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VẤN ĐỀ NHIỄM ĐỘC TỐ TẢO CỦA ỐC NHỒI Trinh Tam Kiet, Duong Duc Tien, H.. Mặt khác ốc nhồi cũng như các nhuyễn thể khác, trong quá trình dinh dưỡng rất rễ bị nhiễm bởi các tảo độc trong

VẤN ĐỀ NHIỄM ĐỘC TỐ TẢO CỦA ỐC NHỒI

Trinh Tam Kiet, Duong Duc Tien,

H Schubert, K Reinhardt, J Dahlmann, B Luckas,

Ốc nhồi (Ampullariidae) phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt

đới, là nguồn thực phẩm quý, vật nuôi trong bể cá để rọn sạch tảo và một vài đại diện là vật gây hại mùa màng Mặt khác ốc nhồi cũng như các nhuyễn thể khác, trong quá trình dinh dưỡng rất rễ bị nhiễm bởi các tảo độc trong chuỗi thức

ăn, đặc biệt là PSP (trong đó thường gặp nhất là Saxitoxin) Nếu con người ăn phải nhuyễn thể có nhiễm độc tố PSP sẽ dẫn đến tử vong do suy hô hấp Vì vậy ở rất nhiều nước nhập khẩu thuỷ sản, việc kiểm tra độc tố tảo (trước hết là độc tố PSP) là điều bắt buộc Từ nhiều năm trở lại đây, Việt Nam là một nước xuất khẩu thuỷ sản lớn, trong đó đặc biệt quan trọng là EU, Mỹ và Nhật Bản Bởi vì giáp xác và

nhuyễn thể đã được chứng minh có hàm lượng độc tố đáng

kể nên việc kiểm tra chúng khi xuất sang thị trường trên là cực kỳ quan trọng ở đây, chúng tôi đã đề cập đến một ví

dụ hàng xuất khẩu ốc nhồi từ Việt Nam sang thị trường EU

để chứng tỏ công việc này quan trọng như thế nào

Những nghiên cứu nhằm vào sản phẩm thịt ốc nhồi đông lạnh sâu của cơ sở chế biến hải sản Phú Thành (Kiên

Giang) được xuất sang CHLB Đức qua Hà Lan Nhằm mục đích kiểm tra lượng độc tố PSP trong hàng nhập khẩu tháng 8-2003, kỹ thuật HPLC/FLD đã được đưa vào sử dụng Người ta đã thông báo một lượng PSP chứa trong sản phẩm trên là 1029 µg/kg Những phân tích này được lặp lại tại Đại học Tổng hợp Jena (CHLB Đức) ở phương pháp

HPLC/FLD cũng quan sát thấy một đỉnh có thể cho là dc STX Tuy vậy, những nghiên cứu lặp lại ở các mẫu trên tại Jena cho phép chứng minh đó là những chất độc tố chứa bên trong của ốc, mà không có độc tính vốn có của PSP Sự kiểm tra an toàn thực phẩm và độc tố tại Jena được phối hợp giữa phương pháp hoá - lý ( HPLC/FLD/MS ) và kiểm tra sinh học (Maus- Bioassay) đều cho những kết quả

chứng minh rõ ràng là thịt ốc nhồi đông lạnh nhập khẩu từ Việt Nam không có độc tố STX cũng như các độc tố PSP khác Các kết quả trên cho thấy trong khi kiểm tra chất

lượng hàng thuỷ sản xuất nhập khẩu phải sử dụng phương

pháp hoá - lý đã cải tiến kết hợp với kiểm tra sinh học trong khi giám định

Apfelschnecken (Ampullariidae) kommen weltweit in

tropischen Regionen vor Dabei stellen manche Arten

hochwertige Lebensmittel dar, während andere für den

Aquarianer interessant sind, da sie gemeinsam mit Fischen gehalten das Wasser „algenfrei“ machen

