Như vậy sau hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu 1, 2, 3 có kết quả mô học và PCR dương tính đều cho kết quả ISH dương tính khi đối chứng với mẫu đối chứng dươn
Trang 1Hình 4.5: Đối chứng âm trên gan tụy tôm lớn, X40
Hình 4.6: Đối chứng dương trên mang tôm lớn, X10
Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV
trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10
Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu mang tôm lớn, X40
nhuộm bổ sung nhuộm bổ sung
Kết quả được đọc dưới KHV quang học và cách đọc như sau:
Mẫu dương tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những
tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thường, nhân không bị trương to và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam)
Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc
Trang 2Như vậy sau hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu 1,
2, 3 có kết quả mô học và PCR dương tính đều cho kết quả ISH dương tính khi đối chứng với mẫu đối chứng dương và đối chứng âm, xác suất trùng hợp giữa ba phương pháp 100% (3/3) Mẫu số 3 sau khi lai cho kết quả tương đối mờ có thể do trong quá trình thao tác chúng tôi rửa mẫu chưa được sạch lắm, lát cắt mẫu trên lame sau khi lai
bị dơ Điều này cũng có thể do quá trình bắt cặp không đặc hiệu giữa probe và trình tự không phải DNA đích trong mẫu mô, tạo ra các tín hiệu nền hoặc do thời gian cắt mẫu với Proteinase K quá lâu, cũng có thể do thao tác nhuộm màu bổ sung chưa tốt
Trong quá trình thực hiện, ta thấy mẫu đối chứng âm sau hai lần thí nghiệm đều không xuất hiện những thể kết tủa màu xanh đậm trong nhân, không bị ngoại nhiễm và cũng không có hiện tượng dương tính giả; trên đối chứng dương thì cấu trúc mô rõ ràng, tín hiệu lai thu được rất nhiều và rõ khi quan sát dưới KHV quang học chứng tỏ rằng quá trình lai được tiến hành rất tốt và không bị ngoại nhiễm
Trên cơ sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, chúng tôi nhận thấy
rằng khả năng chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú của phương pháp này rất hiệu quả, với độ chính xác cao và kết quả thu được ổn định Do đó, chúng tôi tiến hành ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi ở các giai đoạn postlarvae và thương phẩm góp phần vào việc kiểm soát và hạn chế kịp thời những tác hại do WSSV mang lại Chẩn đoán theo phương pháp này sẽ khắc phục được tính kém đặc hiệu của mô học và tránh được hiện tượng dương tính
giả của PCR
IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ưu cho WSSV áp dụng
trong phòng thí nghiệm
IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một
số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit
Theo cách bố trí này chúng tôi cũng thực hiện lại thí nghiệm trên ba mẫu tôm 1,
2 và 3 trên, đối chứng dương và đối chứng âm Ở đây, chúng tôi dùng cồn tuyệt đối (Việt Nam), xylene và paraformaldehyde (Trung Quốc) trong quy trình lai Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả sau:
Trang 3Bảng 4.9: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất
Mẫu
WSSV
Mô học PCR
ISH
1 + + Mẫu dương (+) và rất rõ
khi quan sát dưới KHV
Mẫu dương (+) và rõ khi quan sát dưới KHV
Mẫu dương (++), lát cắt mẫu trên lame không bị trôi và rất rõ khi quan sát dưới KHV
Mẫu dương (++), cấu trúc
mô rõ khi quan sát dưới KHV
Mẫu dương (+++), lát cắt không bị trôi và nhuộm màu rõ
Mẫu dương (+++), cấu trúc mô rất rõ khi quan sát dưới KHV
Mẫu dương (+++), cấu trúc mô rất rõ và lát cắt không bị trôi
Không phát hiện tín hiệu lai, mẫu không bị nhiễm bẩn và chỉ bắt màu thuốc
Trang 4nhuộm bổ sung nhuộm bổ sung
Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng tiến hành lai theo trường hợp này cho kết quả lai tốt trên cả ba mẫu và hai đối chứng khi quan sát dưới KHV quang học Kết quả thí nghiệm dựa vào phương pháp ISH cho kết quả trùng hợp hoàn toàn với mô học và PCR, xác suất trùng hợp đạt đến 100% (3/3) Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu được không có sự khác biệt nhiều giữa thí nghiệm theo quy trình
