Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 2 ppsx

Các probe được đánh dấu theo phương pháp này thì các phân tử lai được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi autoradiography.. Probe được đánh dấu bằng các chất hóa học khác Việc sử dụ

Các chất đồng vị phóng xạ thường dùng để đánh dấu mẫu dò là 32

P, 35S và 3

H Trong đó 32P được sử dụng nhiều nhất và nó phát tia ß có năng lượng rất cao nên tín hiệu nhận được rõ Nhưng bên cạnh đó thì 32P có hai nhược điểm lớn là:

- Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh Mẫu dò được đánh dấu bằng 32P không sử dụng được nhiều lần trong một thời gian dài dẫn đến chi phí cao

- Do năng lượng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận được không tinh mà khuếch tán trên một vùng rộng

35S phát tia có năng lượng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – 3 tháng) nên giúp giải quyết được nhược điểm trên của 32P nhưng năng lượng do 35S phát ra thấp nên ít được sử dụng để đánh dấu mẫu dò

Đối với một số phương pháp đặc biệt như lai tại chỗ cần độ phân giải cao thì người ta sử dụng 3H để đánh dấu mẫu dò, mặc dù năng lượng do tia phát ra rất yếu nhưng bù lại tín hiệu phát ra rất tinh

Nhìn chung, ưu điểm của các đồng vị phóng xạ là có độ nhạy cao, cho tín hiệu mạnh với thời gian phát sáng ngắn Nhưng chúng có nhược điểm là có hại cho sức khỏe của con người Đặc biệt là 32P phát tia có độ xuyên sâu nên đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn tốn kém trong thao tác và xử lý chất thải Ngoài ra, các mẫu dò cũng không thể dùng được trong một thời gian dài do chu kỳ bán rã của các đồng vị phóng

xạ

Các probe được đánh dấu theo phương pháp này thì các phân tử lai được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography)

B Probe được đánh dấu bằng các chất hóa học khác

Việc sử dụng các chất hóa học khác để đánh dấu mẫu dò giúp khắc phục được các nhược điểm của việc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ Tuy nhiên, ở đây lại vấp phải vấn đề về độ nhạy thấp hơn các phương pháp trước Hiện nay, chúng ta có các hệ thống đánh dấu hóa học thông dụng nhất là:

Hệ thống sử dụng avidin (hay streptavidin) – biotin: đây là một cặp ligand có hằng số ái lực cao nhất tìm thấy trong sinh học Đầu tiên, mẫu dò được đánh dấu bằng biotin theo hai cách: biotin được gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA được tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotin Sau quá trình lai, biotin hiện diện trong

Hình 2.5: Cơ chế phát hiện probe

đánh dấu huỳnh quang

Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát hiện biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification)

phân tử lai được phát hiện khi cho ligand của nó là avidin (hay streptavidin) vào phản ứng Avidin (hay streptavidin) trước đó có gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay một enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu Kết quả là những tín hiệu phát sáng hay tín hiệu màu nhận được trên màng lai

Hệ thống huỳnh quang: các probe được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang

sẽ phát sáng khi quan sát dưới tia UV (ultra violet) Cách đánh dấu này rất hữu ích khi kiểm tra các mẫu vi khuẩn hoặc mẫu tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi Thuận lợi của

hệ thống đánh dấu này là cùng một lúc ta có thể lai với nhiều probe được đánh dấu với

các chất phát huỳnh quang khác nhau và các phân tử lai được phát hiện cùng một lúc