Wegen dieses Fressverhaltens und weil sie sich sowohl im Süßwasser als auch im Brackwasser schnell vermehren, können Apfelschnecken aber auch als Schädlinge auftreten

So führte z.B das massenhafte Auftreten der gelben

Apfelschnecke in Vietnam zu großen Ernteverlusten

Unabhängig davon ist bekannt, dass sogenannte

„Algenblüten“ zu einer Kontamination von Krusten- und Schalentieren mit Algentoxinen führen können, wobei die starke Vermehrung von toxischen Algen Harmful Algal Blooms (HABs) genannt wird Vor allem einige marine Mikroalgen und bestimmte Cyanobakterien produzieren Substanzen, die als Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) –

Toxine bezeichnet werden, von denen Saxitoxin das

bekannteste PSP-Toxin darstellt Diese Toxine können von Muscheln und Schnecken aufgenommen werden, und

besonders HABs führen zu sehr hohen PSP-Belastungen

Werden mit PSP-Toxinen kontaminierte Tiere verzehrt, kommt es unmittelbar danach zu schweren Erkrankungen des Konsumenten bis hin zum Tod durch Atemlähmung Deshalb wurden in verschiedenen Ländern

Qualitätssicherungssysteme verbunden mit einer

Importkontrolle, die auch die Prüfung von Seafood auf

Algentoxine (vor allem PSP-Toxine) einschließt,

aufgebaut

Seit einigen Jahren exportiert Vietnam Seafood, und

darunter befinden sich neben Muscheln und Shrimps auch Apfelschnecken Weil vor allem Krusten- und Schalentiere besonders hohe Toxin-Gehalte aufweisen können, wird der Handel mit diesen Tieren besonders streng kontrolliert, und immer erfolgt auch eine Überprüfung der PSP-Gehalte Nachfolgend soll am Beispiel des Exports von

Apfelschnecken aus Vietnam nach Europa deutlich

gemacht werden, wie wichtig eine Kontrolle von Seafood auf eine mögliche Kontamination mit Algentoxinen bereits vor Ort beim Erzeuger ist

Apfelschnecken - eine interessante Tierart

Das attraktive Äußere und die relative Größe (5-15 cm) trugen maßgeblich dazu bei, dass Apfelschnecken bei

Aquarianern und Gourmets immer beliebter wurden

Allerdings gibt es auch viele missverständliche

Informationen hinsichtlich dieser Tiere So werden sie in

den bekanntesten Aquaristik-Büchern als Ampullaria gigas oder Ampullaria cuprina bezeichnet, obwohl diese Namen

falsch und veraltet sind In der gegenwärtig verwendeten Nomenklatur werden Apfelschnecken in sieben Gattungen

unterteilt: Asolene, Felipponea und Marisa sind die

Gattungen der Neuen Welt (Südamerika, Zentralamerika

und der Süden der USA), während Afropomus, Lanistes und Saulea in Afrika heimisch sind Die Gattung Pila

kommt sowohl in Afrika als auch in Asien vor

Apfelschnecken bewohnen Sümpfe, Bäche, Teiche, große Seen und Flüsse Dabei werden stehende Gewässer

bevorzugt, und nur wenige Arten passen sich an fließende Gewässer mit starker Strömung an Die Lungen/Kiemen-Kombination zeigt die Anpassung der Apfelschnecken an Standorte mit sauerstoffarmem Wasser wie Sümpfen und seichten Seen Ein anderer Vorteil der Atmung zusammen mit einer „Tür“ (operculum) am Schneckenhaus ist die

Fähigkeit, Dürreperioden zu überstehen

Handelsübliche Arten für den Einsatz in Aquarien sind die

Apfelschnecken Pomacea bridgesii, Pomacea canaliculata, Marisa cornuarietis, Pomacea paludosa Diese können in

jedem Aquarium gemeinsam mit Fischen leben und dabei die überschüssige Vegetation – das sind vor allem Algen – vernichten

