HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV White Spot Syndrome Virus TRÊN TÔM SÚ Penaeus m
Trang 1ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus)
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 – 2005
Trang 2Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005
Trang 3LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường
TS Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những khó khăn, vướng mắc trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp
CN Phạm Văn Điền và CN Hứa Đức Quới đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này
TS Lý Thị Thanh Loan và ThS Đinh Thị Thủy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện
Các anh chị làm việc tại phòng Mô Học, phòng Sinh Học Phân Tử và phòng Chất Lượng Nước tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường
và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài
Cô Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú Yên đã giúp tôi thu mẫu hoàn thành đề tài
Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập
Thành phố HCM, tháng 9 năm 2005
Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh
Trang 4iv
TÓM TẮT
PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng
9 – 2005 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ
CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)
Giáo viên hướng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO
Đề tài được thực hiện từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005, tại Viện Nghiên Cứu
Nuôi Trồng Thủy Sản II, trên hai đối tượng là TSV trên P vannamei (Postlarvae và thương phẩm) và WSSV trên P monodon (Postlarvae và thương phẩm) Hai loại virus
này có mức độ nguy hiểm và khả năng tạo dịch bệnh lớn ở tôm nuôi tại Việt Nam Do
đó, chúng tôi sử dụng phương pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai tại chỗ nhằm
mục tiêu phát hiện nhanh và chính xác các mẫu tôm nhiễm bệnh Taura và đốm trắng,
để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát hai loại dịch bệnh này Đề tài gồm các thí nghiệm sau:
1 Các thí nghiệm trên P vannamei
Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phương pháp ISH chẩn
đoán TSV trên P vannamei Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp ISH được ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán TSV trên P
Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ưu với Proteinase K, thực hiện trên 5 nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút Kết quả thời gian cắt với Proteinase K tối ưu trên postlarvae là 15 phút và trên tôm thương phẩm là 17 phút
Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực hiện trên 3 nghiệm thức: 100µl, 75µl và 50µl Kết quả thể tích dung dịch lai thích hợp nhất trên tôm postlarvae và tôm thương phẩm là 75µl
2 Các thí nghiệm trên P monodon
Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phương pháp ISH chẩn
đoán WSSV trên P monodon Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy
Trang 5rằng phương pháp ISH được ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán WSSV trên P
sử dụng
Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm, kết quả lai thực hiện theo quy trình này không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn
Thí nghiệm biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trước khi lai: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm và thu được kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn
Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe và mẫu đồng thời trên lame: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thương phẩm và thu được kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn
3 Thí nghiệm so sánh phương pháp ISH với mô học và PCR
Thí nghiệm được thực hiện trên P vannamei (postlarvae và tôm thương phẩm)
và P monodon (postlarvae và tôm thương phẩm) Kết quả thí nghiệm cho thấy phương
pháp ISH có độ ổn định, độ chính xác và nhạy hơn mô học và PCR
Từ các kết quả thực nghiệm như trên, chúng tôi đã đưa ra quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ chính xác cao và thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng được việc kiểm tra các mầm bệnh do WSSV và TSV gây ra trên tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong các hệ thống nuôi tôm ở Việt Nam
Trang 6vi
MỤC LỤC
Trang bìa i
Trang tựa ii
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt xi
Danh sách các hình và các sơ đồ xii
Danh sách các bảng xiv
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1
I.1 Đặt vấn đề 1
I.2 Mục tiêu đề tài 2
I.3 Yêu cầu của đề tài 2
I.4 Nội dung của đề tài 2
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3
II.1.1 Hiện trạng chung 3
II.1.2 Các hình thức nuôi 3
II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 3
II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 4
II.2.1 Hiện trạng chung 4
II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang được áp dụng 5
II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam 5
II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng 5
II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P monodon và tôm thẻ chân trắng P vannamei 5
II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng 6
Trang 7II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú 6
II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng 7
II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng 7
II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú 7
II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng 7
II.3.4 Dinh dưỡng 7
II.3.4.1 Dinh dưỡng của tôm sú 7
II.3.4.2 Dinh dưỡng của tôm thẻ chân trắng 8
II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển 8
II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) 8 II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD 8
II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh 8
II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý 11
II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh 11
II.4.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh 12
