Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) và cây rau má (Centella asiatica)

Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) và cây rau má (Centella asiatica), luận án hoá học dành cho các bạn học tập, nghiên cứu cũng như tìm hiểu trong quá trình học.

MỞ ĐẦU

Công nghiệp phát triển, đời sống con người được nâng cao nhưng mặt trái của nó là thảm họa môi trường Dẫn đến, con người gặp phải các chứng bệnh nan y như ung thư, HIV/AIDS, bệnh tim mạch hay là những dịch bệnh phức tạp, nguy hiểm mới xuất hiện gần đây: viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, v.v đồng thời một số loài động, thực vật

bị đưa vào sách đỏ và tuyệt chủng Thực tế đó đã thúc đẩy các nhà khoa học phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới có tác dụng chọn lọc, hiệu quả cao và giá thành rẻ hơn để điều trị các bệnh hiểm nghèo cũng như tìm cách bảo vệ, bảo tồn các loài động thực vật quý hiếm

Một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng, có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con người, gia súc và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên Trải qua hàng triệu năm tiến hóa các hợp chất thiên nhiên có khả năng tương thích với nhau dễ dàng, tương đối phù hợp với cơ thể sống, ít độc hơn và đặc biệt là thân thiện với môi trường

Từ thiên nhiên người ta đã phân lập được rất nhiều hợp chất có hoạt tính quý để làm thuốc chữa bệnh phục vụ cho đời sống xã hội Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính được sử dụng trực tiếp để làm thuốc, ngoài ra chúng

còn được dùng làm "Mô hình" cho các nghiên cứu tổng hợp và bán tổng hợp

các loại thuốc mới

"Mô phỏng tự nhiên" là một trong những con đường đặc biệt hiệu quả

và kinh tế để tìm ra các loại thuốc mới nhằm chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng chính vì vậy để tạo ra các loại biệt dược, thực phẩm bổ dưỡng

phục vụ đời sống con người thì "Nghiên cứu sàng lọc về mặt hóa học nguồn

tài nguyên thiên nhiên" là một trong những hướng nghiên cứu hiện đang

được các nhà khoa học ở trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên

có nguồn thực vật rất đa dạng và phong phú với khoảng 12.000 loài, đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá Trong số đó đã có rất nhiều loại cây cỏ được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng, tuy nhiên hiệu quả kinh tế vẫn còn hạn chế bởi việc khai thác và sử dụng hầu như là vẫn dựa vào kinh nghiệm dân gian Trong những năm gần đây, ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên đã được trang bị nhiều phương tiện hiện đại, các phương pháp nghiên cứu tiên tiến đã được áp dụng nên nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của một số chi, loài, họ thực vật của Việt Nam đã được công

bố, góp phần làm sáng tỏ tính năng cũng như tăng cường hiệu quả trong khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên này

Qua tra cứu họ Cau, trên thế giới có khoảng 236 chi, 3500 loài Ở Việt Nam bao gồm 5 phân họ, 8 tông, 15 phân tông, 39 chi, 103 loài, 2 thứ Theo thống kê của TS Trần Thị Phương Anh [1] thì họ Cau ở Việt Nam có 39 chi,

103 loài và 2 thứ, trong đó phát hiện thêm 26 loài trong họ Cau mới thấy ở Việt Nam, đồng thời bổ sung thêm một số loài mới cho khoa học, có nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam, nhiều loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng và được ghi trong Sách đỏ Việt Nam Trong họ Cau có rất nhiều cây đã gắn liền với đời sống của nhân dân ta từ lâu đời Ví dụ: Cây cau, cây dừa, cây cọ, cây song, cây mây, Bao đời nay, người Việt Nam cũng như một số nơi trên thế giới như Trung Quốc, Australia, đã sử dụng các loài trong họ cau để làm nhà, sản xuất đồ thủ công mỹ nghệ, làm thuốc, làm thực phẩm vv Tuy nhiên cho đến nay hầu như có rất ít công trình nghiên cứu về cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của các cây trong họ Cau của Việt Nam được công

bố

Cây rau má là loài cây rất thường thấy ở các vùng có khí hậu nhiệt đới Trong dân gian rau má được sử dụng để làm rau ăn, làm nước giải khát và đặc biệt nó đã được sử dụng trong nhiều bài thuốc để trị một số các chứng bệnh thường gặp ở người và gia súc Ở Việt Nam, cây rau má cũng rất quen thuộc với chúng ta

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu

cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ

long (Livistona halongensis T.H Nguyen & Kiew) và cây Rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]”

Với mục tiêu như trên, luận án đặt ra nhiệm vụ là:

- Thu thập mẫu thực vật và xử lý mẫu

- Điều chế các cao chiết từ mẫu thực vật

- Phân lập các hợp chất từ các cao chiết mẫu thực vật

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

- Thử hoạt tính của một số dịch chiết và hợp chất phân lập được

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Chi Cọ (Livistona R Br )

Trên thế giới, chi Cọ (Livistona R.Br.) thuộc họ Cau (Arecaceae) có

khoảng 36 loài, phân bố ở Nam và Đông Nam châu Á, Oxtrâylia, Châu Phi

và rải rác một số khu vực trên thế giới [2] Ở Việt Nam, cọ là những cây mọc hoang phổ biến ở những vùng đồi núi, trung du Chúng còn được trồng làm cây cảnh ở nhiều nơi, và gồm có bốn loài như sau :

- Cọ hạ long (Livistona halongensis T.H Nguyen & Kiew)

- Cọ [Livistona saribus (Lour.) Merrie ex A Chev.], còn có tên kè đỏ

- Cọ xẻ [Livistona chinensis (Jacq.) R.Br.], còn gọi là kè tàu

- Kè bắc bộ (Livistona tonkinensis Magalon)

Sau đây chúng tôi xin giới thiệu tóm tắt một số loài của chi cọ:

1.1.1 Đặc điểm thực vật và ứng dụng của chi Cọ

1.1.1.1 Cây cọ xẻ (Livistona chinensis):

Cây cọ xẻ được giới thiệu tại hình 1.1

Cây cọ xẻ còn gọi là kè tàu có nguồn gốc ở Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Nam Nhật Bản, Đài Loan và Việt Nam, được trồng rộng rãi ở nhiều vùng á nhiệt đới, nhiệt đới và ở nhiều đảo biển Ở Việt Nam, cây phân bố tại Yên Bái, Tuyên Quang (Chạm Chu), Bắc Kạn, (Chợ Đồn), Thái Nguyên (Thần