Hệ thống dùng kháng thể: người ta dùng một nhóm kháng nguyên gắn vào probe và phát hiện sự hiện diện của probe này bằng các kháng thể đặc hiệu Các kháng thể này phải được đánh dấu bằng các tác nhân đánh dấu như trên để nhận biết Hệ thống này được dùng rộng rãi hiện nay nhất

là hệ thống đánh dấu bằng Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG

Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe được đánh dấu với DIG

Hình a: dùng một kháng thể; hình b dùng hai kháng thể trong đó Anti –

DIG là kháng nguyên của kháng thể thứ cấp

– AntiDIG/AP) Nếu probe được đánh dấu bằng DIG – AntiDIG/AP thì các phân tử lai được phát hiện bằng phản ứng tạo màu sau phản ứng Người ta dùng cơ chất NTB/BCIP (Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn trên AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa màu xanh khi nhìn dưới kính hiển vi quang học Trong một số quy trình, AntiDIG không được gắn với enzyme nên muốn phát hiện tín hiệu sau khi lai ta phải nhờ vào cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG

Hệ thống sử dụng Enzyme: Trước hết mẫu dò được đánh dấu bằng alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA và các enzyme này hình thành một phức hợp bền vững) Sau quá trình lai, người ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của hai enzyme và cơ chất đó có khả năng phát sáng khi bị biến đổi Ánh sáng phát ra

sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim

Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: người ta dùng các chất hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách

đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu

Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc

thể của nấm Thinopyrum

ponticum

Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc

II.5.6 Các phương pháp lai tại chỗ ISH

II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc

Phương pháp này được sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái

tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen

Ngân hàng gen (tức tập hợp các dòng vi khuẩn tái tổ hợp) được trải trên mặt thạch của đĩa petri Sau khi các khuẩn lạc đạt kích thước xác định, người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt các khuẩn lạc Trước khi thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và màng lai đều phải được đánh dấu trước để làm căn cứ đọc kết quả sau này Khi áp màng lai lên mặt các khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai Màng lai sau đó được xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA Việc cố định DNA trên màng lai và thao tác lai diễn tiến theo các bước tương tự như các phương pháp lai trên pha rắn như Southern Blot và Northern Blot Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên đĩa petri ban đầu Dòng vi khuẩn này sau đó được thu nhận và thực hiện các phân tích khác

II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể

Phương pháp lai này cung cấp những thông tin

chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự

DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò

(probe) chuyên biệt

Các nhiễm sắc thể thường có nguồn gốc từ các bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ được xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame Sau công đoạn loại bỏ RNA bằng RNase và loại bỏ protein bằng Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định trên lame được đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện phân tử lai, người ta phủ lên lame một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame được đem quan sát dưới kính hiển vi Kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai

II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô

Trong tế bào và mô, các DNA và RNA đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể Trong trường hợp đó người ta thường hay sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô

Mô được xử lý bằng các phương pháp mô học (cố định, khử nước, tẩm paraffin, cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai Thao tác xử lý mẫu lai và phát hiện phân tử lai tương tự như lai trên nhiễm sắc thể Kết quả được đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học

Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau:

Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ Ở đây người ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó

Các phương pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trưng của nó Khi phối hợp phương pháp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, người ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó Từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen

Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống

Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn Điều này đã tạo những bước nhảy vọt lớn cho các phương pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò được đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau

II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH

Phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng

Định vị một gen xác định trên nhiễm sắc thể

Nghiên cứu sản phẩm phiên mã và dịch mã của một gen xác định trong mô hay

tế bào, từ đó giúp người ta chẩn đoán được các bệnh nguy hiểm trên người như bệnh ung thư, bệnh viêm gan…Đây là một hướng ứng dụng rộng rãi nhất của phương pháp ISH

II.5.8 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản

II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura

Mở đầu là công trình nghiên cứu về loại mô đích của virus gây bệnh đốm trắng

do Lo và ctv thực hiện Họ đã gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV (White spot baculovirus) trên tôm sú và đạt tỷ lệ nhiễm 100% Sau 40 giờ nhiễm, họ

phát hiện virus gây bệnh bằng phương pháp In Situ hybridization và xác định được

mang và gan tụy là cơ quan đích của virus này Các kết luận sau đó cho rằng mô đích của virus đốm trắng chính là các mô có nguốn gốc trung bì (Lo và ctv, 1996)