và hóa chất của bộ kit với thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhưng có thay đổi một số hóa chất thông dụng rẻ tiền hơn Đây là một bước thành công mới, tạo tiền đề cho việc phát triển phương pháp ISH phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện Do đó, chúng tôi sử dụng các hoá chất thay thế này trong các thí nghiệm tiếp theo sau để giảm bớt chi phí trong chẩn đoán và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện
IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh
Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệm được tiến hành xử lý nhanh dùng chung cho kiểm tra mô học và ISH Mẫu được xử lý, đúc và cắt và đính trên 4 lame, hai lame dùng để nhuộm kiểm tra mô học và hai lame còn lại dùng cho ISH Sau khi thực hiện chẩn đoán bằng mô học truyền thống và PCR cho kết quả dương tính, mẫu đó sẽ được dùng để lai theo quy trình của bộ kit Chúng tôi tiến hành trên 5 mẫu tôm postlarvae và
5 mẫu tôm thương phẩm và thu được kết quả như sau:
Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae
học PCR
ISH
Nhận xét Lần 1 Lần 2
2 + + + + Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi
Trang 5Kết quả trên tôm thương phẩm Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thương phẩm
học PCR
ISH
Nhận xét Lần 1 Lần 2
1 + ++ ++ ++ Cấu trúc mô của mẫu rất rõ, nhuộm
màu tốt
2 + ++ ++ ++ Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi
5 + + + + Cấu trúc mô mờ, lát cắt không bị
Trang 6Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh
chứng
âm
chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ sung
Qua hai bảng kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng kết quả chẩn đoán thu được
từ ba phương pháp trên trùng hợp hoàn toàn với nhau Ở hai mẫu tôm postlarvae (mẫu
1 và 4) và một mẫu tôm thương phẩm (mẫu 5) khi xử lý nhanh cho kết quả lai chưa tốt
có thể do một số khâu trong quy trình xử lý mẫu chưa được thực hiện tốt Mẫu số 5 trên postlarvae và mẫu số 4 trên tôm thương phẩm cho kết quả lai tốt, nhưng cấu tạo
mô không rõ có thể do ta thực hiện xử lý mẫu chưa tốt làm hư cấu tạo của mô Điều này cũng có thể do trong quá trình lai, chúng ta cắt mẫu bằng Proteinase K quá lâu hoặc thao tác cắt mẫu chưa được thực hiện tốt nên cấu trúc mẫu mô không còn rõ như ban đầu
Như vậy qua hai lần thực hiện thí nghiệm như trên, chúng tôi thu được kết quả lai đều dương tính Khi đối chiếu với kết quả lai trong trường hợp mẫu xử lý theo quy trình bình thường, chúng tôi nhận thấy rằng kết quả lai trong cả hai quy trình xử lý mẫu không khác nhau Các mẫu làm theo quy trình xử lý nhanh, khi quan sát dưới kính hiển vi đều cho kết quả tương đối rõ và đẹp Nếu làm theo quy trình xử lý mẫu nhanh thì cả quá trình xử lý mẫu chỉ mất khoảng 3 – 4 giờ thay vì trước đây chúng tôi làm theo quy trình xử lý mẫu bình thường mất khoảng 12,5 giờ, thời gian được rút ngắn rất nhiều nhưng kết quả lai không khác nhau Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy trình xử lý nhanh này trong chẩn đoán bằng phương pháp ISH, giúp rút ngắn được thời gian rất nhiều
Trang 7Quy trình xử lý mẫu nhanh có ưu điểm là rút ngắn được thời gian xử lý mẫu rất nhiều, tuy nhiên nó có một số nhược điểm so với phương pháp xử lý mẫu bình thường Mẫu được xử lý theo phương pháp này dễ bị hư cấu trúc của mô, nguyên nhân của sự
cố này là do nước trong mẫu mô chưa được khử hoàn toàn làm cho mô và tế bào bị co lại hoặc làm thành phần cấu tạo trong mô bị thay đổi Một lý do khác làm hư cấu trúc của mô là do cồn trong mô không được tẩy hoàn toàn, mẫu mô không trong suốt nên rất khó quan sát cấu tạo của mô dưới kính hiển vi Cả giai đoạn khử nước và tẩy cồn ra khỏi mô nếu không được thực hiện tốt thì giai đoạn ngấm paraffin cũng bị thất bại Do
đó, khi áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh, ta phải thật cẩn thận khi thao tác, làm tốt các giai đoạn quyết định như giai đoạn chuyển từ cồn tuyệt đối qua xylene và từ xylene qua paraffin Nếu tuân thủ đúng các bước này, mẫu mô thu được sau xử lý sẽ giống với mẫu mô xử lý theo quy trình xử lý bình thường
IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai
Nếu lai theo quy trình của bộ kit thì probe phải được biến tính ở 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C cho đến khi cho lên mô lai Khi lai, ta cho mẫu dò lên mẫu mô và thực hiện biến tính một lần nữa ở 950C trong 6 phút Trong thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện biến tính mẫu lai và probe đồng thời trên lame ở 950C trong 6 phút Quy trình này được thực hiện trên bàn lai có điều chỉnh nhiệt độ Mẫu thực hiện thí nghiệm này được xử lý theo quy trình xử lý bình thường và đã được phương pháp
mô học và PCR xác nhận là dương tính với WSSV Thí nghiệm thực hiện như bố trí trên và thu được kết quả sau hai lần thực hiện như sau:
Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trước khi lai trên
postlarvae
ISH
Nhận xét Lần 1 Lần 2
Trang 8Kết quả trên tôm thương phẩm Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm thương phẩm
ISH
Nhận xét Lần 1 Lần 2
không bị trôi
sung nhuộm không rõ
không bị trôi
Trang 9đa số cho kết quả trùng hợp với phương pháp mô học và PCR Chỉ có một trường hợp mẫu số 3 trên tôm postlarvae cho kết quả lai ISH là âm trong khi đó kết quả mô học và PCR là dương tính Điều này có thể do mẫu dò của chúng ta đã bị bất hoạt nên không bắt cặp được với trình tự đích có trong mẫu, nhưng khả năng này rất ít xảy ra vì trên đối chứng dương chúng tôi vẫn nhận được tín hiệu lai rất tốt Sự không phù hợp này cũng có thể do trong quá trình làm PCR bị ngoại nhiễm hoặc khi làm mô học có thể bị nhầm lẫn với một tác nhân gây bệnh khác nhưng cũng có biểu hiện tương tự như bệnh đốm trắng
Dựa vào kết quả trên, ta thấy tỷ lệ tương thích của phương pháp ISH thực hiện theo quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame với mô học và PCR là 90% (9/10), tỷ lệ này khá cao và chính xác Khi so sánh với trường hợp lai bình thường theo quy trình của bộ kit, thì hình dạng cấu trúc mô không khác nhau giữa hai trường hợp khi chúng tôi quan sát dưới kính hiển vi quang học Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên mẫu mô khi thực hiện lai Cách làm này vừa đơn giản, dễ thực hiện lại vừa tránh được khả năng gây sốc probe khi lai, probe chỉ được biến tính một lần thay vì hai lần như trong quy trình của bộ kit
IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai
Sau khi thực hiện lai theo từng trường hợp riêng rẽ, chúng tôi đều thu được kết quả rất tốt, nhưng khi chúng tôi áp dụng đồng thời hai quy trình trên vào trong chẩn đoán thì sẽ cho kết quả ra sao? Do đó chúng tôi kết hợp cả hai quy trình trên để chẩn đoán bệnh đốm trắng, thực hiện trên 5 mẫu tôm thương phẩm và 5 mẫu tôm postlarvae
Trang 10có kết quả mô học và PCR dương tính với WSSV Kết quả sau hai lần thí nghiệm như sau:
Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm postlarvae
ISH
Nhận xét Lần 1 Lần 2
chỉ nhuộm màu bổ sung
Kết quả trên tôm thương phẩm Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai trên tôm thương phẩm
ISH
Nhận xét Lần 1 Lần 2
Trang 11Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến
tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40
không bị trôi
sung nhuộm không rõ
chỉ nhuộm màu bổ sung Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng khi kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh và biến tính mẫu và probe trên cùng một lame khi thực hiện lai đều cho kết quả trùng hợp với kết quả của phương pháp PCR và mô học Mức độ trùng hợp giữa ba phương pháp đạt 100% sau hai lần lặp lại thí nghiệm Mẫu mô thu được sau khi lai đa
số rõ nhưng có một số trường hợp mẫu mô không rõ do thao tác thực hiện chưa tốt, hoặc do hóa chất rửa mẫu lai mất hoạt tính hay có thể do nhuộm màu bổ sung chưa đạt yêu cầu…nhưng những điều này không ảnh hưởng nhiều đến kết quả lai và chúng tôi
được
Trang 12Sau thí nghiệm này, chúng tôi có thể áp dụng cả quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame vào quy trình chẩn đoán chính thức khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú Nhờ hai quy trình biến đổi này
mà chúng tôi có thể rút ngắn đƣợc thời gian chẩn đoán mầm bệnh rất nhiều, thao tác đơn giản hơn và giảm đƣợc khả năng gây sốc probe nhƣ quy trình của bộ kit đã khuyến cáo
Trang 13Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện
đã biến tính lên mẫu và biến tính mẫu ở 700C trong 5 phút
Rửa và phát hiện tín hiệu lai
Lai, thực hiện biến tính
mẫu và probe đồng thời
trên lame ở 950
C trong 5 phút, ủ qua đêm ở 420C
Rửa và phát hiện tín hiệu lai