Sa, Đại Từ), Quảng Ninh (Ba Mùn), Hà Nội, Ninh Bình ), Kon Tum (Đắc

Glei) Tên gọi Livistona chinensis do nhà khoa học người Áo Nicolaus

Joseph von Jacquin phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc và công bố dưới tên

khoa học Latania chinensis Jacq (1801) Về sau nhà khoa học người Anh

Robert Brown cùng nhà khoa học người Đức Karl Friedrich Philipp von

Martius công bố lại dưới tên Livistona chinensis (Jacq.) R.Br ex Mart (1838); trong đó tính ngữ “chinensis” có nghĩa là ở Trung Quốc, tên tiếng

Anh là Chinese fan palm hoặc Chinese fountain palm Ở Trung Quốc nó được gọi là Bồ Quì [3] Cây mọc đơn độc cao 8 – 15 m, đường kính 20 – 30

cm, hình trụ, nhẵn, có nhiều vòng do sẹo lá để lại Lá hình quạt, xẻ thuỳ hình chân vịt thành nhiều thuỳ Bẹ lá có sợi, mép lá có gai dẹp, cong Lưỡi gốc phiến lá hình bán nguyệt có chóp Thuỳ lá hình đường, đỉnh thuỳ xẻ đôi sâu

10 – 15 (30) cm, các thuỳ rủ xuống Cụm hoa phân nhánh 2 – 3 lần, lá bắc cỡ

26 x 4 cm, 2 sống, xẻ một bên, không có lông, nhánh con mảnh, dài 10 – 15

cm Hoa thành nhóm 4 – 5 hoa đính trên mấu lồi Hoa hình cầu, có cạnh, đường kính khoảng 2 mm; đài 3, tràng hợp ở gốc, xẻ 3 thùy, hình tam giác; nhị 6, chỉ nhị ngắn, bao phấn hình bầu dục; bầu hình trứng ngược; vòi nhuỵ ngắn Quả hình bầu dục, cỡ 1 – 1,5 x 0,8 – 1 cm có màu xanh lục Hạt 1, hình bầu dục [1] Cây ra hoa tháng 4, có quả tháng 5 – 6 [4] Thu hái hạt suốt mùa thu, mùa đông, thu hái lá và rễ quanh năm, rửa sạch, phơi khô

1.1.1.2 Cây cọ (Livistona saribus (Lour.) Merrie ex A Chev.):

Cây cọ được giới thiệu tại hình 1.2

Là một loài cây mọc đơn độc, thân cột, mang lá tập trung trên đỉnh thân tạo thành một vòm tán hình cầu Thân cao 20 – 25 m, đường kính 15 – 30 cm, hình trụ, khi non có nhiều cuống lá còn tồn tại, sau nhẵn, có sẹo do lá để lại

Về tên gọi, ngoài cọ còn có nhiều tên khác nữa như cọ đỏ, cọ nam, kè, lá gồi…, tên tiếng Trung là Đại diệp Bồ quì, tên tiếng Anh là Taraw palm Xét

về nguồn gốc, vào giữa thế kỉ 19 người ta cho rằng nó là loài được phát hiện đầu tiên ở Việt Nam Năm 1836, nhà khoa học người Hà Lan Karl Ludwig

von Blume đã công bố tên khoa học là Saribus cochinchinensis Đến năm

1837, nhà khoa học người Đức Karl Friedrich Philipp von Martius công bố

lại dưới tên khoa học là Livistona cochinchinensis Năm 1919, nhà khoa học

người Hoa Kỳ Elmer Drew Merril cùng nhà khoa học người Pháp Auguste

Jean Baptiste Chevalier đã công bố lại tên khoa học là Livistona saribus [5]

Ở nước ta, cây mọc hoang vùng đồi trung du miền Bắc và miền Trung, là cây đặc sắc của rừng ven suối, đất ẩm vùng núi tới 1500m Cây Phân bố rải rác trong rừng nhiệt đới ở Hà Giang (Bắc Quang), Bắc Kạn (Na Rì), Yên Bái,

Hình 1.2 Cây cọ

Hà Tây (Ba Vì: Thủ Pháp), Hà Nội, Quảng Trị, Lâm Đồng (Langbiang), Đồng Nai (Biên Hoà), TP Hồ Chí Minh (Thủ Đức) Cây có dáng đẹp trồng trang trí trong các khu du lịch, resort, công viên hoặc làm cây cảnh nhỏ trồng ở chậu dùng trang trí nội thất Cây ra hoa vào tháng 12-2, ra quả vào tháng 5-7 hàng năm [4]

1.1.1.3 Cây cọ bắc bộ (Livistona tonkinensis):

Là cây đặc hữu của Việt Nam Thân thẳng, cao 25 – 30 m, đường kính khoảng 25 cm Khi non có nhiều cuống lá còn tồn tại, sau nhẵn, có sẹo do lá

để lại Lá xẻ thuỳ hình chân vịt cách gốc 80 – 90 cm thành 50 – 60 thuỳ Bẹ

lá có sợi Mép cuống có gai dài 2,5 cm, lưỡi gốc phiến hình bán nguyệt có chóp, cỡ 2 x 2 cm Thuỳ hình đường, thuỳ to nhất cỡ 130 – 150 x 4 cm, đỉnh thuỳ xẻ đôi sâu khoảng 2 cm, thuỳ thẳng đứng Cụm hoa dài 60 – 70 cm; lá bắc cỡ 18 x 3 cm, 2 sống, xẻ một bên, có lông rải rác Nhánh con dài khoảng

20 cm, mảnh, hoa mọc trên những mẫu lồi Quả bầu dục, cỡ 2 – 3 x 1 – 1,5

cm, xanh màu ôliu, có cuống dài khoảng 2 mm Cây này mọc trên đồi, núi đất, có quả vào tháng 8 đến tháng 10 Cây được trồng nhiều ở Bắc Việt Nam: Bắc Kạn (Chợ Đồn), Sơn La (Xuân Nha), Lào Cai (Bảo Thắng), Tuyên Quang (Chạm Chu), Phú Thọ (Xuân Sơn), Thanh Hoá (Bá Thước, Quan Hoa) [1]

1.1.1.4 Cây cọ hạ long (Livistona halongensis):

Cây cọ hạ long được giới thiệu tại hình 1.3

Đây là một trong 13 loài thực vật đặc hữu của Vịnh Hạ Long, mới được phát hiện từ năm 1999, là loài mới cho khoa học, đặc trưng cho hệ sinh thái rừng núi đá trên đảo miền Bắc Việt Nam Cây đơn độc, cao đến 10 m, đường kính khoảng 20 cm Lá xẻ thuỳ hình chân vịt thành nhiều thuỳ; bẹ lá có sợi, mép lá có gai, mặt dưới có sọc màu vàng; lưỡi gốc phiến xẻ 2 thùy tròn Cụm hoa thẳng, dài hơn lá Cuống cụm hoa kéo dài nên cụm hoa dài hơn lá; lá bắc hình ống Hoa nhỏ, hình trứng, màu vàng kem nhạt, vươn lên trên tán; đài nhẵn, hình ống, đỉnh xẻ 3 thuỳ Tràng dài khoảng 2 mm, xẻ 3 thuỳ; nhị 6 dài

khoảng 1 mm; bầu hình bầu dục, vòi nhuỵ nhỏ Quả hình cầu, đường kính 1 – 1,2 cm, màu xanh đậm sáng

Cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng 6, có quả vào tháng 7 [1] Cây có hình

thái đẹp, thích hợp làm cây cảnh, trồng ở các khu du lịch nên có giá trị kinh

tế cao, nhưng số lượng còn lại rất ít [6]

1.1.1.5 Ứng dụng của một số loài trong chi cọ:

Các loại cọ xẻ (Livistona chinensis) và kè nam (Livistona saribus; L

cochinchinensis Mart.) có hình dáng đẹp nên ở nước ta và một số nước trồng

chủ yếu để làm đai xanh, tôn tạo cảnh quan cho nhiều không gian xanh đô thị, thường gặp nhất là ở các công viên, khu văn hóa, các biệt thự Ở một vài vùng cây cọ xẻ, kè nam mọc tự nhiên, người dân còn lấy lá non chầm nón, kết áo đi mưa (tơi); lá già có thể dùng để lợp nhà, đan túi xách, đan mũ, dệt chiếu, làm quạt Thân già được dùng làm cột, làm máng nước Gốc chồi

Hình 1.3 Cây cọ hạ long

lá có thể dùng làm rau ăn Quả cọ có thể nấu chín để ăn hoặc ép lấy dầu, và là một món đặc sản của miền tây Nghệ An [10]

Rễ cây kè nam dùng chữa bạch đới, khí hư, thường phối hợp với những

vị khác như rễ cau, rễ tre, rễ cây móc với lượng bằng nhau, sắc đặc uống làm

2 lần trong ngày Liều dùng hàng ngày 6 - 12 g [11]

Theo đông y, cây cọ xẻ (Livistona chinensis) có vị ngọt và chát, tính bình, hạt làm tiêu ung thư, khối u, rễ có tác dụng giảm đau [11, 12] Y học

dân gian Trung Quốc dùng hạt cọ xẻ chữa ung thư mũi, họng, thực quản, ung thư rau, bệnh bạch cầu Rễ cây này được dùng để trị hen suyễn, giảm đau do tiêm Liều dùng 15-30 g, dạng thuốc sắc Lá để trị chảy máu tử cung 1, 11] Đơn thuốc chứa cọ xẻ ở Trung Quốc:

- Chữa ác tính: Dùng hạt cọ xẻ 30 g, nấu với thịt lợn nạc 30 g trong 2 giờ

- Chảy máu tử cung: Dùng cuống lá cọ xẻ đốt thành tro, hoà vào nước uống, hoặc sao lên và nấu nước uống

- Trong vị thuốc dân gian, hạt cây cọ xẻ L chinensis R.Br có tên “Quỳ

thụ tử”

1.1.2 Tình hình nghiên cứu về chi cọ

1.1.2.1 Thành phần hóa học

* Nghiên cứu trong nước:

Trước đây, hầu như chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu về các cây thuộc chi cọ Đầu năm 2011, Giang Thị Kim Liên và cộng sự thông báo trên tạp chí Hoá học đã phân lập được 4 hợp chất từ các dịch chiết của

quả cọ xẻ (Livistona chinensis), gồm: 5,7,4’-trihydroxy–3’,5’–dimetoxy–

flavon (tricin, 1), 2–(hydroxy–metyl) phenyl–D–glucopyranosid (salicin, 2), stigmast–5,22–dien–3β–O–β–D–glucopyranosid (stigmasterol glucosid, 3),

saccharose (4) [13]

8 7 6

OH O

2' 3' 4'

5' 6'

OCH3OH

OCH3

1 Tricin

O O

HO

OH HO

OH HO

1' 2' 3'

15

16 17 18

20 22 23 24 28 29

25 27

26

21 19

1

3 Stigmasterol glucosid

O O

HO OH

HO

HO

1

2 3 4 5

3' 4'HO

4 Saccharose

* Nghiên cứu trên thế giới:

Trong chi cọ, cây cọ xẻ được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học

và hoạt tính sinh học Singh, R.P và Kaur G (Ấn Độ) nghiên cứu định tính thành phần hoá học cho thấy rằng các hợp chất phenol có hàm lượng cao

[14]

Maurer – Menestrina và cộng sự (Brazil) đã tách và xác định cấu trúc

của một betaxylan (polysacharid) có nhiều nhóm thế từ nhựa quả cọ xẻ [15]

Tao Yuan và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc 14 hợp chất

trong quả cọ xẻ, chúng gồm 3 chất mới là hai depsidon (5, 6), một benzofuran (7) và 11 hợp chất đã biết là: 3-stilben, 4-steroid, 3-flavan-3-ol,

và 1 alkaloid : trans-3,5,3',5'-tetrahydroxy-4'-metoxy-stilben (8), 3,5,3',5'-tetrahydroxy-4'-metoxy-stilben (9), 4-hydroxy-3',5'-dimetoxystilben

cis-(10), ergosta-6,22-dien-3β-ol (11), ergosta-6,9,22-trien-3β-ol (12), 24-etylcholest-4-en-3-on (13), 6β-hydroxy-

5α,8α-epidioxy-22E-stigmast-4-en-3-on (14), catechin (15), epicatechin (16), epiafzelechin (17), terreusinon (18) [16]

O O

HO

HO

OH

H 5

6

1 2

3

9

4

6' 5'

4' 3' 2'

7

1'

7' 8

5 Depsidon 1

O

O O

2 3 9 4

6' 5'

4' 3' 2'

7

1'

7' 8

2 3a

6 7 1a 3

Từ quả cọ xẻ, Xiaobin Zeng, và cộng sự đã tách được 11 hợp chất

flavonoid với 3 chất mới (19, 20, 21) và 8 chất đã biết là: tricin (1), quercetin

3-O-β-D-glucopyranosid (22), isorhamnetin 3-O-β-D-glucopranosid (23), rhamnazin 3-O-β-D-glucopyranosid (24), (-)-epiafzelechin (25), (+)–catechin (26), 2R,3R-3,5,7,3’,5’ pentahydroxyflavan (27), (–)-catechin (28) [17]

O HO

OH

OH

OH OH

21 2R,3R-3,5,6,7,8,3',5'-heptahydroxyf lavan

Đặc biệt, từ cây cọ úc (Livistona australis), năm 2009, Samy K

El-Desouky (Ai cập) và cộng sự đã phân lập từ lá 1 chất mới là dẫn xuất

pyranon: 3-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-6-metyl-4H-pyran-4-on (29) [18]