Một nghiên cứu khác của nhóm là sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot và Southern Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng cũng thu được nhiều kết quả tốt (Lo và ctv, 1996)

Arun K Dhar, Michelle M Roux và Kurt R Klimpel (2001) đã sử dụng kỹ thuật Real – Time Quantitative PCR và SYBR Green Chemistry để phát hiện và định

lượng WSSV nhiễm trên Penaeus sp Qua kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học

đã xác định được phương pháp SYBR Green PCR phát hiện virus đốm trắng nhanh, nhạy và định lượng được lượng virus nhiễm vào tôm chính xác nhất

Các nghiên cứu về bệnh Taura và virus TSV thì tương đối ít hơn, Nunan L.M., Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 đã dùng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện virus TSV Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng primer tạo ra từ một đoạn cDNA trên genome của TSV và khuếch đại được một gen có kích thước 231 bp Bằng kỹ thuật này, nhóm

nghiên cứu đã phát hiện được TSV khi gây nhiễm thực nghiệm trên P vannamei và P

stylirostris Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M.,

Lightner D.V đã thực hiện nghiên cứu các phương pháp khác nhau để chẩn đoán và phát hiện TSV trên tôm thẻ nói chung Qua thí nghiệm này nhóm đã đưa ra các phương pháp hiện nay có thể áp dụng để chẩn đoán TSV như RT – PCR, Western blot,

Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 2002)

II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản

Trong thủy sản mà đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm, ngoài các biện pháp truyền thống đã được áp dụng trước đây thì ISH đã phát huy được thế mạnh của một phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao Một loạt các thí nghiệm

đã được thực hiện dựa trên phương pháp ISH như phân biệt các dòng Baculovirus BP – type khác nhau (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát hiện

Piscirickettsia salmonis trên họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J và

Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với loài chình nuôi và đã xác định được 27 dòng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar

R., 1999); phát hiện Macrobrachium rosenbergii nodavirus trên tôm càng xanh (Sri

Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R và ctv, 2003); phát hiện virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm he, cua và tôm hùm (Poh-Shing Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)…

II.5.9 Xu hướng phát triển của phương pháp này

Hiện nay, phương pháp ISH đã được ứng dụng rộng rãi và đã được phát triển thêm một bước mới, người ta có thể đồng thời phát hiện nhiều trình tự đích khác nhau trên cùng một mẫu mô hoặc tế bào bằng cách lai với nhiều probe được đánh dấu với nhiều tác nhân khác nhau Các tín hiệu sau khi lai sẽ được phát hiện dựa vào các phản

ứng tạo màu khác nhau Nhược điểm chính của phương pháp dùng nhiều probe này là các trình tự đích này nằm trùng với nhau trên mẫu mô nên rất khó khăn khi phân biệt, làm sao để phân biệt các tín hiệu tạo ra do nhiều probe cùng liên kết với cùng một vị trí trên mô Để khắc phục được nhược điểm này, người ta gắn các chất nhuộm huỳnh quang vào các probe, các chất nhuộm huỳnh quang này phát ra tín hiệu ở các bước sóng khác nhau, dựa vào đó người ta phát hiện các probe sau khi lai (Paddock, 2001)

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ

NGHIỆM

III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

 Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005

 Địa điểm thực hiện thí nghiệm tại phòng Mô học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ (TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB) trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh

III.2 Vật liệu sinh học

1 Đối tượng thí nghiệm là P monodon và P vannamei ở các dạng sau:

Tôm thương phẩm

Tôm giống Postlarvae

2 Các mẫu tôm sú P monodon đã được phương pháp mô học và PCR xác định

III.3 Hóa chất thí nghiệm

III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ

Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer)

Proteinase K (dạng bột)

Đệm PBS 1 lần (1X PBS Buffer)

Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer)

Dung dịch lai (Hybridization Solution)

Mẫu đối chứng dương

Mẫu đối chứng âm

Trong đó, thành phần của dung dịch lai gồm:

Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin)

SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer

Formamide 50%

Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP)