Abb 1: Die Apfelschnecken a) Pomacea bridgesii und b)

Pomacea canaliculata *

lebensmittelrechtlichen Bestimmungen, denn es muss

sichergestellt werden, dass Apfelschnecken, die für die

menschliche Ernährung vorgesehen sind, keine

krankheitsverursachenden Keime enthalten Auch dürfen die Konzentrationen an Algentoxinen die gesetzlich

vorgeschriebenen Grenzwerte nicht übersteigen

Da Apfelschnecken eine große Anzahl Mikroorganismen in ihren Eingeweiden aufweisen, müssen bei der Verarbeitung

die hygienischen Vorschriften eingehalten werden, damit die Qualität der Ware nicht absinkt Auch ist die Mikroflora der Apfelschnecken mit einer starken Enzymaktivität

verbunden, so dass mit Algen aufgenommene Toxine in den Schnecken sehr schnell metabolisiert werden

PSP- Toxine

Weltweit wird jedes Jahr von teilweise tödlich

verlaufenden Vergiftungen nach dem Verzehr von mit

Algentoxinen kontaminierter Seafood berichtet [1-3] Dabei ist die bekannteste und gleichzeitig gefährlichste

Intoxikation durch Schalentiere Paralytic Shellfish

Poisoning (PSP), verursacht durch eine Gruppe von 18

Neurotoxinen unterschiedlicher Toxizität mit Saxitoxin (STX) als Leitsubstanz (Abb.2)

Abb 2: Chemische Struktur der PSP-Toxine

PSP-Toxine werden vor allem von marinen Dinoflagellaten synthetisiert, und nach der Akkumulation in Krusten- und Schalentieren werden sie teilweise in Derivate mit stärkerer Toxizität umgewandelt [4-7] Dabei können bei einigen Schalentieren enzymatisch sowohl Epimerisierungen als auch Dehydroxylierungen, Esterspaltungen und teilweise sogar Decarboxylierungen erfolgen [5] So werden in

Muscheln durch Epimerisierung die instabileren ß-Formen C2, GTX3 und GTX4 in die stabileren -Formen C1, GTX2 und GTX1 überführt [4] Daneben bewirken natürlich

vorkommendea chemische Reduktanden mit SH-Gruppen, beispielsweise Glutathion und Cystein, unter anaeroben Bedingungen eine Metabolisierung [7] Beispiele hierfür sind u.a die Reduktion von Neo zu STX bzw von GTX1 und GTX4 zu GTX2 und GTX3 sowie die Bildung von Carbamoyl- und Decarbamoyl-Toxinen aus N-

Sulfocarbamoyl-Toxinen Die wichtigste Umwandlung ist jedoch die Bildung von Decarbamoyl-Saxitoxin (dcSTX) aus Carbamoyl-Toxinen [2, 5]

Im Sinne eines effektiven Verbraucherschutzes und um die

betroffenen Wirtschaftszweige vor erheblichen finanziellen Verlusten zu bewahren, ist die Kontrolle der Interaktion der Toxine in der Umwelt sowie mit biologischem Material, nicht zuletzt wegen der offensichtlichen Zunahme toxischer Algenblüten und der damit verbundenen steigenden

Kontamination von Nahrungsmitteln mariner Herkunft mit PSP-Toxinen, unerläßlich Allerdings ist Voraussetzung für ein besseres Verständnis der Rolle von Algentoxinen in der marinen Umwelt die Entwicklung leistungsfähiger

analytischer Verfahren zur quantitativen Erfassung der

Toxine, wobei in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte erzielt werden konnten

Analytik

Das international verbindlich vorgeschriebene Verfahren zur Erfassung von PSP-Toxinen aus marinen Organismen und Lebensmitteln mariner Herkunft ist der Maus-

Bioassay, d.h ein auf einem Tierversuch basierendes

Analysenverfahren [2]