Năm 2011, Mona E.S Kassem tại trung tâm nghiên cứu quốc gia (Ai cập) cùng các cộng sự đã phân lập ra 1 hợp chất muối mới : flavon glycosid

sunphat (30) cùng 14 hợp chất flavonoid đã biết, gồm:

genkwanin-6-C-β-glucopyranosid (31), genkwanin-8-C-β-D-genkwanin-6-C-β-glucopyranosid (32), isovitexin (33), isoorientin (34), orientin (35), tricin 7-O-β- D-glucopyranosid (36) tricin 4'-O-β-glucopyranosid (37) luteolin 7-O-β-glucopyranosid (38),

quercetin 3-O-  -glucopyranosid (22) quercetin 3-O-β-galactopyranosid (39),

tricin (1), quercetin (40), apigenin (41) và luteolin (42) [19]

30 Flavon sunphat glycosid

O

OH O

H Glu

1.1.2.2 Hoạt tính sinh học

Tại Việt Nam, Giang Thị Kim Liên và cộng sự đã báo cáo kết quả thăm

dò hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả cọ xẻ như sau: các dịch chiết

n-hexan và MeOH có hoạt tính ức chế sinh trưởng đối với vi khuẩn Gram (+)

Staphylococcus aureus với nồng độ IC50 lần lượt là 46,77 và 209,71 μg/ml Ở

hoạt tính chống oxi hoá, dịch chiết MeOH quả cọ xẻ có hoạt tính ức chế hoạt

động của enzym peroxydaza với IC50 là 61,22 μg/ml Dịch chiết MeOH quả

cọ xẻ có hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm

là: KB (ung thư biểu mô), MCF – 7 (ung thư vú) và Hep-G2 (ung thư gan)

với các giá trị IC50 lần lượt là 68,04; 88,30 và 101,25 μg/ml [13]

Singh, R.P và Kaur G (Ấn Độ) thông báo hoạt tính chống tạo mạch

(antiangiogenic) và hoạt tính chống tăng sinh tế bào (antiproliferative) in

vitro của dịch chiết quả và hạt cọ xẻ Phân đoạn chứa các hợp chất phenol

của cây này có hoạt tính phá màu (hemolytic) [20] Nhóm tác giả trên cũng đưa ra giả thiết là hàm lượng cao các hợp chất phenol có trong cây cọ xẻ là

nguyên nhân gây chết các tế bào [14]

Nhóm nghiên cứu của Hoang W.C (Đài Loan) đã thông báo hoạt tính ức chế enzym sinh trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor, EGF) và enzym hoạt tính phân bào (Mitogen – activated protein kinase, MAPK) trong các dòng tế bào ung thư ở người bởi một phân đoạn protein kí hiệu là LC–X

được tách và tinh chế từ hạt cọ xẻ [21]

Zhong Z.G và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết ethyl acetat rễ cọ xẻ thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng đối với 7 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, bao gồm: ung thư dạ dày SGC 7901, ung thư máu L 1210, P 388D1, ung thư cuống họng Hela, ung thư gan hele 7404, ung thư hắc tố da (melanoma B16) và ung thư thần kinh chuột nhắt lai chuột cống NG 108 – 15

[22]

Dịch chiết cồn và dịch chiết nước hạt cọ xẻ đã được Cheng S và cộng

sự nghiên cứu rất chi tiết về hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu HL 60, kết quả cho thấy dịch chiết cồn có hoạt tính tốt hơn [23]

Muneo Tsukiyama và cộng sự (Nhật Bản) đã nghiên cứu tác dụng chống tích tụ mỡ, làm căng da, chống nhăn, giảm béo của dịch chiết hạt cọ xẻ Vì

vậy, có thể nghiên cứu để sử dụng dịch chiết hạt cọ xẻ trong mĩ phẩm [24]

Ngoài ra, các hợp chất khung flavan được phân lập ra từ quả cọ xẻ như 3

chất mới (19, 20, 21) và (-)-epiafzelechin (25), (+)-catechin (26), 3,5,7,3’,5’ penthahydroxyflavan (27), (–)-catechin (28) được biết đến với

2R,3R-các hoạt tính sinh học nổi trội như:

*.) Hoạt tính chống oxy hóa

Epicatechin (25) được báo cáo là có tác động giống insulin, với các hiệu

ứng bảo vệ hồng cầu (-) Epicatechin cũng chống lại sự peroxy hóa lipid và

ức chế sự tạo khối của các tiểu cầu (-) Epicatechin có tác dụng trong việc hỗ trợ kiểm soát các biến chứng thứ cấp của bệnh tiểu đường Các polyphenol nói chung cũng được chứng minh là hữu ích trong việc bảo tồn đảo tụy chuột

in vitro [25]

Catechin (26), là một hợp chất phenol chống oxy hóa tự nhiên Trong

nghiên cứu của Nakayma và cộng sự [26], catechin thể hiện hoạt tính ngăn chặn độc tính tế bào của O2- và H2O2 trên tế bào chuột đồng Trung Quốc V79

*.) Hoạt tính đối với hệ tim mạch:

Lavollay, Neumann, Porrot, đã chứng minh: Catechin (26) có tác dụng

mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, ngăn cản không cho protit của máu thẩm dịch qua các mô khác, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây

xuất huyết , gây phù thũng [27, 28]

Epicatechin (25), có thể cải thiện lưu thông máu và có lợi ích tiềm năng

cho sức khỏe tim [25]

*.) Hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư

Chất mới phân lập từ quả cọ xẻ: 2S,3S–3,5,7,3′,5′–pentahydroxyflavan

(19) có tác dụng ức chế đáng kể đối với dòng tế bào HL–60 với IC50 là 0,2 ±

0,01 và CNE–1 với IC50 là 1,0 ± 0,1 μM áp đảo so với các hợp chất tham

khảo trong các thử nghiệm [16, 17]

Hợp chất muối mới flavon glycosid sunphat (30), từ cây cọ úc (Livistona

australis) được Mona E.S Kassem (Ai cập) cùng các cộng sự phân lập ra, có

hoạt tính chống oxi hoá tốt, đã được đánh giá bằng cách xác định mức glutathion (GSH) của máu [19]

1.2 Chi rau má (Hydrocotyle; Centella)

1.2.1 Đặc điểm thực vật và ứng dụng

Rau má là cây thân thảo, mọc hoang ở khắp nơi, đặc biệt là ở những nơi đất ẩm Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, vào can,

tỳ vị có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu Rau

má thường dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí

hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy

Tham khảo các tài liệu [29, 30] thấy ở Việt Nam có 12 loài rau má:

* Rau má, liên tiền thảo: Centella asiatica (L.) Urb

* Rau má chevalier: Hydrocotyle chevalieri (Chern.) Tard

* Rau má trung quốc: Hydrocotyle chinensis (Dunn) Craib

* Rau má java, rau má lá to: Hydrocotyle nepalense Hook

* Rau má pételot: Hydrocotyle petelotii Tard

* Rau má dạng sanh cầu: Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss

* Rau má xiêm: Hydrocotyle siamica Craib

* Rau má nhỏ: Hydrocotyle sibthorpioides LamK

* Rau má bắc bộ: Hydrocotyle tonkinensis Tard

* Rau má wilford: Hydrocotyle wilfordii Maxim

* Rau má lá sen: Hydrocotyle vulgaris (L.)

