Đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu giáo

Miễn dịch [28], [89] Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp tác phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1 Các yếu tố miễn dịch niêm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giống vi khuẩn Haemophilus là một trong những loại vi khuẩn ký sinh

ở đường hô hấp người và một số loài động vật Loài H influenzae là căn

nguyên của một số bệnh nhiễm trùng ở người (có thể từ viêm đường hô hấp

cho đến viêm màng não) H.influenzae typ b (Hib) đã được thế giới xác định

là một trong những căn nguyên chớnh gõy viờm màng não do vi khuẩn, đặc biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [24], [89]

Tại những nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu

hết những nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ,

đặc biệt là những trẻ được chăm sóc tại các trung tâm giữ trẻ ban ngày có thể

mang Hib đến 15% [52], [69] Bên cạnh đó, Hib cũng được đánh giá là

nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ như viêm màng não, viêm phổi để lại di chứng và tỷ lệ tử vong cao (khoảng

10%) Gánh nặng bệnh tật do Hib đã giảm đáng kể nhờ có vacxin phòng bệnh

tại các nước này [89] Tuy nhiên, một số nước trên thế giới sau khi đánh giá

quá trình thực hiện phòng bệnh do Hib bằng vacxin đã cho thấy tỷ lệ thất bại

của vacxin cũng không nhỏ Xuất phát từ vấn đề này, đã có nhiều nghiên cứu

về đặc điểm sinh học phân tử (phổ biến nhất là sử dụng kỹ thuật PFGE) của

Hib được tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử của vi khuẩn này dựa trên nghiên cứu so sánh với đặc điểm các chủng Hib phõn lập từ người khỏe mạnh

và người tiếp xúc mang vi khuẩn [82], [100], [105], [111], [112]

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang

vi khuẩn H influenzae nói chung [1] và Hib nói riêng [7], tỷ lệ mắc viêm màng nóo do H.influenzae (chưa có điều kiện xác định typ huyết thanh) ở trẻ dưới 5 tuổi [6], [22] Cho thấy tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mang H.influenzae chiếm khoảng 21,4% - 35,5% [8], Hib chiếm khoảng 15,0% - 17,5% [7] và H.influenzae là căn nguyên hàng đầu gây viêm màng nóo (50 - 60% các

trường hợp viêm màng nóo xác định được vi khuẩn) ở trẻ nhỏ [6] Từ năm

1994 đến 2004, một số nghiên cứu của Ngô Thị Thi, Phan Lê Thanh Hương

cùng cộng sự đã đưa ra tỷ lệ viêm màng nóo do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà

Nội và một số tỉnh phớa Bắc [11], cũng như tìm hiểu về sự phân bố theo biotype, genotype (phân loại bằng PFGE) và gen mã hóa tổng hợp enzym

lactamase của Hib phân lập từ trẻ viêm màng não dưới 5 tuổi đã được thực

hiện [10] Tuy nhiên, số lượng chủng Hib sử dụng trong nghiên cứu vẫn còn hạn chế và chưa có những so sánh với những chủng Hib phõn lập được ở trẻ

khỏe mạnh Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân

tử của những chủng Hib gõy viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe

mạnh ở lứa tuổi mẫu giáo có mang Hib Chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b phân lập từ

bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu

giáo”, nhằm thực hiện 3 mục tiêu:

1 Xác định biotype, genotype, khả năng sinh enzym -lactamase và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phân lập được

từ bệnh nhi viêm màng nóo dưới 5 tuổi

2 Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả năng sinh enzym -lactamase

và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phân lập được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tại một số nhà trẻ, mẫu giáo

3 So sánh đặc điểm sinh học giữa Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi với Hib được phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Haemophilus influenzae typ b (Hib)

1.1.1 Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi

Haemophilus influenzae (H.influenzae) được phân lập lần đầu tiên bởi

Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi trong đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria) Mãi cho đến khi đại

dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H.influenzae

chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh Năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên

của bệnh cúm, vai trò của H.influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn H.influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi

các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng bởi virus cúm Xuất phát từ yếu

tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) và nhu cầu đòi hỏi những yếu tố phát triển có mặt ở máu (Haemophilus: ưa mỏu) nờn vi khuẩn này có tên gọi H.influenzae [19], [43], [89]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của H.influenzae typ b (Hib)

1.1.2.1 Hình thể và cấu trúc [19], [89]

H influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi

là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5m) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu Tuy nhiên khi chúng ở dịch

não tuỷ, hình thể của H influenzae có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1) H influenzae bắt màu Gram õm, không di động

và không hình thành nha bào Thành tế bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của những vi khuẩn Gram

õm khác Tuy nhiên, H influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không

vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định được typ huyết thanh) và

loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh) Loài H influenzae có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh (serotype) từ a đến f tuỳ

thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định [19], [43], [89] Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Những polysaccharide bề mặt này có liên quan chặt chẽ với độc lực của vi khuẩn, đặc

biệt là H influenzae typ b (Hib), nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm

trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng nóo (chiếm trên 90% các

ca nhiễm khuẩn xõm hại do Hib)

Hình 1.1 Hình thể của Hib trên tiêu bản nhuộm Gram dịch não tuỷ dưới

kính hiển vi quang học (độ phóng đại ì 1000) [99]

Trên thực tế, nếu nhuộm Gram bệnh phẩm dịch nóo tủy mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái và nhiều bạch cầu

đa nhõn thì đõy là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm

màng nóo do H influenzae [89]

1.1.2.2 Sức đề kháng [127]

H influenzae là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại

cảnh Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời

Hib

Bạch cầu đa nhân

chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng

Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi khuẩn này nên được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28oC) Nếu là tăm bông bệnh phẩm phải giữ trong môi trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8oC tối đa

24 giờ trong môi trường này

1.1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy [19]

Điều kiện nuôi cấy:

H influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy Chỳng khụng mọc trờn cỏc

mụi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần túy mà là hỗn hợp của các chất có chứa sắt (như hemin và hematin)

H influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase,

peroxidase và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng

để sản xuất yếu tố X Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố

X mà H influenzae cần thiết phát triển Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ

cần thiết là 0,1 - 1,0 g/ml Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng một phần chúng nằm bên trong tế bào Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có enzym NADase có tác dụng phõn hủy NAD, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị nhiệt phá huỷ Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 g/ml

H influenzae hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO2 (2 - 5%) khi mới phân lập Mọc tốt trờn mụi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23 - 390C, tối ưu là 370C Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu

mọc trờn cỏc loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cựng cỏc điều kiện nuôi

cấy Cũng trên thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H influenzae mọc xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở

những vùng xa thì khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi

khuẩn bội nhiễm đó giúp H influenzae phát triển được thạch mỏu thụng

thường

Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của H influenzae mọc xung

quanh khuẩn lạc của S aureus trờn môi trường thạch máu thỏ

Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc:

Để nuôi cấy H influenzae, có 3 loại môi trường có thể được được sử

dụng [19], [43], [89], [127]:

- Thạch chocolate có hoặc không có 300g bacitracin/ml môi trường (có tác dụng ức chế một số vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phõn lập

H.influenzae Đõy là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi

cấy và phõn lập vi khuẩn này

- Thạch máu thỏ tươi 7% và thạch Levinthal

Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí trường 5% CO2 (nếu không có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt trong một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này Sau khi ngọn nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO2) ở 37oC trong thời gian 18 - 24 giờ

Hình 1.3: Khuẩn lạc H influenzae mọc trờn mụi trường chocolate

Sau 16 - 18 giờ nuôi cấy, H influenzae phát triển thành những khuẩn

lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1 - 2mm và khụng gõy tan huyết Vi

khuẩn Hib luôn có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi

ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn Ngoài ra, môi trường nuôi cấy

vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol) Sau 24 - 48 giờ, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và

có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi

Trên môi trường lỏng, H influenzae thường phát triển làm đục môi

trường Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ)

Tính chất sinh hóa đặc trưng của H influenzae:

Tính chất sinh hóa đặc trưng của H influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt

buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy Tính chất này có thể được xác định bằng thử nghiệm XV hoặc thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]:

Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV (1); thử

nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H influenzae đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu

tố X và V cho sự phát triển

H influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus khác ở các

đặc điểm sau đây:

Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H influenzae với các

1.1.3.1 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ huyết thanh [19], [43], [89]

Năm 1930, H influenzae được xác định thành 2 nhúm chớnh, đó là loài

không vỏ (khụng xỏc được typ huyết thanh - non typeable) và loài có vỏ (xác định được typ huyết thanh - typeable) Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của

vỏ polysaccharide, vi khuẩn H influenzae có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết thanh từ a đến f Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H influenzae gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều nhất là H influenzae typ b

1.1.3.2 Đặc điểm phân loại H influenzae theo typ sinh học (biotype)

Bảng 1.2: Phân loại H influenzae theo typ sinh học của Killian [43]

Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để

xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết quả của 3 thử nghiệm: tìm khả năng sinh indol, hoạt động của hai enzym urease và decarboxylase của vi khuẩn Trước đây, Kilian nghiên cứu và chia

H influenzae thành 4 biotype từ I đến IV Những biotype này độc lập với typ

huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vì các chủng không có vỏ cũng cho kết quả

tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên Sau này, cũng với những thử nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII Vì vậy,