In Europa gibt es aber starke Widerstände gegen

Tierversuche, und deshalb wurde der Maus- Bioassay in Deutschland durch ein physikalisch-chemisches Verfahren ersetzt Als Routineverfahren zur Kontrolle von Seafood auf PSP-Toxine kommt eine chromatographische (HPLC) Methode mit Fluoreszenzdetektion (FLD) zum Einsatz Wenn Überschreitungen des Grenzwertes von 800 µg PSP pro Kilogramm Seafood (= 800µgSTXequ./kg) gefunden werden, müssen die Ergebnisse des chromatographischen Verfahrens jedoch zusätzlich massenspektrometrisch

(LC/MS) und über den Maus-Bioassay abgesichert werden

In jedem Fall ist aber nur das Ergebnis des Maus-Bioassays juristisch verbindlich, und auf dem Ergebnis des

Tierversuches gründet sich die Entscheidung, ob das

Lebensmittel importiert oder exportiert werden darf [2, 12]

Viele gegenwärtig im Routinebetrieb zur PSP- Bestimmung eingesetzte HPLC-Verfahren basieren auf der

Ionenpaarchromatographie, jedoch sind diese Verfahren aufgrund der hohen Konzentrationen an nichtflüchtigen

Substanzen im Eluenten nicht für die direkte Kopplung an ein Massenspektrometer (LC/MS) geeignet [8-11] Der Einsatz der LC/MS-Kopplung ist jedoch notwendig, um selektiv detektierte Toxine spezifisch nachzuweisen sowie

um bisher noch nicht bekannte Strukturen ebenfalls

toxischer Verbindungen aufzuklären In diesem

Zusammenhang erwies es sich als wichtig, dass eine

HPLC/FLD- Methode entwickelt wurde, die auch eine

Kopplung an ein Massenspektrometer ermöglicht [13]

Dieses HPLC/FLD/MS-Verfahren wurde zusätzlich zum Maus-Bioassay eingesetzt, um von Vietnam nach Europa exportierte Apfelschnecken auf PSP-Toxine zu

untersuchen Die hierzu verwendete Apparatur zeigt Abb.3

Abb 3: HPLC-System mit Ionenaustauschersäulen und MS-Detektion sowie elektrochemischer Oxidation, Fluoreszenzdetektion und Fraktionssammler

Nachfolgend wird die mögliche Kontamination von

Apfelschnecken mit Algentoxinen betrachtet, und speziell die Untersuchungen im Hinblick auf eine quantitative

Erfassung von PSP-Toxinen, die für einen ungehinderten Handel mit Seafood unerlässlich sind, werden am Beispiel der Untersuchung von Importware aus Vietnam nach

Europa näher beschrieben

Untersuchung von Apfelschnecken aus Vietnam

Das Probenmaterial (Proben Nr 01565 und Nr 01566)

wurde vom Niedersächsischem Landesamt für

Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Cuxhaven,

an die Friedrich-Schiller-Universität nach Jena gesandt, damit hier sowohl der Maus-Bioassay als auch die Analyse mittels HPLC/FLD/MS durchgeführt wird Bei den zur

Untersuchung übersandten Proben handelte es sich um

Apfelschneckenfleisch (tiefgefroren), das aus Vietnam (Phu Tanh Frozen Factory, Kien Giang) über die Niederlande nach Deutschland exportiert worden war Zur Kontrolle der Ware auf PSP-Toxine im August 2003 war ein HPLC/FLD- Verfahren zur Anwendung gekommen, und es wurde ein

PSP-Gehalt von 1029µg/kg ermittelt

Allerdings wurde ausschließlich Decarbamoyl- Saxitoxin (dcSTX) gefunden, das eine im Vergleich zu Saxitoxin