* Rau má lá sen: Hydrocotyle bonariensis (L.)

1.2.1.1 Rau má java, rau má lá to:

Cây Rau má lá to được giới thiệu tại hình 1.4

Rau má lá to (Hydrocotyle nepalense Hook), (H javanica Thunb.),

thuộc họ Hoa tán [Apiaceae], nó còn được gọi là rau má dại, rau má rừng Cây thảo có thân mọc bò trên mặt đất, dài 0,5-1,2m Rau má lá to thường thấy ở các nước như Nêpan, Ấn Ðộ, Trung Quốc, Malaixia, Inđônêxia và Việt Nam Ở nước ta, cây này thường thấy mọc tập trung thành từng đám lớn

ở những nơi ẩm ướt tại các tỉnh Lạng Sơn, Hà Tĩnh, Bắc Thái, Khánh Hoà, Lâm Ðồng, Kontum, Ninh Thuận

Theo Đông y rau má lá to có vị cay, hơi đắng, nó có tác dụng chỉ huyết, chỉ thống tán ứ thanh nhiệt, thanh phế chỉ khái Ở một số nước như Ấn Ðộ, Sri Lanca, Malaixia, Trung Quốc cây này được dùng trị chứng thổ huyết, ho, đau bụng, gãy xương, lở ngứa, chó cắn, làm thuốc sát trùng Ðồng bào Dao dùng toàn cây, giã ra, rắc xuống nước để duốc cá

1.2.1.2 Rau má nhỏ, rau má mỡ

Tên khoa học: Hydrocotyle sibthorpioides Lam (H

rotumdifolia Roxb.), thuộc họ Hoa tán [Apiaceae] Cây thảo thân nhỏ sống

nhiều năm, mọc hoang ở những chỗ ẩm thấp ven đường đi, bờ ruộng ẩm Cây này thường được dùng để trị các chứng bệnh như: viêm gan vàng da, xơ gan

cổ trướng, sỏi mật, ỉa chảy, bệnh đường tiết niệu, sỏi niệu; cảm cúm, ho, ho

Hình 1.4 Cây rau má lá to

gà, viêm miệng, viêm hầu, sưng amidan viêm kết, trị viêm kẽ mô quanh móng tay, eczema, bệnh zona và chảy máu cam

1.2.1.3 Rau má lá sen:

Cây Rau má lá sen được giới thiệu tại hình 1.5

Cây rau má lá sen [Hydrocotyle vulgaris (L.)], Thuộc họ hoa tán

[Apiaceae], là loài mới được phát hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Loài rau má lá sen - Hydrocotyle vulgaris rất dễ bị nhầm với loài rau má

lá sen - Hydrocotyle bonariensis bởi chúng mọc xen lẫn với nhau và có hình

dạng rất giống nhau Hai loài cây cùng tên rau má lá sen này chỉ khác nhau ở

bộ phận hoa nên thường hay bị lẫn khi thu hái

1.2.1.4 Rau má thường (Rau má):

Cây Rau má thường được giới thiệu tại hình 1.6

Hình 1.5 Cây rau má lá sen

Trong số các loài rau má thì cây rau má thường [Centella asiatica

(Linn.) Urban], là loài rau má đã được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu

Cây rau má thường có tên khoa học là Centella asiatica (Linn.) Urban,

thuộc họ hoa tán [Apiaceae] Ngoài ra còn có các tên gọi khác như là Tích huyết thảo, Liên tiền thảo Ở nước ta cây này thường được gọi một cách đơn giản là rau má Rau má là loài cây thân thảo mọc bò, rễ mọc từ các mấu của thân, cây phân nhánh nhiều trên mặt đất Lá rau má có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từ các mấu Lá hình hơi tròn, có mép khía tai bèo, trông giống như những đồng tiền nhỏ xếp nối tiếp nhau Hoa ra ở nách lá, tạo thành cụm từ 1đến 5 bông, hình tán đơn, cuống hoa màu trắng hoặc phớt đỏ Quả dạng dẹt,

có sống khá rõ ràng

Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu Nó thường dùng để làm thức ăn bổ dưỡng, thuốc sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy, trị chứng cảm mạo phong nhiệt, thuỷ đậu sởi, sốt da vàng

Hình 1.6 Cây rau má thường

mặt, viêm họng, sưng amidan, viêm khí quản, ho, viêm đường tiết niệu, đái dắt, buốt

1.2.1.5 Cây rau má trong một số bài thuốc dân gian [31]

Trong dân gian ngoài việc sử dụng rất rộng rãi để làm rau ăn, làm nước giải khát , cây rau má còn được sử dụng trong một số bài thuốc dân gian như:

- Toa căn bản, ra đời vào khoảng năm 1950 do cụ Võ Văn Hưng, một lương y giàu kinh nghiệm ở Miền đông nam bộ soạn Sau đó được Bác sĩ Nguyễn Văn Hưởng, Bộ trưởng Bộ Y tế thời bấy giờ hưởng ứng và khuyến khích sử dụng Toa này gồm 10 vị là toa thuốc rất quen thuộc ở các Bệnh viện, trạm y tế từ bộ đội đến nhân dân, đã góp phần rất lớn trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hai thời kỳ kháng chiến chống Pháp và chống

Mỹ Toa căn bản có đặc điểm là không có độc tính, dễ sử dụng, có tác dụng kích thích tiêu hoá, nhuận gan, nhuận trường, lợi tiểu, giải độc và tăng cường sức đề kháng của cơ thể Tuỳ theo tình trạng của người bệnh và điều kiện của địa phương mà linh động gia giảm vị thuốc hoặc liều thuốc

Toa thuốc gồm: Rau má 8 g, rễ tranh 8 g, lá muồng trâu 4 g, cỏ mần chầu 8 g, cỏ mực 8 g, cam thảo nam 8 g, ké đầu ngựa 8 g, củ sả 4 g, gừng tươi 4 g, vỏ quít 4 g Đổ 3 chén nước sắc còn non một chén, uống lúc thuốc còn ấm