II.4.1.5 Phòng bệnh 12
II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 12
II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh 12
II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 13
II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh 14
II.4.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh 14
II.4.2.5 Phòng và trị bệnh 14
II.5 PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION 14
II.5.1 Sơ lược về phương pháp In situ hybridization 14
II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử 15
II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử 16
II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA 16
II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA 16
II.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử 17
Trang 8viii
II.5.5 Probe 17
II.5.5.1 Khái niệm 17
II.5.5.2 Các loại probe 18
II.5.5.3 Các phương pháp đánh dấu probe 18
II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai 19
II.5.6 Các phương pháp lai tại chỗ ISH 23
II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc 23
II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể 23
II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô 24
II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH 25
II.5.8 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản 25
II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura 25
II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản 26
II.5.9 Xu hướng phát triển của phương pháp này 26
CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 27
III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 27
III.2 Vật liệu sinh học 27
III.3 Hóa chất thí nghiệm 27
III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ 27
III.3.2 Hóa chất cần thiết nhưng không có trong bộ kit chẩn đoán 28
III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 28
III.4.1 Thiết bị thí nghiệm 28
III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm 29
III.5 Phương pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit 29
III.5.1 Chuẩn bị hóa chất 29
III.5.2 Chuẩn bị mẫu 30
III.5.2.1 Cố định mẫu 30
Trang 9III.5.2.2 Cách xử lý mẫu 30
III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin 31
III.5.2.4 Cắt mẫu 31
III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit 31
III.5.3.1 Ngày thứ nhất 31
III.5.3.2 Ngày thứ hai 32
III.6 Phương pháp nghiên cứu 34
III.6.1 Phương pháp thu mẫu 34
III.6.2 Bố trí thí nghiệm 34
III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei 35
III.6.2.2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon 36
III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với mô học và PCR 39
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P vannamei 41
IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phương pháp ISH 41
IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phương pháp ISH trên P vannamei 43
IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai 43
IV.1.2.2 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K 46
IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp 49
IV.2 Kết quả trên tôm sú P monodon 52
IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phương pháp 52
IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm 54
IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit 54
IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh 56
IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai 59
Trang 10x
IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe
trước khi lai 61
IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa ISH với mô học và PCR 65
IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei 65
IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae 65
IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm 66
IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon 68
IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae 69
IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm 70
IV.5 Nhận xét chung 73
IV.6 Những thuận lợi và khó khăn 74
IV.6.1 Thuận lợi 74
IV.6.2 Khó khăn 74
IV.7 Ưu nhược điểm của phương pháp In situ hybridization 75
IV.7.1 Ưu điểm 75
IV.7.2 Nhược điểm 75
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76
V.1 Kết luận 76
V.1.1 Phương pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV trên P vannamei 76
V.1.2 Phương pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P monodon 76
V.2 Đề nghị 77
CHƯƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 79
Trang 11
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA : Deoxyribonucleic Acid
RNA : Ribonucleic Acid
WSD : White Spot Disease
WSSV : White Spot Syndrome Virus
TS : Taura Syndrome
TSV : Taura Syndrome Virus
Bp : base pair
UV : Ultra – Violet
ISH : In Situ hybridization
PCR : Polymerase Chain Reaction
ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
RT – PCR : Reverse – transcription polymerase chain reaction
PBS : Phosphate Buffered Saline
TBS : Tris Buffered Saline
SSC : Sodium Chlorua/Sodium Citrate
NTB/BCIP : Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate TCT : Thẻ chân trắng
TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ KHV : Kính hiển vi
FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations
RT : Room temperature
ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long
OD : Optimal density
Trang 12xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC SƠ ĐỒ
Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng 10
Hình 2.2: Tôm sú bị nhiễm bệnh đốm trắng 11
Hình 2.3: Tôm bị nhiễm virus Taura TSV 13
Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin 21
Hình 2.5: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu huỳnh quang 21
Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe được đánh dấu với DIG 22
Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc 23
Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum 23
Hình 4.1: Đối chứng dương trên phụ bộ tôm lớn, X10 42
Hình 4.2: Đối chứng âm trên mang tôm lớn, X10 42