H influenzae được chia ra làm 8 typ theo tiêu chuẩn của Killian [43]

1.1.4 Miễn dịch [28], [89]

Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự

hợp tác phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu

tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt

vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch

Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng

thể đặc hiệu với kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [89]

Đại thực bào

qua trung gian tế bào lympho T Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi cơ chế miễn dịch nào là quan trong nhất trong những cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ Tuy nhiên, hầu hết các cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong những

năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn Khả

năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng

với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu

chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản ứng

chéo với kháng nguyên Hib Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ mắc bệnh nhiễm khuẩn do Hib đặc thù đối với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên kháng Hib có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời Đặc điểm này

cũng đã nêu lên được tầm quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể

khỏi bệnh nhiễm khuẩn lan tràn do Hib Hiện tượng trên được mô tả đầu tiên

bởi Fothergill và Wright năm 1933 [47], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được

kháng thể diệt khuẩn immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, kháng thể này yếu dần

đi trong những tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi giữa tháng tuổi thứ 6 cho đến 2 - 4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông qua việc gây miễn dịch chủ động

Mặc dù đặc điểm miễn dịch tự nhiên đối với vi khuẩn Hib là miễn dịch

đáp ứng với vài loại kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn này, song kháng thể kháng polysaccharide vỏ thuộc typ b (PRP) dường như có tầm quan trọng

nhất Đối với loài H influenzae typ b, 90% tổng số những kháng thể kháng

PRP có khả năng hoạt hóa bổ thể giúp tăng hoạt động thực bào và diệt vi khuẩn nhờ opsonin hóa để bảo vệ cơ thể Ở người, trước khi có kháng sinh,

việc sử dụng thụ động globulin miễn dịch chống lại Hib đã là phương pháp để

điều trị hiệu quả bệnh nhiễm khuẩn lan tràn này Tuy nhiên, kháng nguyên vỏ

của Hib lại không được nhận biết bởi đại thực bào và tế bào lympho T nhưng

lại kích thích cỏc dũng tế bào lympho B đặc hiệu, do đó được gọi là kháng

nguyên độc lập với tế bào T Vì vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế

về khả năng đáp ứng miễn dịch, không hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ trợ đặc hiệu Tế bào T hỗ trợ tác động đến sự chín muồi, biệt hóa và tăng sinh các tế bào B để những tế bào này trở thành tương bào sản xuất kháng thể Tế bào T hỗ trợ cũng có thời gian sống dài và tạo nên trí nhớ miễn dịch cần thiết cho đáp ứng tăng cường tiếp theo khi cơ thể tiếp xúc trở lại với kháng nguyên này Kết quả của những đáp ứng kháng thể thiếu sự tham gia của tế bào T thì hiệu lực miễn dịch sẽ thấp Để khắc phục nhược điểm này, trong sản xuất vacxin, thành phần PRP đã được cộng hợp (liên kết cộng hóa trị) với nhiều loại protein có tính sinh miễn dịch làm tăng cường khả năng nhận biết của đại

thực bào và tế bào T, để có những ưu điểm như sau:

1) Tạo được nồng độ kháng thể cao hơn, đặc biệt ở trẻ nhỏ

2) Khi nhắc tiêm nhắc lại, vacxin sẽ kích thích miễn dịch tăng lên, vì thế đõy là một phương pháp làm tăng tối đa tính miễn dịch

3) Đáp ứng miễn dịch chín muồi hơn, đặc thù hơn bởi sự chiếm ưu thế của các kháng thể IgG-1

4) Việc dùng trước hay dùng đồng thời các protein mang (dạng như độc tố uốn ván hoặc bạch hầu) đã tăng cường đáp ứng của tế bào T, nhờ

hapten-đó làm tăng tối đa đáp ứng miễn dịch với PRP khi cộng hợp với chất mang

1.1.5 Khả năng gõy bệnh viêm màng nóo của Hib

1.1.5.1 Đặc điểm sinh bệnh học [24]

Hib lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài tiết bị nhiễm

khuẩn của đường hô hấp Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi khuẩn có thể gõy nhiễm khuẩn đường hô hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm nhập vào dòng máu Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu do kết quả của sự vận chuyển trong những tế bào thực bào từ niêm mạc vào các mạch

bạch huyết Trong máu, những vi khuẩn Hib có vỏ PRP kháng lại được hiện

tượng đại thực bào và hoạt tính bổ thể Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, Hib

có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu - não Vị trí Hib từ máu vào dịch

não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân bố mạch cao

1.1.5.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm màng nóo [24]

Trên lâm sàng, viêm màng nóo do H influenzae typ b có thể tiến triển

âm ỉ trên vài ngày, thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển trong vài giờ Những dấu hiệu và triệu chứng của viêm màng nóo do vi khuẩn này cũng giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp trong viêm màng nóo do các vi khuẩn gây bệnh khác

Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán

ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu, cứng gáy, sợ ánh sáng Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú

có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện

Tỷ lệ tử vong bởi viêm màng nóo do Hib khoảng 5% và tỷ lệ mắc bệnh

kéo dài là 15 – 30%

1.1.6 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm viêm màng não do Hib

H influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ mọc trên môi trường

giàu chất dinh dưỡng có chứa đầy đủ hai yếu tố phát triển X (hemin), V (NAD hoặc NADP) và không có khả năng mọc trờn cỏc môi trường thông

thường Vì vậy, việc chẩn đoán viêm màng nóo do Hib chủ yếu được thực

hiện ở bệnh viện tuyến tỉnh hoặc tuyến trung ương dựa vào phương pháp nuôi cấy phân lập nên gặp rất nhiều khó khăn Thêm vào đó, đõy cũng là phương pháp thường được áp dụng nhất ở Việt Nam nhưng khả năng phát hiện căn

nguyên vi khuẩn Hib lại có độ nhạy thấp (khoảng xấp xỉ 50%) [12], [14]

Hiện nay, bên cạnh phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống, những phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cũng được áp

dụng để phát hiện Hib trong chẩn đoán viêm màng nóo Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp hiện đại có thể giúp chẩn đoán nhanh Hib gây bệnh, nhưng

lại gặp hạn chế là không xác định được mức độ nhạy cảm với kháng sinh Vì vậy, phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống vẫn song hành cùng những phương pháp chẩn đoán hiện đại

1.1.6.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập và xác định Hib

Chẩn đoán Hib từ bệnh phẩm dịch não tủy [12], [14], [127]

- Bệnh phẩm: lấy bệnh phẩm dịch não tủy (DNT) phải được thực hiện

bởi bác sĩ chuyên khoa có kinh nghiệm trong điều kiện và thủ thuật vô trùng Những trường hợp nghi ngờ bệnh nhân mắc viêm màng nóo, DNT là bệnh phẩm tốt nhất được sử dụng cho phân lập hoặc phát hiện căn nguyên gây bệnh Lấy dịch não tủy nên chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán và được cấy trực tiếp vào cả hai đĩa thạch nuôi cấy (01 đĩa thạch máu và 01 đĩa thạch chocolate) Ngay sau khi được lấy, bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh để tiến hành các kỹ thuật chẩn đoán càng sớm càng tốt (trong vòng 1 giờ sau khi lấy bệnh phẩm) Không được để DNT bị ánh sáng trực tiếp chiếu vào hoặc để nhiệt độ quỏ núng hay quá lạnh Nếu bệnh phẩm không thể vận chuyển sớm về phòng xét nghiệm thì có thể bơm bệnh phẩm DNT vào môi trường T-I (Trans-Isolate medium) và để qua đêm ở nhiệt độ

35oC T-I là môi trường hai pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy

N.meningitidis và các loại vi khuẩn gây bệnh khỏc cú trong bệnh phẩm DNT

hay bệnh phẩm máu

- Nhuộm Gram bệnh phẩm DNT:

Đõy là một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn

khỏc gõy viêm màng nóo Có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm Gram từ cặn

dịch não tủy hoặc bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong

DNT bởi kỹ thuật ngưng kết hạt latex (sẽ đề cập ở phần 1.1.6.2) Kết quả

dương tính của một trong hai kỹ thuật này đều cho thấy bằng chứng nhiễm trùng, thậm chí nuôi cấy có thể thất bại

+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt + Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy

+ Tiến hành nhuộm Gram một tiêu bản từ cặn bệnh phẩm DNT vừa ly tâm Để khô tiêu bản

+ Soi tiêu bản ở vật kớnh ì 100 để tìm vi khuẩn gây bệnh Nếu trên tiêu bản xuất hiện các trực khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài như sợi chỉ) thì đõy là dấu hiệu gợi ý

quan trọng định hướng chẩn đoán viêm màng nóo do Hib

của Hib thường có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thước 1,0 - 1,5mm, vồng nhẹ,

sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và khụng gõy tan máu Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol)

- Xác định

+ Nhuộm Gram: nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch chocolate sau khi nuôi cấy từ dịch não tủy, nhận thấy trên tiêu bản có các trực khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái

+ Tiến hành thử nghiệm xác định nhu cầu đòi hỏi 2 yếu tố phát triển X

và V: thử nghiệm X, V dương tính hoặc thử nghiệm “vệ tinh” với chủng

S.aureus ATCC dương tính

+ Tiến hành xác định Hib bằng kháng huyết thanh mẫu typ b [43], [89] + Tiến hành xác định biotype (typ sinh học) các chủng Hib phân lập được bằng thanh xác định tính chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMộrieux) [12]