- Hoàn ích khí, dưỡng âm, trợ cơ, cứu đói Làm thuốc bổ dưỡng cho trẻ

em, người già hoặc ngưòi ốm mới khỏi hoặc dùng làm lương khô mang theo khi đi xa phòng Toa thuốc gồm 4 vị : Lá dâu tầm, Mè đen, Bột củ mài và Rau má Mỗi vị ngang nhau, tán bột làm hoàn, mỗi hoàn khoảng 5 g Mỗi ngày dùng 2 lần, mỗi lần 1 hoặc 2 hoàn

- Thoái nhiệt đơn Có công dụng giảm nhiệt, hạ sốt, trừ khát, trấn kinh Rau má 15%, Hoạt thạch 30%, Sắn dây 20%, Sài hồ 15%, Thạch cao 10%,

- Thuốc hạ huyết áp Rễ nhàu 16 g, Rễ kiến cò 12 g, Lá tre l2 g, Rễ tranh

12 g, Rễ cỏ xước 12 g, Rau má 16 g, Lá dâu 12 g, sắc uống, hoặc làm trà uống thay nước

- Sốt xuất huyết: Rau má 20 g, Cỏ mực 16 g, Rau sam 16 g, Đậu đen 16

g Sắc uống

- Chảy máu chân răng, chảy máu cam và các chứng chảy máu: Rau má

30 g, Cỏ nhọ nồi và Trắc bá diệp mỗi vị 15 g sao, sắc nước uống

- Khí hư bạch đới: Rau má phơi khô làm thành bột dùng 2 thìa cà phê uống mỗi sáng

- Thống kinh, đau lưng, đau bụng, ăn kém uể oải: Rau má 30 g, ích mẫu

8 g, Hương nhu 12 g, Hậu phác 16 g Ðổ 600 ml nước, sắc còn 200 ml chia 2 lần uống trong ngày

- Viêm hạnh nhân: Rau má tươi giã lấy nước cốt, hoà ít giấm nuốt từ từ

Ho, đái buốt, đái dắt: Rau má tươi giã lấy nước cốt uống hoặc sắc uống

- Viêm tấy, mẩn ngứa: Rau má trộn dầu giấm ăn, hoặc giã nát vắt lấy nước, thêm đường uống

- Thuốc lợi sữa: Rau má ăn tươi hay luộc ăn cả cái và nước

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về chi rau má

1.2.2.1.Thành phần hóa học

Từ những năm 1940, cây rau má đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Cho đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của các loài cây rau má cũng như hoạt tính sinh học của chúng

 Cây rau má lá sen (Hydrocotyle vulgaris)

Năm 2007, từ dịch chiết ethyl acetat của cây rau má lá sen (Hydrocotyle

vulgaris), nhóm tác giả Tôn Nữ Liên Hương (Trường Đại Học Cần Thơ) đã

phân lập được 16 hợp chất là hexenal, (2E)-hexenal, hexen-1-ol, santalen,

β-carnesen, β-cubeben và quercetin 3-O-galactopyranosid (43) [32]

O HO

O O

OH OH

OH HO

OH OH

1 sesquiterpenoid sulfid α-humulen, β-caryophyllen và bicyclo-germacren là

các chất chính trong tinh dầu cây này [35]

+ Triterpenoid :

Triterpenoid là thành phần quan trọng nhất của cây rau má Chất lượng của cây rau má được đánh giá bởi hàm lượng của triterpenoid có trong cây Các triterpen thu được từ cây rau má thường là các axit pentacyclic triterpen và glycosid, chứa khung ursan hoặc khung oleanan như: axit asiatic, asiaticosid, axit madecassic, madecassosid, brahmosid, axit brahmic, brahminosid, thankunisid, isothankunisid, centellosid, axit madasiatic, axit

+ Flavonoid:

Kết quả nghiên cứu của Zainol M K., Abd-Hamid A., Yusof S., cho thấy quercetin và kaempferol, catechin, rutin và naringin là các hợp chất phenolic chính của cây rau má [36]

+ Các hợp chất khác

Các hợp chất dạng polysaccharid, polyin, alken, acid amin, acid béo, sesquiterpen, alkaloid, sterol, carotenoid, tanin, chlorophyl, pectin, các muối

vô cơ, cũng đã được tìm thấy ở cây rau má

Từ cây rau má Centella asiatica (Linn.) Urban, sinh trưởng ở Srilanka,

nhóm tác giả người Nhật (Hisashi Matsuda - Trường đại học Dược,

Kyoto-Nhật Bản) đã phân lập được 8 tritecpen glycosid là: centellasaponin A (44), centellasaponin B (45), centellasaponin C (46), centellasaponin D (47), madecassosid (48), asiaticosid (49), asiaticosid B (50) và sceffoleosid (51)

[37]

O O

O

O O

O OH OH

OH HO HO

OH OH

CH3

OH

O

R OHHO

50: Asiaticosid B (R = OH) 51: Sceffoleosid (R = H)

Wan-joo-Kim và các cộng sự - Trường đại học Seoun, Hàn Quốc đã phân lập

được 4 tritecpen từ cây rau má của Indonesia là: madecassosid (52), asiaticosid (53), axit asiatic (54) và axit madecassic (55), với hàm lượng khá

cao [38]

54: Axit asiatic 55: Axit madecassic

Từ cây rau má (Centella asiatica), Yu Q.L và cộng sự đã phân lập được một

hợp chất mới là axit 2α,3β-20,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic (56) [39]

Năm 2007, nhóm này còn phân lập được docosyl ferulat, bayogenin,

axit olean-12-en-28-oic (57), axit urs-12-en-28-oic (58), axit D-gulonic (59) Đây là những chất lần đầu tiên

3β,6β,23-trihydroxy-được tìm thấy ở cây rau má [40]

58 59

Trong một thông báo khác, Y Quan Lin còn phân lập thêm được một

triterpnen mới là axit 2α,3 β,23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic (60) và một saponin mới là dẫn xuất ester của chất (60) - (61): 28-O- β -L-

rhamnopyranosyl (1→4)-O- β glucopyranosyl-(1→6)-O- β

62: Methyl 3,10-dien-5,7-diynyloxy] pentanoat

5-[(E)-9-hydroxy-1(1-hydroxyhexeyl)-2-metoxyundeca-1.2.2.2 Hoạt tính sinh học

Cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu công bố

về các hoạt tính sinh học của các chất được phân lập từ cây rau má, gồm có: hoạt tính gây độc tế bào, kháng ung thư, hoạt tính chống xơ vữa động mạch, hoạt tính giảm đau và kháng viêm, rút ngắn thời gian chữa lành vết thương, vết bỏng

*.) Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thư của axit asiatic và asiaticosid