Hình 4.3: Mẫu lai được thực hiện theo nghiệm thức thứ III, quan sát trên phụ bộ X10 và X40 46
Hình 4.4: Hiện tượng dương tính giả trên phụ bộ tôm lớn, X10 51
Hình 4.5: Đối chứng âm trên gan tụy tôm lớn, X40 53
Hình 4.6: Đối chứng dương trên mang tôm lớn, X10 53
Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10 53
Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu mang tôm lớn, X40 53
Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh 58
Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40 63
Hình 4.11: Một số hình ảnh thu được khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phương pháp 68
Hình 4.12: Một số hình ảnh thu được khi chẩn đoán WSSV đồng thời bằng ba phương pháp 72
Trang 13Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trước khi thực hiện chẩn đoán 30
Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bước thực hiện trong ngày thứ nhất 32
Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bước thực hiện trong ngày thứ hai 33
Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh 38
Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện 64
Trang 14xiv
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các thông số tối ưu cho tôm phát triển 8
Bảng 2.2: Các tên gọi khác nhau của virus gây bệnh đốm trắng 9
Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV trong phòng thí nghiệm 38 Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P vannamei 40
Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P monodon 40
Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng ISH 41
Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm postlarvae 44
Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm thương phẩm 45
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên postlarvae 47
Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên tôm thương phẩm 48
Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm postlarvae 50
Bảng 4.7: Kếtquả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm thương phẩm 50
Bảng 4.8: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và hóa chất của bộ kit 52
Bảng 4.9: Kếtquả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất 55
Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae 56
Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thương phẩm 57
Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trước khi lai trên postlarvae 59
Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm thương phẩm 60
Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm postlarvae 61
Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm thương phẩm 62
Trang 15Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae 65 Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thương phẩm 66 Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae 69 Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thương phẩm 70
Trang 16CHƯƠNG I GIỚI THIỆU
I.1 Đặt vấn đề
Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lượng của các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao của nghề này và do sự ưu đãi của thiên nhiên nên nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi ngày càng được mở rộng hiện có hơn 260.000 ha dùng để nuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau Khoa học kỹ thuật
đã được áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất
Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật
độ cao Do đó nếu kỹ thuật nuôi chưa được đảm bảo, việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá
vỡ môi trường sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế Dịch bệnh vào cuối năm
1993 đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294
tỷ đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể
WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tượng tôm nuôi Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi Còn TSV (Taura Syndrome Virus) là một trong những virus gây bệnh nghiêm trọng trên tôm thẻ chân trắng (TCT) là chủ yếu nhưng cũng có khả năng lây lan và gây bệnh cho các loài tôm khác Hiện nay, hai loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm trên thế giới và gây nhiều thiệt hại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu Do đó, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm giám sát hai mầm bệnh này từ lúc thả
Trang 17giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử
lý thích hợp Việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong đó có phương
pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ
rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao
Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và được sự đồng ý của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng phương pháp In Situ
hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh do WSSV (White Spot Syndrome
Virus) trên tôm sú Penaeus monodon và TSV (Taura Syndrome Virus) trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei”
I.2 Mục tiêu đề tài
Phát triển phương pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus
monodon và mầm bệnh TSV trên thẻ chân trắng (TCT) Penaeus vannamei trong
điều kiện phòng thí nghiệm nhằm xây dựng được quy trình chẩn đoán ổn định, có
độ nhạy và độ chính xác cao
So sánh độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định và hiệu quả kinh tế của phương pháp ISH so với phương pháp mô học truyền thống và PCR
I.3 Yêu cầu của đề tài
Xem xét khả năng ứng dụng vào thực tế để chẩn đoán bệnh của phương pháp này
Đánh giá được hiệu quả của phương pháp chẩn đoán này so với phương pháp mô học và PCR
I.4 Nội dung của đề tài
Phát triển phương pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm sú
So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phương pháp này với các phương pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm
sú
Phát triển phương pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do TSV trên tôm TCT
So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phương pháp này với các phương pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh TSV trên tôm TCT