Dextran Sulfate 5%

DNA cá hồi 0,5 mg/l

Thành phần bộ kit chẩn đoán WSSV và TSV hầu như giống nhau chỉ khác nhau

ở thành phần của dung dịch lai Đối với bộ kit chẩn đoán WSSV, dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh đốm trắng và bộ kit chẩn đoán TSV thì dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh Taura

III.3.2 Hóa chất cần thiết nhưng không có trong bộ kit chẩn đoán

Cồn tuyệt đối, xylene hoặc chất thay thế xylene, nước cất hai lần, chloroform, paraffin, formalin, formaldehyde 37%, acid acetic nguyên chất, paraformaldehyde dạng bột, Bismark Brown Y dạng bột, keo dán (Boume du Canada)

Các loại hóa chất này mua từ công ty Prolabo và Merck, có độ tinh khiết cao

III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

III.4.1 Thiết bị thí nghiệm

Máy xử lý mẫu tự động, bình rót paraffin, Electrothermal, bàn lạnh, máy cắt mẫu Microtome, bể nước ấm có chỉnh nhiệt độ, bàn ấm cố định mẫu trên lame kính, tủ

ấm có chỉnh nhiệt độ, buồng ẩm chuyên dụng cho lai tại chỗ Slide Moat, tủ lạnh âm

200C và tủ mát 40C – 70C, kính hiển vi quang học

III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm

Cassette chứa mẫu có nắp đậy, khung inox dùng để đúc mẫu, lame và lamelle, ống eppendorf, bếp điện và nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu, micropipette loại có thể tích 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl và

1000 µl, các loại pipette có thể tích 1ml, 5 ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame dương và các dụng cụ cần thiết khác

III.5 Phương pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit

III.5.1 Chuẩn bị hóa chất

Pha loãng các hóa chất có trong bộ kit về nồng độ làm việc như PBS 1X, PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50% Tất cả các dung dịch trên được pha loãng trong nước cất hai lần

Chuẩn bị Proteinase K bằng cách dùng pipette hút 1 ml đệm PBS 1X có sẵn trong bộ kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất rồi hút 1 ml của lọ Proteinase K cho vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất này hòa đều vào nhau Sau cùng ta phân dung dịch vừa thu được vào các eppendorf và trữ ở -200C, 1 ml cho mỗi eppendorf

Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% bằng cách thêm 0,2 gram bột paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy đều dung dịch ở 370C cho đến khi nào paraformaldehyde hòa tan hoàn toàn Sau đó trữ dung dịch ở 2 – 70C và dùng trong 2 tuần

Pha dung dịch Bismark Brown Y 0,5% bằng cách thêm 0,5 gram bột Bismark Brown Y vào 100 ml nước cất, hòa tan bột rồi lọc qua giấy Whatman#1 Trữ dung dịch này trong bình xám ở nhiệt độ phòng

Các dung dịch PBS 1X, PBS/Glycine 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, Blocking buffer 1X, paraformaldehyde 0,4% trữ ở 2 – 70C dùng trong 2 tuần Cồn đã pha loãng

và các dung dịch SSC có thể giữ được một tháng ở nhiệt độ phòng

III.5.2 Chuẩn bị mẫu

Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trước khi thực hiện chẩn đoán

Tổng thời gian xử lý mẫu: 12,5 giờ

Paraffin được dùng trong quy trình xử lý mẫu này là hỗn hợp với sáp ong theo

tỷ lệ 5 paraffin : 1 sáp ong

III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin

Đặt mẫu đã xử lý vào khuôn inox, dùng bình rót paraffin (5 paraffin : 1 sáp

ong) vào khuôn chứa mẫu, cố định các mẫu sao cho nó nằm yên dưới đáy và tách rời

nhau Sau đó đặt khuôn inox chứa mẫu và paraffin lên bề mặt của dụng cụ làm lạnh,

đợi khuôn lạnh khối paraffin chứa mẫu đã cứng và tách khối paraffin ra khỏi khuôn