Chẩn đoán vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm máu

Trong chẩn đoán viêm màng nóo, ngoài bệnh phẩm dịch não tủy thường được sử dụng trong chẩn đoán thì bệnh phẩm máu cũng được sử dụng với tỷ lệ dương tính khá cao [12], [127]

- Quy trình cấy máu gồm các bước như sau: [127]

+ Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, bao gồm: găng tay, bơm kim tiêm vô khuẩn, dây garo, gạc vuụng, bụng vờ trũn vô khuẩn, băng vết thương nhỏ, môi trường cấy máu và dung dịch sát khuẩn (cồn iod hoặc povidone-iodine,

có thể dùng cồn 70o) Kích thước của kim phụ thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm

và kích thước của tĩnh mạch Kim cỡ 23, tức là dài 20 - 25mm hoặc kim bướm thường được dùng cho trẻ em

+ Bằng kỹ thuật vô trùng, dùng bơm kim khi hút đủ lượng máu cần thiết (1 - 2 ml để cấy vào 20ml môi trường canh thang dinh dưỡng)

(Chú ý: không để cho không khí lọt vào trong tĩnh mạch)

+ Bơm máu vào môi trường dùng để cấy máu theo nguyên tắc vô trùng (thông thường nên sử dụng chai cấy máu có môi trường pha chế sẵn của Hãng Becton – Dickinson) [12]

+ Ngay lập tức vận chuyển bình cấy máu về phòng xét nghiệm vi sinh Bình cấy máu có thể được giữ ở nhiệt độ phòng (20o

- 25oC) khoảng 4 - 6 giờ trước khi ủ ấm ở 35o

- 37oC, thông khí với khí trường 5 - 10% CO2 (Chú ý: Bình cấy máu không được giữ trong tủ lạnh Ủ ấm trong quá trình vận chuyển có thể sử dụng nhiệt độ 25o

- 35oC)

+ Trong một số trường hợp cần lấy máu để thực hiện phương pháp chẩn đoán khỏc, nờn lấy vào các ống nghiệm chân không vô trùng

- Theo dõi và chẩn đoán bình cấy máu [127]

Bình cấy máu được kiểm tra sau 14 - 17 giờ ủ trong tủ ấm và sau đó là theo dõi hàng ngày cho hết 7 ngày Bất cứ có xuất hiện đục hay tan máu trong môi trường đều có thể cho thấy là cấy máu (+), do đó lập tức lắc đều bình cấy máu và cấy chuyển sang đĩa thạch chocolate theo các bước như sau:

+ Sát khuẩn nút cao su chai cấy máu bằng cồn 70o và povidone-iodine + Hút 0,5 ml từ môi trường cấy máu bằng bơm kim tiêm vô trùng và nhỏ lờn gúc (gần rìa đĩa Petri) đĩa môi trường chocolate

+ Sử dụng que cấy vô trùng ria cấy theo phương pháp phân vùng Ủ đĩa thạch ở 37oC với khí trường 5% CO2 khoảng 18 - 24 giờ Nếu trên đĩa thạch

có khuẩn lạc Hib mọc, tiến hành xác định Hib và typ sinh học (như phần chẩn

đoán dịch não tủy)

1.1.6.2 Phương pháp ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT [12], [43]

Nguyên lý: Phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide của Hib trong

dịch não tủy bằng kháng thể (đơn giá) kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn

lên bề mặt gắn hạt latex Kết quả phản ứng dương tính khi hỗn dịch làm phản ứng trên lam kính hoặc phiến giấy xuất hiện các hạt ngưng kết; phản ứng âm tính khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra

Thực hiện kỹ thuật:

- Dụng cụ, hóa chất:

+ Pasteurex Meningitis Hib (KHT đa giá)

+ Bio Merieux Slidex meningite KIT (HT đa giá)

- Tiến hành kỹ thuật:

+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt + Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy

+ Đun nước nổi DNT trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100oC/5 phút + Lắc đều lọ kháng thể mẫu có gắn hạt latex cho đến khi có huyền dịch thuần nhất

+ Nhỏ một giọt của mỗi loại kháng thể mẫu gắn hạt latex lên lam kính

ở giữa vòng tròn đã được khoanh bằng bút viết kính hoặc phiến giấy dùng một lần để thực hiện các phản ứng ngưng kết

+ Nhỏ 30 - 50 àl dịch não tủy vào từng loại kháng thể mẫu đã được nhỏ lên lam kính hoặc phiến giấy

+ Xoay tròn lam kính hoặc phiến giấy làm phản ứng 2 - 10 phút (hoặc dựng mỏy lắc tròn với tần số 100 vũng/ phỳt)

Nguyên lý: Đõy là loại phản ứng kết tủa dựa trên nguyên lý khỏng

nguyên tích điện âm từ giếng ở phía cực âm và kháng thể tích điện dương từ giếng ở phía cực dương (các Ig ở pH 8,4 di chuyển về cực âm của hệ mao dẫn theo lực điện thẩm thấu nội) sẽ di chuyển ngược chiều nhau, khi gặp nhau sẽ hình thành đường tủa đặc hiệu trong gel (thạch điện di)

Thực hiện kỹ thuật:

- Dụng cụ, hóa chất:

+ Dụng cụ:

Phiến kính 7 ì 7cm, bàn mức phẳng ngang, bộ đục lỗ thạch, máy điện

di, nguồn cung cấp điện, lò vi sóng

+ Hóa chất:

/ Kháng huyết thanh thỏ kháng Hib

/ Kháng nguyên chuẩn polysaccharide của Hib (NIH – Mỹ)

/ Thạch điện di (Sigma); hóa chất pha thạch và đệm điện di (đệm Bacbital - Sigma) Trong đó, thạch nền: agarose thường được pha 3% trong nước cất Thạch điện I (type I - Sigma): 1% trong đệm bacbital pH 8,4

- Tiến hành kỹ thuật:

+ Phủ một lớp mỏng thạch nền lên phiến kính, phơi khô

+ Đặt phiến kớnh lờn bàn mức ngang và đổ thạch 1% lên (6ml cho phiến kính 7 ì 7cm)

+ Để khô, đục giếng trên thạch với kích thước như sau: đường kính giếng khoảng 2 - 3mm; khoảng cách từ giếng kháng thể đến giếng bệnh phẩm

là 5mm

+ Nhỏ hàng trên là kháng thể (kháng huyết thanh) 5àl/ giếng; hàng dưới nhỏ 5àl bệnh phẩm (dịch não tủy); chứng dương là 5àl polysaccharide typ b

của Hib + 1àl thuốc nhuộm bromophenol

+ Đặt vào bể điện di, chạy với tốc độ 8mA/30 phút

+ Đọc kết quả sau 1 - 3 giờ dừng chạy điện di, nếu dương tính sẽ thấy vạch tủa trắng gần phía giếng kháng thể (cực dương)

1.1.6.4 Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong DNT bằng

kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR được biết là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả nhanh, nhạy và đặc

hiệu với vi khuẩn Hib ở DNT Hơn thế nữa, kỹ thuật này cũng góp phần nâng

cao tối đa khả năng quản lý các trường hợp viêm màng não nhằm giảm tỷ lệ trầm trọng, tỷ lệ chết và những phức tạp trong điều trị các bệnh nhiễm trùng

xâm hại do Hib Tại những cơ sở xét nghiệm lâm sàng, kỹ thuật PCR truyền thống thường được dùng nhất trong chẩn đoán vi khuẩn Hib Tuy nhiên, hiện

nay kỹ thuật Realtime-PCR cũng đã được sử dụng trong phân loại và xác định

vi khuẩn H influenzae nói chung và Hib nói riêng với độ nhạy, độ đặc hiệu

Cặp mồi này tương tự và bổ sung với trình tự acid nucleic của vùng bảo

tồn gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết thanh b của H influenzae Cả hai mồi

bao gồm khoảng 24 cặp base (base pair)

+ Thang ADN mẫu, đệm, nước khử ion và MgCl2 25mM

- Các bước tiến hành PCR:

+ Tách chiết ADN của Hib trong dịch não tủy:

/ Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào một ống ly tõm sạch,

vô trùng

/ Cho ống nghiệm chứa DNT cho vào nồi cách thủy đun 100o/15 phút / Ly tõm ống nghiệm bệnh phẩm DNT (sau khi đã đun cách thủy) với tần số 10.000 vòng/ phút ì 5 phút

/ Lấy 10àl nước nổi sau khi ly tõm sử dụng để làm mẫu ADN

Haemophilus influenzae (ATCC 35056 Difco làm chứng dương), 40àl nước

khử ion và cặp mồi (mồi 1,2: 2 àl hoặc 40pm) cho mỗi ống

/ Hỗn hợp phản ứng được chạy theo chương trình cài đặt của máy điều nhiệt (Eppendorf, Germany) khoảng 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ cú cỏc thông số dưới đây: giai đoạn biến tính khoảng 2 phút ở 94oC; giai đoạn gắn mồi khoảng 2 phút ở 56oC; giai đoạn kéo dài khoảng 2 phút ở 72oC Trong đó, giai đoạn biến tính đầu tiên cần 10 phút ở 94oC và giai đoạn kéo dài cuối cùng là 8 phút ở 72oC Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khi khuếch đại có thể được giữ ở 4oC cho đến khi phân tích Sản phẩm của phản ứng PCR để chẩn