(STX) deutlich geringere Toxizität aufweist (Toxicity

factor dcSTX: 0.43, vgl Abb 2), so dass die

PSP-Belastung des Probenmaterials nur 442.5µg STXequ./kg betrug Damit wurde der international verbindliche

Grenzwert für den PSP-Gehalt von Krusten-und

Schalentieren von 800µg STXequ./kg zwar nicht

überschritten, jedoch lag der PSP-Gehalt der Proben

deutlich über dem Gehalt von 200µgPSP/kg, der als

„Warnwert“ in Anl.3 zu §17 der in der Bundesrepublik

Deutschland geltenden Fischhygiene- Verordnung

aufgeführt ist [14]

Als problematisch erwies sich jedoch, dass dieser Befund nicht massenspektrometrisch abgesichert war, und

außerdem waren die dcSTX-Konzentrationen im

Apfelschneckenfleisch aus Vietnam nicht mit Hilfe des im Zweifelsfall durchzuführenden Maus-Bioassays kontrolliert

worden

Diese Analysen wurden in Jena nachgeholt, und sie

ergaben ein übereinstimmendes Ergebnis Bei der

HPLC/FLD-Methode mit pre-column Derivatisierung [10], die in Cuxhaven angewendet wurde, war im

Chromatogramm bei der Retentionszeit von dcSTX ein Peak sichtbar gewesen, der deshalb als dcSTX ausgewertet wurde Dieser Peak erwies sich im Ergebnis der in Jena durchgeführten Analysen als ein Inhaltsstoff der

Apfelschnecken, jedoch ohne die toxische Wirkung eines PSP-Toxins Das geht aus Abb 4 und Tab 1 hervor

Abb 4: HPLC/FLD – Bestimmung von PSP Toxinen

nach post-column Derivatisierung a) PSP-Standardmix b) Probe 01565 c) Probe 01566

chromatogr Bedingungen vgl [17]

Zwar tauchte nach der chromatographischen Trennung der Extrakte aus den Apfelschnecken auch in Jena in den

HPLC/FLD-Chromatogrammen ein verdächtiger Peak bei

Rt 7.9 min auf (vgl Abb.4), jedoch stimmten die

Retentionszeiten bei den hier angewandten HPLC/FLD- und HPLC/FLD/MS-Methoden mit post-column

Derivatisierung [13,17] weder mit dcSTX noch mit einem anderen PSP-Toxin überein Dadurch konnte die

Anwesenheit von PSP-Toxinen im Fleisch der

Apfelschnecken aus Vietnam (jedenfalls für die zur

Untersuchung gelangte Ware) ausgeschlossen werden

Dennoch blieb die Frage ungeklärt, ob der nicht

identifizierte Peak in den Chromatogrammen von einer Substanz aus den Apfelschnecken mit ebenfalls toxischen Eigenschaften herrührte, und auch deshalb wurde der

Maus-Bioassay [16] zusätzlich zu den HPLC-Verfahren durchgeführt Dabei wurden die gleichen Extrakte

eingesetzt, die vorher chromatographisch untersucht

worden waren [17]

Wie aus den in Tab 1 dargestellten Ergebnissen ersichtlich ist, ergaben sich keine Hinweise auf eine PSP-ähnliche

Wirkung, hervorgerufen durch den aus den Apfelschnecken extrahierten Inhaltsstoff

Tab 1: Ergebnisse des Maus-Bioassays für die

Untersuchung von Apfelschneckenfleisch aus Vietnam

auf PSP-Toxine

Zusammenfassung

Apfelschnecken (Ampullariidae) sind nicht nur für

Aquarianer interessant, sondern einige Arten stellen auch hochwertige Lebensmittel dar

Wegen des Lebens im aquatischen Milieu, vor allem auch

im Brackwasser entlang von Küsten, besteht eine erhöhte Gefahr, dass die Schnecken nicht nur Algen sondern auch die von diesen produzierten Toxine aufnehmen Dabei

können in Apfelschnecken besonders die von