III.5.2.4 Cắt mẫu

Dùng máy cắt Microtome cắt mẫu thành từng lát dày 5 – 6 m Mẫu cắt được

trải lên lame, nhỏ vài giọt cồn 70% lên mẫu rồi cho mẫu qua bể chứa nước 400C để

làm căng bề mặt mẫu Sau đó đính mẫu lên lame dương và giữ ấm ở 400

C trong 4 – 6 giờ mới thực hiện chẩn đoán

III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit

III.5.3.1 Ngày thứ nhất

Cố định lát cắt mô trên lame kính bằng cách ủ lame ở 600C trong 30 phút

Xử lý mẫu trước khi lai

 Dùng xylene để khử paraffin trong mẫu, loại bỏ xylene trong mẫu bằng

cồn tuyệt đối Sau đó, ta giảm dần độ cồn và rửa lại nước cất nhiều lần để đảm bảo

Paraffin (1)

3 giờ

Paraffin (2)

3 giờ

 Sau đó tiến hành xử lý mẫu với PBS 1X, tạo điều kiện cho Proteinase K hoạt động tốt

 Dùng enzyme Proteinase K để xử lý mô, phân hủy màng tế bào và màng nhân vì enzyme này chỉ có khả năng phân cắt protein có trong mẫu mô đã cố định trên lame và không ảnh hưởng gì đến acid nucleic trong mẫu

 Rửa mẫu với dung dịch PBS/Glycine 1X để loại bỏ các enzyme còn thừa

 Sau đó cho mẫu vào trong hủ nhuộm sạch có chứa paraformaldehyde 0,4%, ủ 10 phút ở 40C giúp sợi DNA duỗi thẳng ra thuận lợi cho quá trình bắt cặp bổ sung

Tiến hành lai: Mẫu dò hay probe trong dung dịch lai trước đó đã được biến tính bằng cách đun 10 phút ở 950C, làm lạnh nhanh và giữ lạnh ở 40C Sau đó, ta cho dung dịch lai lên lame và biến tính mẫu mô ở 950C trong 6 phút

Phản ứng lai giữa hai thành phần trên xảy ra ở 420C trong 12 – 18 giờ (ủ qua

đêm)

Xylene 5 phút, lặp lại 3 lần

Thấm dung dịch trên lame nhưng không được để khô mô

(Đối với tất cả các bước trong kỹ thuật này)

Dung dịch PFA 0,4%/PBS 1X, 10 phút, 40C

1X/glycine 5 phút, RT

1 Hút 75 l dung dịch lai/lame, đậy lamelle lại

2 Đặt lame lên bàn lai ở 950C trong 6 phút

3 Tiếp tục cho lame vào phòng ẩm, ủ qua đêm ở 420C

Mẫu trên lame ủ

Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bước thực hiện trong ngày thứ nhất

III.5.3.2 Ngày thứ hai

 Sau bước ủ lai ngày thứ nhất, mẫu trên lame kính được rửa dung dịch lai để loại

bỏ lượng mẫu dò thừa bằng một loạt dung dịch đệm Sodium Chloride/Sodium Citrate

Dung dịch phát triển màu 2 giờ, ủ trong tối

Dung dịch stop

buffer1X, 5 phút

Thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, 60 giây

Rửa màu thừa bằng nước cất

Cồn 95% 1 phút, 3x Cồn 99,5% 1 phút, 3x Xylene 1 phút, 3x

Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bước thực hiện trong ngày thứ hai

 Rửa mẫu với dung dịch TBS 1X để loại bỏ những phân tử Anti – DIG gắn AP thừa

 Ủ mẫu với dung dịch phát triển màu 2 giờ, trong tối ở nhiệt độ phòng

 Kết thúc phản ứng hiện màu bằng dung dịch Stop buffer 1X

 Nhuộm màu bổ sung bằng thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, mẫu mô – những vùng không có phân tử lai dưới kính hiển vi quang học có màu vàng nâu Rửa sạch màu thừa bằng nước cất hai lần Chúng ta có thể quan sát kết quả lai dưới kính hiển vi quang học ngay sau bước này Nếu muốn giữ mẫu lâu thì tiếp tục cho lame mẫu qua cồn 95%, cồn tuyệt đối, xylene và dán keo cytoseal 60