đoán Hib được phát hiện bởi kết quả điện di trên thạch agarose

- Các bước tiến hành Realtime-PCR [74]:

+ Tách chiết ADN của Hib từ dịch não tủy dựa vào QIAamp blood kit

(Qiagen, Hilden, Germany) theo quy trình của nhà sản xuất

+ Tiến hành kỹ thuật:

Phản ứng khuếch đại được thực hiện với hỗn hợp phản ứng có thể tích tổng là 25àl, chứa 2ìTaqMan universal master mix (Perkin-Elmer-Biosystems), mỗi primer với nồng độ 400nM, 200nM probe, và 1àl ADN tách chiết

Quá trình khuếch đại PCR có thể được thực hiện trên nhiều mẫu giống nhau dựa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM 7700 Các thông số chuẩn cho quá trình khuếch đại: 2 phút ở 50oC, và 10 phút ở 95o

C cho 40 chu kỳ; trong đó với một chu kỳ gồm 15 giây ở 95oC và 1 phút ở 60o

C

Kết quả của phản ứng Realtime-PCR được phân tích phần mềm cho hệ thống phát hiện trình tự, phiên bản 1.7

1.1.6.5 Đánh giá các kỹ thuật phát hiện Hib trong chẩn đoán viêm màng nóo

Giá trị chẩn đoán của các kỹ thuật phát hiện Hib gây viêm màng nóo

được giới thiệu ở trên đó cú một số nghiên cứu, đánh giá và cho thấy độ nhạy,

độ đặc hiệu của từng phương pháp

- Phương pháp nuôi cấy chẩn đoán Hib thường có độ nhạy không cao

(khoảng 50 - 55%), nhưng độ đặc hiệu là 100% Ngoài ra, phương pháp này cũn giỳp cho những nhà vi sinh lõm sàng xác định được mức độ nhạy cảm với

kháng sinh của những chủng Hib gây bệnh phân lập được mà các phương

pháp khác thường không thể thực hiện [12]

- Phương pháp ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên đặc hiệu

của Hib trong dịch não tủy là phương pháp thực hiện rất đơn giản nhưng có

độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao (độ nhạy 95%, độ đặc hiệu 99,6%) [12]

- Phương pháp điện di đối lưu phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của

Hib trong dịch não tủy có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 100% [12], [14]

- Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong dịch não

tủy bằng kỹ thuật PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 99% [12], [74]

1.2 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib, tình hình viêm màng não

do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trong nước và trên thế giới

1.2.1 Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib

1.2.1.1 Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib)

Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể mà không có biểu hiện triệu chứng hoặc không phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [28]

Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại với thời gian ngắn hoặc dài, có thể gián đoạn hoặc liên tục Những người mang vi khuẩn thường

có khả năng lây truyền cho người khác Vì vậy, người lành mang Hib đồng

nghĩa với vi khuẩn này định cư trên cơ thể và xác định được sự xuất hiện của

vi khuẩn Hib sống ở màng nhày họng Tuy nhiên, kết quả xác định này cũn

phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét nghiệm tìm vi

khuẩn Hib còn sống ký sinh ở màng nhày họng người khỏe mạnh [28]

1.2.1.2 Phương pháp xác định

Trong hầu hết các nghiên cứu điều tra về người khỏe mạnh mang Hib,

khó khăn xảy ra trong việc phân lập vi khuẩn này có thể dẫn đến kết quả tỷ lệ

mang Hib thu được thường thấp hơn so với thực tế Qua một số nghiên cứu,

cho thấy phương pháp sử dụng tăm bông lấy bệnh phẩm từ họng miệng (oropharyngeal swabs) dùng để nuôi cấy xác định người khỏe mạnh mang

Hib thường có kết quả tương tự hoặc cao hơn so với nuôi cấy từ tăm bông lấy

bệnh phẩm ở họng mũi (nasopharyngeal swabs) [77]

Hốc mũi

Lưỡi

Thanh quản

Họng mũi Họng miệng Thanh quản-hầu (vùng dưới hầu)

Thực quản

Hình 1.6: Hình ảnh giải phẫu đường hô hấp trên

Trạng thái người khỏe mạnh mang Hib thường được xác định bằng các

kỹ thuật nuôi cấy Vì vậy, tất cả các bước thực hiện trong kỹ thuật xét nghiệm dùng cho nghiên cứu điều tra vi sinh này cần phải đạt được độ chuẩn xác tối

đa Những sai số có khả năng xảy ra trong quá trình xác định tỷ lệ Hib ký sinh

ở họng người khỏe mạnh, bao gồm: kỹ thuật ngoáy họng lấy bệnh phẩm (đây

là kỹ thuật khó duy trì ổn định), sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình vận chuyển bệnh phẩm cho đến khi nuôi cấy vào môi trường; và sự xuất hiện nhiều vi khuẩn khác nhau có trong bệnh phẩm nhưng lại có sự tương đồng về hình thái khuẩn lạc, nên có thể dẫn đến chọn khuẩn lạc nhầm Sự khác biệt

của các phương pháp nuôi cấy được sử dụng trong phân lập Hib từ tăm bông

bệnh phẩm ngoáy họng là yếu tố chính dẫn đến những khó khăn và phức tạp trong việc giải thích các số liệu từ các nghiên cứu khác nhau [28]

1.2.1.3 Dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib và một số yếu tố ảnh hưởng

Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến dịch tễ học của Hib, đó là

yếu tố xã hội học (soccial) và nhân khẩu học (demographic) Khả năng mang

Hib ở trẻ nhỏ dường như có liên quan rất gần đến khả năng, mức độ phơi

nhiễm đối với vi khuẩn này [28]

H influenzae là thành viên của hệ vi khuẩn bình thường ký sinh ở đường hô hấp trên Trong đó, Hib có ở 1 - 5% trẻ em khoẻ mạnh và không có

biểu hiện bệnh [89] Tỷ lệ mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn, cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo [69], [120], [124] Hầu hết các điều tra đều đưa ra kết quả nuôi cấy từ tăm bông bệnh phẩm ngoáy họng miệng hay họng mũi phát hiện

thấy Hib có khoảng 3 - 5% trẻ dưới năm tuổi [69], [120], đây là lứa tuổi có tỷ

lệ mang Hib được xem là nổi trội nhất [58] Một số nghiên cứu trong nước và

trên thế giới đã cho thấy:

+ Tại Việt Nam, hiện nay hầu hết những nghiên cứu chỉ dừng lại ở xác

định về tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang H influenzae, kết quả cho thấy tỷ lệ này

khoảng 15 - 30% [7], [8] Tuy nhiên, vẫn cũn rất ít nghiên cứu xác định tỷ lệ trẻ

khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib Điển hình một nghiên cứu gần đõy (2003) của Phạm Văn Ca và Lê Đăng Hà cho thấy tỷ lệ mang Hib ở trẻ khỏe mạnh chiếm

khoảng 15,0 - 17,5% [7]

+ Trên thế giới, phần lớn những nghiên cứu về trẻ khỏe mạnh mang

H.influenzae đều được định typ huyết thanh Trong đó, tỷ lệ trẻ khỏe mạnh

dưới 5 tuổi mang Hib khác nhau tuỳ theo địa điểm nghiên cứu Một số nghiên

cứu thực hiện ở một số nước châu Á, châu Âu, châu Mỹ và châu Phi cho thấy

tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib chiếm khoảng 4 - 12,5% [36], [52], [87], [104]

Qua hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy tỷ lệ mang Hib ở những trẻ được chăm sóc tại các nhà trẻ thường rất cao Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp ở

lứa tuổi dưới 6 tháng, tỷ lệ cao nhất trong lứa tuổi từ 6 tháng - 5 tuổi (đặc biệt

là 6 - 11 tháng) và giảm dần cho đến tuổi trưởng thành [28], [36], [45], [52]

Tuy nhiên, còn một số yếu tố khác có thể làm tăng hoặc giảm tỷ lệ trẻ

khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib

- Ảnh hưởng của điều kiện sống lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib

Điều kiện sống đông đúc như ở các căn hộ, trung tâm chăm sóc trẻ ban

ngày cũng góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ có thể cao lên một cách đáng kể Mặc dù trên thực tế cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib thường ít hơn 5%, nhưng tỷ lệ mang vi khuẩn Hib tại các trung tâm chăm sóc trẻ ban

ngày được báo cáo chiếm khoảng 15 - 25% [52], [69], [120] Trong một gia

đình khi có một trường hợp bị nhiễm bệnh nhiễm trùng do Hib xảy ra, tỷ lệ

nhiễm vi khuẩn này đã được khảo sát là 60 - 70% giữa các anh em ruột và 20% ở các bậc cha mẹ [28], [69]

- Ảnh hưởng của tiêm chủng vacxin đặc hiệu lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib

+ Vacxin cộng hợp (conjugate vaccine) và người khỏe mạnh mang Hib:

Sau 4 năm thực hiện tiêm chủng trên toàn quốc cho trẻ em ở Phần Lan,

Takala và cộng sự đã báo cáo tỷ lệ trẻ mang Hib giảm nhiều trong số 327 trẻ

đã được tiêm chủng vacxin PRP-D (vacxin Hib có chất cộng hợp có nguồn

gốc từ vi khuẩn bạch hầu – diphtheria-related substance) so với 398 trẻ chưa được tiêm chủng vacxin trong nghiên cứu trước (cụ thể là: 0% và 3,5%) Trong đó, những trẻ được lựa chọn nghiên cứu là những trẻ 3 tuổi khỏe mạnh đến trung tâm y tế địa phương và được lấy bệnh phẩm dịch họng bằng tăm bông để nuôi cấy xác định [112]

Tại một trung tõm chăm sóc trẻ ở Dallas, một nghiên cứu tiến cứu xác

định tỷ lệ trẻ mang Hib trong khoảng thời gian 1987 - 1989 [88] Trong giai

đoạn này vacxin cộng hợp đã được giới thiệu ở Mỹ, vì vậy những đứa trẻ được nghiên cứu tại trung tõm này bao gồm cả trẻ đã được tiêm và không được tiêm vacxin Trong tổng số 283 trẻ được nghiên cứu, có 59 trẻ chưa

được tiêm vacxin phòng Hib và 89 trẻ đã được tiêm vacxin cộng hợp (trong

số đó 94% trẻ tiêm vacxin là loại PRP-D) Kết quả cho thấy tỷ lệ trẻ mang vi

khuẩn Hib thu được lần lượt là 21% và 9% Ngoài ra, nghiên cứu những trẻ phơi nhiễm đối với Hib (tức là những đứa trẻ này sống cùng với ít nhất một trẻ có kết quả dương tớnh với Hib) cho thấy hiệu lực của vacxin liên hợp

trong việc chống lại sự định cư của vi khuẩn khi phõn tích riêng lẻ là 64%

Trong đó, không có sự tác động lên sự định cư của vi khuẩn Hib được tỡm

thấy với việc tiêm chủng loại vacxin PRP

Một nghiên cứu lõm sàng cơ bản ở trung tõm Atlanta cho thấy tỷ lệ

mang Hib giảm ở lứa tuổi từ 2 - 5, trong đó 70% trẻ được tiêm chủng vacxin liên hợp phòng Hib [81] và ở Apache, Navaro trẻ em da đỏ (Indian children)

đã được tiêm chủng vacxin Hib-OMPC (vacxin Hib có chất cộng hợp có

nguồn gốc từ cầu khuẩn màng não – meningococcal-related substance) phù hợp theo lứa tuổi [64]

Nghiên cứu tại Oxford Region nước Anh đã thực hiện tiêm chủng

vacxin cộng hợp PRP-T (vacxin Hib có chất cộng hợp có nguồn gốc từ vi

khuẩn uốn ván – tetanus-related substance) từ vùng này tới vùng khác để xác định tác dụng của vacxin qua một thời gian theo dừi ở những nhúm trẻ nhỏ được tiêm và không được tiêm vacxin trong cùng một thời điểm nghiên cứu Trẻ vừa mới sinh được lựa chọn để nghiên cứu với mục đích giảm tối thiểu

những sai số có liên quan đến những trẻ đã sẵn mang vi khuẩn Hib đem lại

Trong đó, những sai số từ mẫu nghiên cứu cũng đã được hạn chế bằng cách chỉ có một người thực hiện ngoáy họng và phõn tích xét nghiệm chuẩn xác thực hiện tại một phòng xét nghiệm [27] Tuy nhiên, một số yếu tố khác cũng

có thể ảnh hưởng đến sự phơi nhiễm đối với Hib hoặc nhạy cảm với khả năng

mang vi khuẩn này được xác định là lệ thuộc vào nhúm chứng thống kê (statistic control) Kết quả cho thấy, những trẻ em được tiêm vacxin cộng hợp

ở lứa tuổi 2, 3 và 4 tháng tỷ lệ mang Hib thấp hơn nhúm chứng có ý nghĩa thống kê Phù hợp với điều này, tỷ lệ mang Hib thực tế thấp hơn ở nhúm tiêm vacxin so với nhúm chứng ở 6, 9 và 12 tháng tuổi Tỷ lệ mang Hib thu được

và mức độ phổ biến của H influenzae nhúm e, f không có sự khác nhau giữa

nhúm tiêm vacxin và nhúm chứng

+ Ảnh hưởng của vacxin cộng hợp lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib: Vacxin Hib polysaccharide loại không cộng hợp làm tăng nồng độ

kháng thể IgA ở nước mũi và nước bọt cả ở người lớn và trẻ em [28], [94]

Tuy nhiờn, không có ảnh hưởng đến tỷ lệ mang Hib ở vùng họng miệng [92]

Tương tự cũng không có hiệu quả với tỷ lệ mang vi khuẩn ở vùng hầu họng của các loại vacxin polysaccharide khác được sử dụng: nóo mô cầu nhóm A,

E và một số typ huyết thanh đối với vacxin polysaccharide của vi khuẩn

Streptococcus pneumoniae [28], [58]

Vacxin cộng hợp có thể đem đến nồng độ kháng thể kháng PRP cao hơn trong huyết thanh trẻ em so với vacxin polysaccharide thông thường Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao có thể dẫn đến hiện tượng ngấm thụ động kháng thể IgG ra bề mặt của các màng nhày [67] Nghiên cứu một mẫu chuột nhắt, cho thấy nồng độ kháng thể IgG cần thiết để hạn chế sự định cư

của Hib là 7àg/ml Ngoài ra, nhiều nghiên cứu gần đõy cũng cho thấy kháng

thể IgG kháng lại PRP có ở màng nhày liên quan đến nồng độ kháng thể có trong huyết thanh sau khi tiêm vacxin [64] Kháng thể tiết IgA kháng lại PRP được tỡm thấy trong nước bọt của trẻ không đồng nhất với phát hiện IgA trong huyết thanh Điều này cho thấy kháng thể IgG trong nước bọt bắt nguồn

từ huyết thanh, trong khi IgA được sản xuất tại chỗ Dường như vacxin cộng hợp có thể làm tăng đáp ứng của kháng thể bề mặt IgA cũng như đáp ứng IgG

hệ thống miễn dịch, trong khi đã có bằng chứng cho rằng nồng độ IgG cao trong huyết thanh có liên quan đến sự ngăn chặn hiện tượng mang vi khuẩn, vai trò của IgA vẫn cũn chưa rừ ràng [28]

Sự giảm dần của nồng độ kháng thể kháng PRP trong huyết thanh và màng nhày theo thời gian đã đưa ra giải thích đơn giản về tác dụng của miễn

dịch nguyên thủy do vacxin cộng hợp lên sự định cư của Hib Trung bình

nhõn nồng độ chuẩn (Geometric mean titer: GMT) của kháng thể kháng PRP

có trong huyết thanh trẻ nhỏ ở Oxfordshire nước Anh cho thấy: trẻ 5 tháng tuổi ngay sau quá trình gõy miễn dịch là 5àg/ml [32]; GMT của trẻ 12 tháng tuổi là 0,83àg/ml [33] Nồng độ kháng thể bằng 1àg/ml sau khi đáp ứng miễn dịch đối với vacxin polyccharide là nồng độ được xác định có khả năng bảo

vệ cơ thể chống lại các bệnh nhiễm trùng xõm nhập do Hib trong một thời

gian dài [67] Hiện tượng mang Hib và mang Hib kéo dài là do nồng độ kháng

thể trong huyết thanh hoặc màng nhày ở dưới ngưỡng

Kháng thể đặc hiệu góp phần như thế nào đến khả năng hạn chế sự tấn

công của Hib ở màng nhày họng vẫn chưa được giải đáp Các cơ chế có thể

bao gồm: hiện tượng thực bào opsonin hóa qua trung gian kháng thể, tác dụng tiêu diệt trực tiếp vi khuẩn, hoặc ức chế hướng thể rắn (stereotactic inhibition) của kháng thể Tuy nhiên, cơ chế kháng khuẩn qua trung gian kháng thể đơn giản không thể giải thích hoàn toàn cho sự thay đổi về sự định cư của vi

khuẩn ở những người tiêm vacxin Tình trạng những người đang mang Hib

thường không mất đi nhanh chóng sau khi tiêm vacxin [25] Kết quả này dễ

dàng được giải thích do sự ẩn nấp của Hib trong tế bào (intracellular

sequestration) [47] nên có thể hoàn lại vi khuẩn mà kháng thể trong dịch tiết không đến được Ngoài ra, cũng có thể vacxin cộng hợp không đủ khả năng

kích thích hệ miễn dịch những trẻ mang Hib, đặc biệt với kháng nguyên Hib

xuất hiện ở màng nhày Bên cạnh đó, hiện nay một số nghiên cứu cũng cho

thấy vacxin kháng Hib can thiệp vào mối quan hệ bình thường giữa Hib và cơ

thể Cơ chế chủ yếu bằng sự tăng nồng độ kháng thể kháng PRP huyết thanh và/ hoặc màng nhày của cơ thể trước khi cơ thể có bất cứ yếu tố phơi nhiễm nào với vi khuẩn này Thứ nhất, có thể chứng minh vai trò đầu tiên của vacxin

trong việc hạn chế sự định cư của Hib là ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn

Thứ hai, hiện tượng tăng hiệu giá kháng thể (nguyên nhõn bởi sự tiếp xúc của

màng nhày với Hib ở cơ thể đã có miễn dịch) có thể dẫn đến sự loại trừ nhanh chóng hơn Hib ra khỏi cơ thể Ngoài ra, các bằng chứng ít có ý nghĩa khác như số lượng khuẩn lạc Hib đếm được trên môi trường nuôi cấy từ những trẻ

đã tiêm vacxin cũng được nhắc đến [33]

Trong giới hạn sinh thái học, Hib có thể tạm thời ký sinh ở họng Tiêm chủng vacxin có thể làm đảo ngược sinh thái học của Hib ở những người tiêm

vacxin, dẫn đến ảnh hưởng sõu sắc đến biến động của quần thể Hib Sự tăng

lên của kháng thể trong huyết thanh hoặc dịch nhày có thể đủ ảnh hưởng đột

ngột đến kiểu lan truyền của Hib Dường như vậy, ảnh hưởng này được xác

định là trước tiên và lớn nhất thay vì yếu tố tiếp xúc gần giữa các trẻ nhỏ ở tại gia đình hay cơ sở chăm sóc trẻ Sau đó, ảnh hưởng của vacxin sẽ trở thành rừ ràng và điển hình trong một quần thể rộng rói hơn Hiện nay, có rất ít số liệu

về sự thay đổi sinh thái học của Hib tại họng, ảnh hưởng của vacxin liên hợp

lên sự thay đổi này Tầm quan trọng của ảnh hưởng đó đã thúc đẩy những nỗ lực trong xõy dựng mẫu toán học để dự báo trước động học của quần thể dõn

số mang Hib và mắc bệnh do Hib sau khi sử dụng vacxin cộng hợp [28]

Do bản chất khác nhau về thành phần hóa học và khả năng sinh miễn dịch, cho nên những loại vacxin cộng hợp khác nhau về thời gian có hiệu lực

bảo vệ và ảnh hưởng đến tình trạng mang Hib cũng như vai trò của sự lõy

nhiễm Bên cạnh đó, chế độ tiêm chủng trong quần thể dõn số cũng có thể ảnh hưởng đến bất cứ quá trình tạo ra nhóm miễn dịch nào (herd immunity) Ví

dụ, sử dụng một liều vacxin cộng hợp củng cố sau khi đứa trẻ 12 tháng có thể kéo dài thời gian có nồng độ kháng thể kháng PRP cao ở trẻ nhỏ, do đó làm

nõng cao khả năng hạn chế sự lan truyền của Hib trong cộng đồng [28]

- Ảnh hưởng của liệu pháp điều trị kháng sinh lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib

Hầu hết các liệu pháp kháng sinh được sử dụng trong điều trị đều có thể

ảnh hưởng đến tỷ lệ mang Hib ở trẻ nhỏ Cụ thể, sử dụng rifampicin có thể loại bỏ tình trạng mang Hib ở họng và giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh thứ phát

do Hib khi tiếp xúc với nguồn lây [51] Ngoài ra, các kháng sinh như chloramphenicol, nhúm macrolides cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ mang Hib ở

họng [28], [44]

Nói túm lại, đã có nhiều nghiên cứu dọc về đặc điểm của trẻ mang Hib Cho thấy, một số trẻ em mang Hib nhất thời - thoáng qua, nhưng hầu hết trẻ mang Hib có khuynh hướng tồn tại nhiều tuần hoặc nhiều tháng [51], [53],

[73] Trong đó, quá trình tiếp xúc gần và phát tán rộng rói các chất bài tiết từ đường hô hấp trên được xem là nguồn lây nhiễm chủ yếu giữa những cá thể

Thậm chí, khi có sự tiếp xúc giữa một người mang Hib đã được xác định trước và một đứa trẻ nhạy cảm một cách gần gũi thì sự lan truyền Hib có thể

qua nhiều tuần, nhiều tháng [77], [120] Bijlmer đã đưa ra kết luận về động học dõn số và điều kiện sống của dân cư trong các làng mạc ở Gambia dẫn

đến những biến động về sự định cư và sự lan truyền của vi khuẩn Hib, do đó

sự tồn tại trạng thái mang Hib của trẻ em Gambia thường ngắn [29] Tuy

nhiên, hầu hết các nghiên cứu cũng đã cho thấy không có sự liên quan giữa

các yếu tố như: mùa, giới và chủng tộc với tỷ lệ mang Hib ở trẻ [51], [77] 1.2.1.4 Trẻ khỏe mạnh mang Hib và sự lan truyền bệnh tật

Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh do Hib đều không tiếp xúc với những người đang mắc các bệnh nhiễm trùng xâm hại do Hib, bởi vì vi khuẩn này không có ổ chứa ở ngoài cơ thể Do đó, những người mang Hib không có

triệu chứng được xác định nguồn lây nhiễm chính Mối liên quan giữa tỷ lệ

người khỏe mạnh mang Hib với nguy cơ mắc bệnh là không đơn giản Đó là,

xuất hiện những trường hợp mắc bệnh nhiễm trùng trong khi tỷ lệ mang vi khuẩn thấp đã được mô tả [123] và không thấy mắc bệnh rõ ràng xuất hiện cho dù tỷ lệ mang vi khuẩn cao [55], [120] Hơn thế nữa, những vi khuẩn phân lập được từ họng thường có đặc điểm thiếu yếu tố độc lực gây bệnh cho

dù được tìm thấy khi phân lập ở bệnh nhân mắc nhiễm trùng xâm hại [28]

Giống như những điều tra về người khỏe mạnh mang Hib khác, điều tra

về dịch tễ học của các bệnh nhiễm trùng do Hib đã cho thấy sự phát tán nhanh của những chủng Hib là không theo quy luật Hiện tượng tấn công thứ phát

của Hib đối với những người tiếp xúc trực tiếp trong một gia đình cao hơn

500 lần so với nguy cơ mắc bệnh của quần thể dõn chúng [94] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cho thấy tần số xuất hiện với tỷ lệ cao trẻ khỏe mạnh mang

Hib khi ở chung nhà hoặc chung trung tõm chăm sóc với người bệnh Điều này đã minh chứng những người mắc bệnh nhiễm trùng do Hib được xem là

nguồn lõy rất mạnh đối với tất cả những người tiếp xúc gần [28]

Vỏ của Hib có vai trò nõng cao khả năng sống sót của vi khuẩn này qua

áp lực bị thủy phõn trong suốt quá trình lõy nhiễm giữa các đối tượng trong cộng đồng [83] Tuy nhiên vẫn cũn nhiều điều chưa biết về sự lõy truyền của

Hib Các phương thức lây truyền giữa các cơ thể là gì? Thời gian có thể sống

sót của vi khuẩn này giữa các cơ thể là bao lõu? Giới hạn vị trí quần thể vi khuẩn định cư là ở chỗ nào và liều lượng vi khuẩn là bao nhiêu để đảm bảo cho quá trình lây truyền thành công? Có hay không bất cứ mối liên quan nào giữa mức độ liều nhiễm trùng hoặc số lượng vi khuẩn cơ thể mang với khả năng xảy ra bệnh nhiễm trùng xõm hại? [28]

1.2.1.5 Trẻ khỏe mạnh mang Hib và đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Vỏ polysaccharide là sản phẩm trùng hợp của ribose, ribitol, phosphate [89] và được gọi là polyribosylribitolphosphate (PRP) PRP là yếu tố quyết

định chớnh cho độc lực của Hib [85], [89] và là đích tác dụng của đáp ứng

sinh kháng thể đặc hiệu Dường như các nghiên cứu đều cho thấy kháng thể chống lại PRP có tác dụng bảo vệ cơ thể [104]

Lúc mới sinh, trẻ nhận được kháng thể bảo vệ từ mẹ Tuy nhiên, kháng

thể nhận từ mẹ sẽ giảm dần dẫn đến nguy cơ mắc các bệnh do Hib sẽ tăng

cao Khi trẻ đến gần 2 tuổi, kháng thể của cơ thể chống lại kháng nguyên vỏ polysaccharide bắt đầu xuất hiện Kháng thể có vai trò tiêu diệt vi khuẩn này

bởi kết quả của đáp ứng miễn dịch cơ thể trực tiếp với Hib ở màng nhày hoặc

với các kháng nguyên chéo của những vi khuẩn khác mang cấu trúc vỏ polysaccharide [35]

Nồng độ kháng thể kháng vỏ cao trong huyết thanh có liên quan đến

tình trạng mang Hib ở trẻ lớn hơn 18 tháng [27], [55], nhưng sự định cư của

vi khuẩn có ảnh hưởng như thế nào đến nồng độ kháng thể kháng PRP vẫn

cũn chưa biết rừ Kháng nguyên Hib có thể hấp thụ qua màng nhày hoặc toàn

bộ vi khuẩn có thể vượt qua hàng rào này trong thời gian định cư trên cơ thể, dẫn đến trạng thái vi khuẩn huyết không có triệu chứng ở mức độ thấp và đáp

ứng của hệ thống miễn dịch đã sinh ra kháng thể Vi khuẩn Hib cũng có thể bị

thực bào bởi các tế bào lympho (lymphoid cells) ở màng nhày họng dẫn đến sản xuất huyết thanh đặc hiệu hoặc kháng thể màng nhày, có hoặc không có vi khuẩn xõm nhập vào trong mạch mỏu [29]