- Ya-ling Hsu và cộng sự ở khoa Dược, trường đại học Y, Cao Hùng, Đài Loan lần đầu tiên nghiên cứu tác dụng chống ung thư của axit asiatic tách từ cây rau má đối với hai dòng tế bào ung thư vú là MCF-7 và MDA-MB-231, thấy rằng axit asiatic ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào thông qua

việc làm ngừng chu trình và gây ra giáng hoá của tế bào ung thư [43] Trong

bằng độc quyền sáng chế số US 2004/0097463A1 năm 2004, các tác giả đã

sử dụng axit asiatic hoặc asiaticosid để điều trị ung thư Các loại ung thư đã được nghiên cứu điều trị bao gồm: ung thư biểu mô, ung thư vú, ung thư túi mật, ung thư bàng quang, ung thư não, ung thư cổ, ung thư nhau thai, ung thư

dạ dầy, ung thư màng tử cung, ung thư thực quản, ung thư tủy xương Ngoài

ra các hợp chất này còn được sử dụng điều trị bệnh tăng sinh, ví dụ như bệnh

vảy nến, u mỡ, u tuyến (ví dụ polyp nội kết), bệnh đa u nang thận [44]

- Mi-Sook Dong và cộng sự ở trường đại học Seoul, Hàn Quốc đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào và chống xơ gan của 16 dẫn xuất của axit asiatic trong đó có axit asiatic và asiaticosid đối với tế bào gan HSC-T6 của chuột cống Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất của axit asiatic dao

động từ 5,5 µM đến trên 2000 µM [45] Yoshinati Ohnishi và cộng sự ở

trường đại học ToKushima Nhật Bản đã nghiên cứu hoạt tính hiệp đồng ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư ruột kết HT-29 khi sử dụng cùng với thuốc chống ung thư irinotecan hydrochlorid (CPT-11) Axit asiatic có tính độc tế bào với tế bào HT-29 tuỳ theo liều lượng Axit asiatic đẩy nhanh quá trình giáng hoá (tự chết của tế bào) HT-29 thông qua việc hoạt hoá men caspase-3 Việc sử dụng đồng thời axit asiatic và CPT-11 hoặc axit asiatic trước, sau đó đến CPT-11 sẽ có hoạt tính theo số cộng Tác dụng hiệp đồng

sẽ có nếu sử dụng CPT-11 trước, sau đó là axit asiatic Kết quả này cho thấy, axit asiatic có thể được sử dụng như một tác nhân làm tăng độ nhạy của tế bào ung thư ruột kết khi điều trị với CPT-11 hoặc như một tác nhân làm giảm

bớt tác dụng phụ không mong muốn của thuốc CPT-11 [46] Qua việc nghiên

cứu hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất của axit asiatic có thể thấy, các dẫn xuất có nhóm 28-COOH có hoạt tính cao hơn các dẫn xuất 28-COOR (R= CH3 hoặc glucosyl) Ba nhóm hydroxy ở vòng A cũng rất quan trọng cho hoạt tính kháng ung thư [46]

- Jung-Ae Kim và Cộng sự ở trường đại học Yeungram, Hàn Quốc đã nghiên cứu hoạt tính của axit asiatic trong việc ức chế ung thư da chuột bởi các tác nhân là 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) và 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) Nếu cho chuột dùng axit asiatic trước khi thử với TPA sẽ làm giảm đáng kể những tác động của TPA Sự có mặt axit asiatic sẽ ức chế sự tạo thành nitric oxit (NO), enzym NO-synthese (NOS) và cyclooxygenase (COX-2) là nhóm tác nhân quan trọng cho sự phát triển của tế bào ung thư, đặc biệt trong giai đoạn mới phát sinh Kết quả này

gợi ý rằng, axit asiatic thể hiện hoạt tính kháng ung thư thông qua việc ức chế sản sinh NO và COX-2 [47]

- Trong bằng độc quyền sáng chế số 6,071,898 đăng ký tại Mỹ, nhóm tác giả Hàn Quốc đã tổng hợp một loạt dẫn xuất của axit asiatic có biến đổi ở vòng A và nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư và bảo vệ gan của chúng Kết quả so sánh ED50 của 63 và 64 với ED50 của adriamycin cho thấy cả hai dẫn xuất này đều có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với tế bào ung thư P388D1 [48]

63

64

Hai hợp chất metyl A

(1)-norursa-2,12-dien-23-succinyloxy-2-formyl-28-oat (65) và metyl A 28-oat (66) bảo vệ được 23-41% tế bào gan bị gây độc bởi 5µg/ml CCl4 và 40-72% tế bào gan bị gây độc bởi galactosamin

Ví dụ như: Axit asiatic làm tăng hoạt tính của ciprofloxacin và

tobramycin đối với dòng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa [48]

- Hoạt tính chống xơ vữa động mạch:

Trong bằng độc quyền sáng chế đăng ký tại Hoa Kỳ US 2007/0010459A1, Jan.11, 2007, nhóm nghiên cứu đã sử dụng axit asiatic hoặc hỗn hợp axit asiatic / asiaticosid để điều trị bệnh xơ vữa động mạch và

xơ vữa phổi trên động vật thực nghiệm là chó và chuột cống Các kết quả thu

được là rất khả quan [49]

- Hoạt tính giảm đau và kháng viêm của cây rau má:

Somchit và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính giảm đau của cây rau má Tác dụng gảm đau của dịch chiết nước cây này (10, 30, 100 và 300 mg/kg trọng lượng chuột nhắt trắng) được nghiên cứu bằng phương pháp gây đau với axit asiatic và đĩa nóng Kết quả cho thấy, dịch chiết nước của cây rau má thể hiện hoạt tính chống đau đáng kể ở cả hai mô hình Hoạt tính kháng đau tương tự như ở aspirin, nhưng yếu hơn morphin

Hoạt tính kháng viêm được nghiên cứu trên chuột cống gây viêm bàn

chân bằng prostaflandin E2 Hoạt tính kháng viêm cũng rất nổi bật, hoạt tính này tương tự như các thuốc kháng viêm phi steroid và axit meferamic [50]

- Tác dụng chữa vết thương, vết bỏng:

Asiaticosid hỗ trợ điều trị vết thương qua việc làm tăng hàm lượng hydroxyprolin, thành phần của peptid, tăng độ đàn hồi của cơ da, tăng sinh tổng hợp collagen, tăng tạo mạch và tạo biểu mô

Axit asiatic và axit madecassic cũng làm tăng lượng hydroxyprolin, tăng tổng hợp collagen ở vết thương Asiaticosid cũng tạo ra chất chống oxy hoá (antioxidant) bằng con đường enzym hoặc không enzym như superoxid dismutas, catalas, glutathion peroxidas, vitamin E và axit ascorbic ở các mô mới hình thành [51, 52]