III.6 Phương pháp nghiên cứu

III.6.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu được thu theo từng đợt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và mẫu nhận hàng ngày tại TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Cách thu mẫu được tiến hành như sau:

Đối với tôm Postlarvae: Đối với tôm Postlarvae thu khoảng 100 con/bể, thu ở nhiều nơi trong bể giống, sau đó trộn lại với nhau và thu khoảng 100 con cho trực tiếp vào dung dịch cố định Ngoài ra, chúng ta có thể dùng nước ngọt hoặc formol gây sốc tôm trong khoảng 10 – 15 phút, nồng độ formol 200 – 300 ppm, sau đó thu những con yếu và chìm dưới đáy Mẫu sau khi thu được chia thành hai phần cho vào hai lọ chứa dung dịch cố định khác nhau, một lọ có chứa cồn 950C để làm PCR và lọ còn lại có chứa dung dịch Davidson (đối với tôm sú) hoặc R-F (đối với TCT) để làm mô học và

In situ hybridization Khi thu mẫu thì tôm còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối

Tỷ lệ hóa chất dùng cố định mẫu là hóa chất : mẫu = 10 : 1

III.6.2 Bố trí thí nghiệm

Chẩn đoán theo quy trình bộ kit để ổn định phương pháp

Thay đổi một số bước trong quy trình để đưa ra một quy trình tối ưu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện

Thí nghiệm để so sánh độ ổn định, độ chính xác và hiệu quả giữa phương pháp ISH vừa tìm được với mô học và PCR

Các bố trí cụ thể như sau:

III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei

A Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phương pháp

Để thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT của phương pháp ISH, chúng tôi thực hiện thí nghiệm theo quy trình bộ kit đã nêu ở mục III.5 trên ba mẫu tôm dương tính với TSV, một đối chứng dương và một đối chứng âm Vì chúng

tôi không thu được những mẫu dương tính điển hình nên thực hiện thí nghiệm này trên các mẫu cũ, được lưu lại trong phòng thí nghiệm mô học từ năm 2004 Các mẫu tôm này dương tính với TSV khi xét nghiệm bằng mô học và PCR, thực hiện thí nghiệm lặp lại 2 lần

B Bố trí thí nghiệm để tìm quy trình ISH tối ưu cho TSV trên Penaeus vannamei

Sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, chúng tôi thực hiện một số thí nghiệm tiếp theo để tìm ra quy trình ISH tối ưu cho TSV trên TCT trong phòng thí nghiệm, các thí nghiệm đó là:

(a) Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu thích hợp

Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này trên 10 mẫu tôm TCT đã được phương pháp mô học và PCR xác nhận là dương tính với TSV (5 mẫu tôm thương phẩm và 5 mẫu postlarvae) và hai đối chứng (đối chứng dương và đối chứng âm) Thí nghiệm được bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên năm nghiệm thức sau:

Nghiệm thức I: probe và mẫu được biến tính chung trên lame ở 950

C trong 6 phút, thực hiện trong buồng ẩm

Nghiệm thức II: probe được biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 800C trong 6 phút

Nghiệm thức III: probe được biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút

Nghiệm thức IV: probe được biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 600C trong 6 phút

Nghiệm thức V: probe được biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 500C trong 6 phút

(b) Thí nghiệm tìm thời gian cắt thích hợp với Proteinase K

Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai đối tượng là tôm postlarvae và tôm thương phẩm để tìm ra thời gian tối ưu áp dụng trên từng đối tượng đó, mỗi đối tượng thực hiện 5 mẫu và hai đối chứng (đối chứng dương và đối chứng âm) Các mẫu