Đã có nhiều tranh cói về vấn đề có một tỷ lệ cao trẻ em mang kháng thể

kháng PRP nhưng tỷ lệ những đứa trẻ này mang Hib lại thấp nhằm xác định nguồn gốc khác ngoài Hib có thể dẫn đến sự gia tăng kháng huyết thanh

kháng PRP Tuy nhiên, sự khó khăn trong kỹ thuật xác định người lành mang

Hib có thể đã dẫn đến đánh giá tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ dưới mức

thực tế Với nhiều kỹ thuật nuôi cấy có độ nhạy cao, hiện nay nhờ các phương

pháp xác định tỷ lệ trẻ mang Hib hoặc trẻ bị mắc nhiễm trùng đã giải thích

được sự xuất hiện của miễn dịch tự nhiên [28]

1.2.2 Tình hình bệnh viêm màng nóo do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi từ các nghiên cứu trong và ngoài nước

- Hib là căn nguyên hàng đầu gây viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi: Hib được xác định là căn nguyên phổ biến nhất gây các bệnh nhiễm

khuẩn ở trẻ em Viờm màng não chiếm hơn 50% các bệnh nhiễm trùng xâm

hại do Hib, tiếp theo là viêm phổi (12 - 17%), viờm mụ tế bào (6 - 15%) và

nhiễm trùng huyết (2 - 11%) Ngoài ra, các nhiễm trùng riêng lẻ như: viờm

xương tủy, viêm khớp, viêm màng ngoài tim xảy ra ít phổ biến Người lớn

khỏe mạnh ít mắc bệnh xâm hại do Hib [24]

Hầu hết tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao do Hib trên toàn thế giới xảy

ra ở trẻ dưới 5 tuổi Vai trò của Hib trong gây viêm màng não đã được chứng

minh có tầm quan trọng hơn so với những nhiễm trùng ở cơ quan khỏc trờn

cơ thể Vì vậy, tỷ lệ Hib gây viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi được dùng

như một tiêu chuẩn đánh giá so sánh gánh nặng bệnh tật mà vi khuẩn này gây

ra giữa các nước [128] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), sau khi phân

tích kết quả của 229 nghiên cứu điều tra thông tin về viêm màng não do Hib

ở trẻ dưới 5 tuổi tại nhiều nước trên thế giới với 30.000 trẻ mắc viêm màng não và hơn 2.100 trường hợp tử vong Kết quả nghiên cứu được xác định từ những địa điểm Tổ chức Y tế Thế giới quan tâm, cụ thể là 43 (19%) từ châu Phi, 44 (19%) từ châu Mỹ, 23 (10%) từ phía Đông Địa Trung Hải, 72 (31%)

từ châu Âu, 12 (15%) từ Đông Nam châu Á và 35 (15%) từ Đông Thái Bình Dương Trong đó, 62% trong số 229 nghiên cứu được thực hiện ở các nước

phát triển [128]

Viêm màng não (Hib)

Viêm tai giữa (Hi không có vỏ)

Viêm xoang (Hi không có vỏ)

Viêm nắp thanh quản (Hib)

Viêm khí quản (Hi không có vỏ)

Nhiễm trùng huyết (Hib)

Viêm phổi (Hib và Hi

không có vỏ)

H influenzae

Hình 1.7: Phân bố các vị trí nhiễm trùng bởi Hib và H influenzae

không có vỏ ở một số cơ quan [89]

+ Những nghiên cứu ở trong nước: viêm màng não là một trong những bệnh nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương hay gặp ở trẻ em tại Việt Nam Theo thống kê tại viện Nhi trung ương trong 10 năm (1983-1992) có 1.958 bệnh nhân viêm màng não vào viện, đứng hàng thứ sáu trong các bệnh nhiễm trùng phải nhập viện Trên thế giới, bệnh đang có xu hướng giảm dần ở các nước phát triển song hầu như không thay đổi ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các nước châu Phi [1], [3], [11]

Tại Việt Nam, viêm màng não do căn nguyên vi khuẩn Hib ít được

quan tâm vào những năm trước 1994 Vì vậy, những nghiên cứu về viêm

màng não do Hib tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa nhiều Tuy nhiên,

nghiên cứu của Phạm Nhật An và cộng sự năm 2001 [1] với tất cả những bệnh nhân từ 0 đến 15 tuổi được chẩn đoán là viêm màng não vào điều trị tại viện Nhi trung ương từ tháng 12 năm 1998 đến tháng 12 năm 1999, cho thấy kết quả về căn nguyên gây viêm màng não được xác định ở trẻ em nói chung

theo thứ tự hay gặp là: H influenzae (50%), S pneumoniae (22,06%), N.meningitidis (11,76%), Streptococcus (5,88%) và một số loại vi khuẩn

khác chưa có điều kiện xác định chi tiết về typ huyết thanh của mỗi loại vi khuẩn Trong đó, căn nguyờn gõy viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi theo thứ

tự hay gặp là H influenzae (64,7%), S pneumoniae (28,6%), N meningitidis (7,84%) và Staphylococci (1,96%) [3] Gần đõy, một số nghiên cứu khác của

Phan Lê Thanh Hương, Đặng Đức Anh cùng cộng sự về vai trò gây viêm

màng não của Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc từ

2000 - 2002 cũng đã cho thấy Hib vẫn đứng đầu trong những căn nguyờn gõy

viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi do vi khuẩn, chiếm 48,8% [11]

+ Những nghiên cứu ở nước ngoài: Tại các nước châu Á, theo nghiên

cứu ở nhiều nước của Peltola H năm 1999 cũng cho thấy được Hib là căn nguyên hàng đầu gây ra viêm màng não, cụ thể: Hib chiếm 34%, S.pneumoniae

chiếm 23%, N meningitidis chiếm 14%, Salmonella chiếm 4% và 25% do các

loại vi khuẩn khác Bên cạnh đó, nghiên cứu của Yang Y tại Hefei - Trung

Quốc cũng cho thấy được viêm màng não do Hib chiếm 51,7%; N meningitidis (Nm) là 38,3%, và S pneumoniae (Sp) là 8,3% [53], [71]; tại Đài Loan Hib

cũng chiếm 42% tỷ lệ căn nguyên gây viêm màng não [77], [93]

Những nước khỏc trờn thế giới, hầu hếu các nghiên cứu đều cho thấy

Hib là căn nguyên chủ yếu gây viêm màng não Điển hình như nghiên cứu ở

Mỹ năm 1990 cho thấy 3 vi khuẩn hàng đầu gây viêm màng não cho trẻ dưới

5 tuổi là: Hib, S pneumoniae, N meningitidis lần lượt chiếm tỷ lệ là 45%, 18% và 14% [94]; tại Oman năm 2008 vi khuẩn Hib, S pneumoniae, N.meningitidis gây viêm màng não lần lượt chiếm tỷ lệ là 22%, 15% và 11% [89] Tuy nhiên, hiện nay ở những nước phát triển đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia thì tỷ lệ viêm màng não do Hib ở trẻ

dưới 5 tuổi giảm xuống rất thấp, có thể xuống gần 0% [58]

- Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trong quần thể dân chúng:

+ Những nghiên cứu ở trong nước: Theo một nghiên cứu dịch tễ học viêm màng não do vi khuẩn dựa trên cộng đồng tại Hà Nội (Phan Lê Thanh

Hương, Đặng Đức Anh), cho thấy viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi là

10/100.000, trong đó lứa tuổi 1 - 23 tháng chiếm tỷ lệ cao nhất 26/100.000 [1], [3], [10]

- Những nghiên cứu ở nước ngoài: Qua phân tích số liệu từ 229 nghiên

cứu trên toàn thế giới về viêm màng não do Hib, kết quả tỷ lệ viêm màng não

do vi khuẩn này ở trẻ dưới 5 tuổi trung bình là 22,8/100.000 (với trung vị là 18

và dao động trong khoảng 0,9 - 94,6) [67] Trong đó, tại một số nước phát triển trên thế giới ở thời kỳ trước khi sử dụng vacxin, tỷ lệ mắc viêm màng não do

Hib cũng báo cáo khoảng 11 - 50/100.000 ở lứa tuổi 0 - 4 tuổi [78], [127]

Ở các nước châu Á, theo nghiên cứu tại nhiều nước của Peltola H năm

1999 cho thấy tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi vào khoảng

25/100.000 Cụ thể, các nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan cũng đã có nhiều nghiên cứu cho kết quả tương tự lần lượt là: 19,2/100.000 (năm 1996) [129], 26,6/100.000 (2004) Tuy nhiên, nghiên cứu năm 2000 tại Philippin và

Ấn Độ cho thấy tỷ lệ này khá cao, lần lượt là 95/100.000 (1994 - 1996) [70], 86/100.000 (2008) [78]

Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não do Hib hiện nay đã giảm một cách đáng

kể ở những nước đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc

gia Minh chứng cho vấn đề này, một số nghiên cứu tại Isarel, Đài Loan cho

thấy tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi giảm xuống còn khoảng 5/100.000 sau khi sử dụng vacxin phòng Hib tại các nước này [93]