Xử lý mẫu trước khi lai
Qua các kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi đưa ra được quy trình lai tối ưu để phát hiện WSSV và TSV có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Viện:
Trong đó, các bước chuẩn bị mẫu lai trên hai đối tượng hoàn toàn giống nhau
và gồm các bước như: cố định mẫu, xử lý mẫu, đúc mẫu, cắt mẫu và đính mẫu lên lame dương Giai đoạn xử lý mẫu trước khi lai trên mẫu tôm sú và mẫu TCT là giống nhau là mềm hóa mẫu lai bằng proteinase K (15 phút trên postlarvae và 17 phút trên tôm thương phẩm) Giai đoạn lai được thực hiện như mô tả trên sơ đồ, thể tích dung dịch lai tối ưu trong hai trường hợp là 75 µl Giai đoạn rửa và phát hiện các tín hiệu lai cũng hoàn toàn giống nhau trên hai đối tượng và thực hiện các bước như trong quy trình của bộ kit ở mục III.5
Trang 14IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với phương pháp
mô học và PCR
IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei: Các mẫu tôm postlarvae và tôm thương
phẩm có dấu hiệu bệnh được thu ngẫu nhiên từ các trại sản xuất giống và các ao nuôi thương phẩm ở Phú Yên, sau khi thực hiện chẩn đoán theo quy trình của ba phương pháp mô học, PCR và ISH như trên, chúng tôi thu được kết quả như sau:
IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae
Trang 15Sau khi thực hiện thí nghiệm so sánh trên, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các mẫu đem kiểm tra đều âm tính với TSV Nhìn chung, kết quả chẩn đoán của ba phương pháp đa số trùng hợp với nhau, kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp nhau 100% (15/15) Trong số 15 mẫu trên thì có 5 mẫu đầu có kết quả PCR dương nhưng
mô học và ISH đều âm tính Hiện tượng không trùng hợp này có thể do hiện tượng dương tính giả của PCR, hoặc có thể do chúng tôi thực hiện thu mẫu chưa đảm bảo chính xác, mẫu thu được chưa đại diện được cho cả quần thể tôm nuôi tại trại giống nên cùng một mẫu khi chia thành nhiều phần, mỗi phần thực hiện một phương pháp chẩn đoán khác nhau thường cho kết quả không trùng hợp với nhau Hiện tượng này cũng có thể do probe bị bất hoạt nhưng trường hợp này rất ít xảy ra vì khi lai chúng tôi
có thực hiện song song một đối chứng dương và một đối chứng âm, kết quả vẫn phát hiện tín hiệu lai trên đối chứng dương và đối chứng âm không bị nhiễm tạp; điều này một lần nữa khẳng định tính ổn định của phương pháp ISH Trong thí nghiệm này kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp với nhau hoàn toàn nên ta có thể nói rằng hai phương pháp này có tương quan với nhau, trong đó ISH có độ ổn định và độ chính xác cao hơn mô học
IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm
Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thương phẩm
Trang 16Trên tôm lớn sau khi thực hiện thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng mức
độ tương đồng giữa mô học và ISH là 73,33% (11/15), giữa mô học và PCR là 66,67% (10/15) và giữa PCR với ISH là 80% (12/15) Nhìn vào tỷ lệ này, chúng tôi nhận thấy
độ tương thích giữa PCR với ISH tương đối cao và ổn định hơn so với mô học Tuy nhiên, cả ba phương pháp trên đều có thể dùng để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm nuôi, trong đó PCR và ISH có độ chính xác, độ nhạy và ổn định hơn mô học truyền thống rất nhiều Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu được không chênh lệch nhiều giữa ba phương pháp, một số trường hợp không trùng hợp giữa ba phương pháp có thể được giải thích như sau:
Trường hợp mô dương, ISH dương và PCR âm như ở mẫu số 4 và 5 Trường hợp này có thể do thao tác thực hiện RT – PCR không chính xác, cũng có thể là do lượng RNA tách chiết quá thấp, tạp nhiễm nhiều hay có thể do có sự hiện diện của một tác nhân ức chế phản ứng PCR nên không phát hiện được tác nhân gây bệnh trong mẫu Ngoài ra hiện tượng này cũng có thể do tính đa hình của virus Taura, mặc dù tính
đa hình này rất ít xảy ra nhưng khi nó xuất hiện thì có thể gây ra hiện tượng âm tính giả
Trường hợp mô dương, PCR dương nhưng ISH âm ở mẫu số 7 Hiện tượng này
có thể mẫu dò bị bất hoạt nhưng điều này không thể xảy ra vì có tín hiệu lai trên đối chứng dương Vì vậy, nguyên nhân của hiện tượng này có thể do hiện tượng ngoại