+ Cây rau má được thu hái vào tháng 8 năm 2010 tại Ba vì Hà nội Tên cây

do cử nhân Ngô Văn Trại và thạc sĩ Nguyễn Thế Anh đồng thời có sự giúp

đỡ của TS Trần Thị Phương Anh xác định, có so sánh với mẫu đang lưu tại phòng Tiêu bản thực vật, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội Tiêu bản số RM01/2010 được lưu giữ tại phòng Tổng hợp hữu cơ, viện Hóa học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu thực vật được phơi khô trong bóng râm, hoặc sấy ở 45 oC trong tủ sấy, để nguội, xay nhỏ và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau như n-hexan, diclometan, metanol

2.1.2 Dung môi, hóa chất

+ Các dung môi được sử dụng để chiết tách và tinh chế là: n-hexan, etylaxetat, diclometan, metanol được cất lại qua cột trước khi dùng

+ Chất hấp phụ silicagel có cỡ hạt 0,063 mm, pha đảo RP18 và Sephadex LH20 dùng để chạy cột được mua của hãng Merck CHLB Đức và Aldrich, Hoa Kì

+ Bản mỏng tráng sẵn trên nhôm với silicagel G60 có chất huỳnh quang F254 của hãng Merck được dùng để kiểm tra quá trình tách trên cột và cũng như độ tinh khiết của chất tách được

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm

- Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410-NICOLET (Mỹ) của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LC/MSD Agilent series

1100 của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với TMS

là chất chuẩn nội cho 1H- và tín hiệu dung môi làm chuẩn cho 13C-NMR

- Độ quay cực [α]D được đo trên máy JASCO P2000 Polarimeter tại Viện Hóa Sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều chế các phân đoạn

Vỏ và rễ của cây cọ hạ long và cây rau má phần trên mặt đất sau khi đã sấy khô và xay nhỏ được cân chính xác và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau theo hai cách:

+ Cách thứ nhất: Ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, rút dịch chiết và

thêm dung môi mới 3 lần, mỗi lần ngâm 4 giờ Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45-50 0C (bằng máy quay cất chân không) Cao thu được được chế thêm nước cất Sau đó chiết lần lượt với n-hexan, diclometan Các dịch chiết được cất loại dung môi cho đến khi khô sẽ thu được các cao chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp

+ Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với các loại dung môi

n-hexan, diclometan và metanol ở nhiệt độ phòng Với mỗi loại dung môi được rút dịch chiết và thêm dung môi mới ba lần Mỗi lần ngâm ba tiếng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45-50 0C cho tới khô (sử dụng

máy quay cất chân không) sẽ thu được các cao chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp

2.2.2 Phương pháp tách và tinh chế chất

Các cao chiết trong các dung môi khác nhau được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp Sắc kí cột (SKC) gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH20 hoặc pha đảo RP18 Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn để tinh chế chất Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như kiểm tra quá trình chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) với nhiều hệ dung môi khác nhau để xác định Rf tối

ưu (Rf  0,4-0,6)

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) Trong trường hợp cần thiết sẽ điều chế dẫn xuất axetyl của những chất chứa nhóm hydroxyl để khẳng định thêm cấu trúc của chúng

2.2.4 Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

2.2.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

* Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định :

Vi khuẩn gram (-):

+ Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442,

+ Escherichia coli (Ec) ATCC 25922 + Salmonella enterica (Se)

Vi khuẩn gram (+):

+ Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709

+ Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633 + Lactobacillus fermentum N4

Và nấm:

+ Candida albicans (Ca) ATCC 10198

* Môi trường nuôi cấy: MHB Hinton Broth), MHA Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm

(Mueller-* Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ

- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử

- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng độ)

- Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng: 256; 64; 16; 4 và 1 g/ml

- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử

- Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200

l dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ ở 37 0C Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data

* Chất đối chứng

- Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi

khuẩn gram (-) Ec với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 2 g/ml

- Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn gram (-) Pa với giá

trị IC50 trong khoảng 4 – 5 g/ml

- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 g/ml 2.2.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào

* Các dòng tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC, gồm có:

- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô – là dòng luôn

được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào

- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) – ung thư gan

- LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi

- MCF – 7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú

* Phương pháp: phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung

thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế

bào ung thư ở điều kiện in vitro

- Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37 0C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau

* Thử độc tế bào:

- Cho 200 l dung dịch tế bào ở pha lỏng nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1

- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml Ủ trong điều kiện

37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày

- Giếng điều khiển gồm 200 l dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế

bào/ml, ủ ở 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 l MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37 0C 4 giờ

- Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN

* Tính kết quả:

GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển ( Growth Inhibition)

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve

2.2.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa

* Phương pháp thử hoạt tính DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách

đo quang ở bước sóng  = 517 nm

Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong methanol (MeOH) Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37 0C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bước sóng 517 nm % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

y = 0.3225x + 0.0241

R2 = 0.9938

0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 1.6000 1.8000

* Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza

Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose

citrate), pha loãng 10-20 lần bằng nước cất Chia thành các ống nhỏ 0,5-1 ml Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh -80oC Khi dùng pha loãng thêm 25-

 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1 N

 10 l chất thử pha trong DMSO và RB

 60 l enzyme pha loãng 500 lần

 60 l H2O2 0,2N hay 2%

 20 l Indigocarmin 0,001 N

2.3 Phân lập các hợp chất từ cây cọ hạ long

2.3.1 Tách và tinh chế các chất từ vỏ cây cọ hạ long

3 kg vỏ tươi được sấy ở 450C, thu được 900 g khô, xay nhỏ và ngâm chiết với n-hexan (3 lần x 1,5 lít), sau đó tiếp tục chiết với CH2Cl2 (3 lần x 1,5 lít) và cuối cùng chiết bằng metanol 90% (3 lần x 1,5 lít), ở nhiệt độ phòng Thời gian rút dịch chiết đối với mỗi loại dung môi là từ 3-6 giờ/lần Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 50 0C, thu được 4,9 g cao n-hexan, 3,1 g cao diclometan và 24,9 g cao MeOH

Từ các kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết n-hexan, CH2Cl2, MeOH và qua kiểm tra sắc ký bản mỏng các dịch chiết của vỏ cây cọ hạ long, chúng tôi tập trung phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan

2.3.1.1 Phân lập các chất từ cao chiết n-hexan (theo sơ đồ 2.1)

Phần cao chiết n-hexan được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng và thuốc hiện là CeSO4 Sau khi thử nghiệm với các hệ dung môi khác nhau để tìm hệ dung môi thích hợp cho sắc ký cột, đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n-hexan/EtOAc

4,9 g cao chiết n-hexan được hòa tan vừa đủ bằng CH2Cl2 và trộn với 5

g silicagel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký

Silicagel Merck (200 gam) được nhồi vào cột sắc ký có kích thước 2 cm

x 80 cm theo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi n-hexan/EtOAc = 98/2