- Phân bố tỷ lệ viêm màng não do Hib theo các nhóm tuổi

+ Những nghiên cứu ở trong nước: Theo Phan Lê Thanh Hương, tất cả

các trường hợp viêm màng não do Hib tập trung ở lứa tuổi từ 1 - 23 tháng (88%) [10], [11] Trong khi đó, tỷ lệ trẻ mắc viêm màng não do Hib giảm dần

ở các lứa tuổi tiếp the o

+ Những nghiên cứu ở nước ngoài: Qua nghiên cứu tổng thể về tỷ lệ

viêm màng não do Hib tại nhiều nước trên thế giới, nhìn chung viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi có sự phân bố khác nhau trong từng nhóm tuổi,

như sau: 1 - 5 tháng chiếm 22,6%; 6 - 11 tháng chiếm 35,6%; 12 - 23 tháng chiếm 23,8% Tuy nhiên, qua thống kê từ các nghiên cứu đều cho thấy ở lứa

tuổi từ 0 - 11 tháng là có tỷ lệ viêm màng não do Hib cao nhất [128] Cụ thể,

một điều tra tiến cứu được thực hiện từ năm 1997-1999 tại Ấn Độ để đánh giá

tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib, cho thấy: ở lứa tuổi từ 0 - 4 là 15,9/100.000

(trong đó, ở lứa tuổi từ 24 - 59 tháng là 7,1/100.000; ở lứa tuổi từ 0 - 11 tháng

là 32/100.000 và ở lứa tuổi từ 12 - 23 tháng là 19/100.000) [79]

Như vậy, hầu hết các nghiên cứu trong và ngoài nước đều cho thấy vi

khuẩn Hib gây viêm màng não chủ yếu gặp ở lứa tuổi 1 - 23 tháng

- Tỷ lệ tử vong do viêm màng não bởi căn nguyên Hib ở trẻ dưới 5 tuổi

+ Tại Việt Nam, Phan Lê Thanh Hương cho thấy tỷ lệ tử vong của viêm

màng não do Hib là 3% và các di chứng nặng do Hib (như: điếc - nghễnh

ngãng, mù - giảm thị lực, chậm phát triển tâm thần, động kinh, não úng thủy và trạng thái thực vật) chiếm 13% [11] Điều này cho thấy gánh nặng bệnh tật do

Hib gây ra rất lớn không những cho gia đình bệnh nhân mà còn cho toàn xã hội

+ Trên thế giới, một điều tra phân tích kết quả của 229 nghiên cứu về

viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi, cho thấy tỷ lệ tử vong trung bình là

13,8% (với trung vị 10% và dao động trong khoảng 0,0 - 65%) Trong đó, tỷ

lệ chết trung bình là 17,3% ở các nước đang phát triển, so sánh với 3,2% ở các nước công nghiệp Ngoài ra, tỷ lệ chết thấp ở châu Âu là 4,1% và cao ở châu Phi là 27,6% [128]

- Vai trò của yếu tố miễn dịch ảnh hưởng đến tỷ lệ viêm màng não do Hib ở các lứa tuổi dưới 5

+ Yếu tố miễn dịch: [28]

Sự cảm thụ với những nhiễm khuẩn do Hib gia tăng ở trẻ sơ sinh và trẻ

nhỏ, nguyên nhân trực tiếp bởi cơ thể không có đầy đủ kháng thể kháng PRP Nồng độ kháng thể kháng PRP trong huyết thanh liên quan đến lứa tuổi, do đó

mức độ cảm thụ đối với Hib cũng tương quan trực tiếp với lứa tuổi Trẻ sơ

sinh có kháng thể thu được tạm thời IgG kháng PRP do mẹ truyền qua rau thai, rồi giảm dần sau tháng thứ nhất Miễn dịch tự nhiên thu được thường không xảy ra trước lứa tuổi từ 2 đến 4 tuổi Vì vậy, trẻ em ở lứa tuổi giữa 2

tháng đến 2 tuổi có nguy cơ cao nhất dễ mắc bệnh xâm nhập do Hib Cho nên, trên thực tế, tỷ lệ viêm màng não do Hib không đồng đều ở các nhóm tuổi mà

gặp nhiều nhất ở lứa tuổi dưới 23 tháng [10], [11], [94]

Kháng thể kháng PRP thu được không phải là kết quả duy nhất do sự

định cư của Hib trên bề mặt niêm mạc Nhiều trẻ em phát triển tự nhiên kháng

thể kháng PRP mặc dù không nhiễm các chủng typ b Điều này có thể do kết quả định cư của những vi khuẩn cú cỏc kháng nguyên vỏ gây phản ứng chéo

với Hib, như nhiễm vi khuẩn đường ruột Escherichia coli K100 Trẻ em dưới

2 tuổi có nồng độ kháng thể kháng PRP thấp hoặc không phát hiện thấy đáp

ứng với nhiễm khuẩn do Hib hoặc vacxin vỏ PRP Những kháng thể kháng lại

kháng nguyên thân (antisomatic) hay loại kháng nguyên protein được đáp ứng

do lây nhiễm các chủng H influenzae không có vỏ cũng có thể bị phản ứng chéo được với các chủng H influenzae có vỏ Miễn dịch thụ động do kháng thể có tác dụng lên trên phần oligosaccharide của Haemophilus có tác dụng

bảo vệ trong gây bệnh thực nghiệm, nhưng sự hiện diện của chúng trong huyết

thanh ở giai đoạn cấp của một số trẻ sơ sinh bị nhiễm khuẩn do Hib cũng khêu

gợi rằng chúng không có tác dụng bảo vệ trong bệnh cảnh lâm sàng [28]

+ Vai trò của vacxin đặc hiệu trong phòng bệnh viêm màng não do Hib: Vacxin phòng Hib được triển khai lần đầu tiên vào cuối năm 1985 nhằm

để giải quyết 3 mối quan tâm chính, đó là: tỷ lệ tử vong cao bởi bệnh nhiễm

trùng do Hib gây ra, di chứng nặng nề ở những trẻ viêm màng não do Hib xảy

ra với tỷ lệ cao và sự gia tăng đề kháng của vi khuẩn này với các kháng sinh thông dụng Kháng thể kháng PRP trong huyết thanh được biết là yếu tố căn

bản để bảo vệ cơ thể trước nguy cơ tấn công của Hib Vỡ vậy, các nỗ lực đã

được thực hiện để tăng nồng độ kháng thể trong máu bằng cách sử dụng vacxin sản xuất từ vỏ polysaccharide tinh chế Trong khi vacxin PRP có hiệu quả trong bảo vệ trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên chống lại các bệnh nhiễm trùng xâm

hại do Hib (hiệu quả ước tính đạt 90%), nhưng không có tác dụng bảo vệ với lứa tuổi bé hơn, đõy là lứa tuổi có tỷ lệ mắc bệnh do Hib cao nhất [94]

Hiện tượng vacxin PRP không có khả năng bảo vệ cho trẻ ở lứa tuổi

nhỏ hơn đối với Hib được giải thích do cấu trúc hóa học vỏ polysaccharide

của vi khuẩn này PRP, một dạng trùng hợp của các đường pentose, không kích thích được đáp ứng miễn dịch độc lập của tế bào lympho T và không phải là một kháng nguyên mạnh, đặc biệt là ở trẻ nhỏ Ngoài ra, kháng nguyên carbohydrate, chẳng hạn như kháng nguyên polysaccharide của vỏ tế bào một số vi khuẩn được mô tả là kháng nguyên typ 2 không phụ thuộc lympho T (TI-2 antigen: T cell independent type 2 antigen) Tuy nhiên, đối với nhiều kháng nguyên được xếp vào loại phụ thuộc hay không phụ thuộc lympho T dựa nhiều vào kiểu đáp ứng miễn dịch hơn là sự liên quan của lympho T trong kích thích đáp ứng miễn dịch đó Ở trẻ nhỏ, kháng thể đáp ứng với kháng nguyên không phụ thuộc lympho T thấp, chủ yếu đáp ứng với

tỷ lệ cao loại kháng thể IgM và không có hỗ trợ đáp ứng miễn dịch khi lặp lại các liều kháng nguyên [28], [109]

Biến đổi kháng nguyên polysaccharide thành kháng nguyên phụ thuộc lympho T để trẻ nhỏ có thể đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn, đòi hỏi kháng nguyên này phải được liên kết đồng hóa trị với một số phân tử protein, do đó vacxin cộng hợp (conjugated vaccine) ra đời Hầu hết những kết quả nghiên cứu về sự khác biệt của vacxin cộng hợp, cho thấy kháng nguyên khi được liên kết với phân tử protein sẽ có khả năng kích thích được đáp ứng miễn dịch phụ thuộc lympho T Cho dù kháng nguyên polysaccharide được gắn với một phân tử protein, cấu trúc bị thay đổi nhưng kháng nguyên này vẫn mang tính đặc hiệu cao và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh hơn so với kháng nguyên tinh chất ban đầu Vacxin cộng hợp có khả năng đem đến miễn dịch

chống lại Hib cho trẻ dưới 6 tháng [31]

Có 4 loại vacxin phòng Hib đã trải qua đỏnh giỏ trờn lâm sàng: PRP-D

(Connaught Laboratories), PRP-T (Pasteur – Meriéux), PRP-OMPC (Merck