9144248 X
-
contrast difference
t0 - t1 0.27618 *
t0 - t2 0.13388 *
Trang 16t0 - t3 0.20181 *
t1 - t2 -0.14230 *
t1 - t3 -0.07437
t2 - t3 0.06793
-
* denotes a statistically significant difference
Phụ lục 4.2: Thí nghiệm 2 * Tỷ lệ tái sinh chồi sau 2 tuần nuôi cấy Analysis of Variance for ANH1.tyle - Type III Sums of Squares
-
Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -
MAIN EFFECTS
A:ANH1.dot 902.7778 2 451.38889 1.857 2061
B:ANH1.nt 2777.7778 5 555.55556 2.286 1246
RESIDUAL 2430.5556 10 243.05556
-
TOTAL (CORRECTED) 6111.1111 17
-
0 missing values have been excluded
All F-ratios are based on the residual mean square error
Table of Least Squares Means for ANH1.tyle
-
95% Confidence
Level Count Average Stnd Error for mean
-
GRAND MEAN 18 47.222222 3.6746546 39.032398 55.412047 A:ANH1.dot
d1 6 54.166667 6.3646885 39.981475 68.351859 d2 6 50.000000 6.3646885 35.814808 64.185192 d3 6 37.500000 6.3646885 23.314808 51.685192 B:ANH1.nt
t1 3 41.666667 9.0010287 21.605776 61.727557 t2 3 50.000000 9.0010287 29.939109 70.060891 t3 3 58.333333 9.0010287 38.272443 78.394224 t4 3 33.333333 9.0010287 13.272443 53.394224 t5 3 33.333333 9.0010287 13.272443 53.394224 t6 3 66.666667 9.0010287 46.605776 86.727557 -
Multiple range analysis for ANH1.tyle by ANH1.nt
-
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
-
t4 3 33.333333 X
t5 3 33.333333 X
t1 3 41.666667 XX
t2 3 50.000000 XX
t3 3 58.333333 XX
t6 3 66.666667 X
-
contrast difference +/- limits
t1 - t2 -8.33333 28.3704
t1 - t3 -16.6667 28.3704
t1 - t4 8.33333 28.3704
t1 - t5 8.33333 28.3704
t1 - t6 -25.0000 28.3704
t2 - t3 -8.33333 28.3704
t2 - t4 16.6667 28.3704
