BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA NẤM PHIẾN ĐỐM VÂN LƯỚI PANAEOLUS AFF. RETIRUGIS" docx

Ví dụ như: từ một số loài nấm độc thuộc chi: Psilocybe, Conocybe, Stropharia, Panaeolus, Copeladia, Chlorophyllum…con người đã chiết xuất được nhiều chất có hoạt tính sinh học, mà chủ

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA NẤM PHIẾN ĐỐM VÂN LƯỚI

PANAEOLUS AFF RETIRUGIS

Hoàng Văn Vinh, Trịnh Tam Kiệt

Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà nội

Đỗ Ngọc Liên

Trường ĐHKHTN- ĐHQG Hà nội

I MỞ ĐẦU

Nấm độc có thể gây hại cho con người và động vật có vú nếu ăn phải chúng Tuy nhiên, các “độc dược” thu nhận được từ nấm nếu biết sử dụng đúng cách lại là một nguồn dược liệu vô cùng quý, có ứng dụng rất lớn đối với việc điều trị một số bệnh trong y học Ví dụ như: từ một số loài

nấm độc thuộc chi: Psilocybe, Conocybe, Stropharia,

Panaeolus, Copeladia, Chlorophyllum…con người đã chiết

xuất được nhiều chất có hoạt tính sinh học, mà chủ yếu là các alkaloid, ở nồng độ cao mang tính độc, có thể giết chết

người và động vật Tuy vậy với nồng độ thấp, ở liều lượng thích hợp nó lại là dược liệu quý có tác dụng hỗ trợ trong khi sản phụ sinh nở, chống bệnh biếu cổ, chống nhức đầu, cũng như các bệnh thần kinh và tim mạch khác Đăc biệt một số loài nấm có chứa độc tố alkaloid gây ra trạng thái ảo giác gọi là hallucinogenic mushroom có ứng dụng điều trị các bệnh tâm thần, mất trí nhớ…[3]

Chính vì nhữn lý do trên mà nấm độc ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Và nghiên cứu này cũng nhằm góp phần nhỏ vào sự hiểu biết chung về nấm độc đặc biệt là nấm độc Việt Nam

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu:

- Nấm Panaeolus aff retirugis được thu hái trên bãi cỏ

chăn thả trâu bò tại Hà Nội và Gia Bình- Bắc Ninh

- Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, trọng lượng trung bình từ 23- 24g do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp

- Máu người: nhóm máu A, B, O do Việt huyết học và

truyền máu- bệnh viện Bạch Mai cung cấp

- Các chủng vi sinh vật do Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật- TTCNSH- ĐHQG cung cấp

- Các hoá chất được sử dụng dưới dạng tinh khiết

Phương pháp

- Phân loại học theo phương pháp của Trịnh Tam Kiệt [5]

- Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể theo các

phương pháp nghiên cứu của Trịnh Tam Kiệt và các tác giả [4]

- Định tính và tách chiết alkaloid tổng số theo các phương pháp cập nhật đã được mô tả [8, 10, 11]

- Thực hiện phản ứng gây ngưng kết hồng cầu theo nguyên tắc của Gebauer [9]

- Thử khả năng kháng khuẩn của độc tố: Theo phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch Môi trường nuôi cấy là

Mueller- Hinton [9, 6]

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Nghiên cứu hình thái quả thể và bào tử

Panaeolus aff retirugis (Fr.) Gill, Họ Strophariacea Singer KA H Sm 1946, thuộc chi Panaeolus (Fr.) Quel.,

1872 Đây là một chi tương đối lớn, ở Việt Nam đã có 10 loài được ghi nhận [5] Mũ nấm khi non có hình cầu, khi

mở ra thành hình bán cầu, màu trắng xám Bề mặt mũ nhẵn bóng và khô, không nhày dính, đường kính khoảng 1-3cm Phiến màu xám nhạt khi non, sau màu xám đen, lốm đốm (do bào tử chín không đều tạo nên những đốm đen trên nền xám) Cuống cùng màu với mũ, mảnh, dễ gẫy Thịt nấm mỏng, màu trắng Bào tử màu nâu, hình quả chanh, kích thước: 12- 14vm x 6-8m Chúng thường mọc trên phân trâu bò mục, các bãi cỏ chăn thả gia súc, ven đường, đất trồng có bón phân chuồng Đây là loài nấm độc mọc quanh năm

Hình1: Quả thể và bào tử của nấm Panaeolus aff retirugis

2 Nghiên cứu sự mọc của nấm

Giống gốc thuần khiết được phân lập từ mô rất mỏng

của quả thể nấm Panaeolus aff retirugis Giống gốc nấm

trên môi trường thạch nghiêng được cấy truyền sang môi trường thạch trong bình tam giác để nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của hệ sợi, kết quả được chỉ ra trong bảng sau:

Bảng 1: Tốc độ mọc của sợi nấm

Qua kết quả nghiên cứu hệ sợi của nấm Paneolus aff

retirugis trên môi trường thạch chúng tôi nhận thấy: Sau

khi tách phân lập được giống thuần khiết từ miền mô thể quả non, hệ sợi phát triển tốt ở 25 ± 3OC trên môi trường thạch Tốc độ mọc của sợi nhìn chung là khá chậm (68-70

m/giờ) Sau khoảng 7-15 ngày hệ sợi mọc dày đặc trên bề mặt thạch và sau khoảng 26 ngày bắt đầu xuất hiện sắc tố

vàng ở vùng tâm khuẩn lạc (miền sợi già) đó là dấu hiệu xuất hiện mô sẹo

Khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm Paneolus aff retirugis là sợi có vách ngăn, tồn tại dưới 2 dạng: dạng sợi

bình thường, đó là dạng sợi mảnh, có độ dày khoảng 2-3

m, không nhìn thấy các hạt nội chất bên trong Dạng thứ 2

là dạng sợi căng phình, bên trong chứa nhiều hạt nội chất,

có độ dày khoảng 4-10 m

3 Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học

3.1 Định tính alkaloid

Để xác định nhanh sự có mặt của alkaloid trong nấm, ta

có thể tiến hành theo cách đơn giản sau: Lấy 1-2 g nguyên liệu, ngâm vào 5 ml dung dịch CH3COOH 1%, đun sôi, lọc qua giấy lọc, li tâm bỏ cặn Dịch lọc đem thử với các thuốc thử đặc hiệu với alkaloid [2, 7]

Bảng 2: Phát hiện các hợp chất alkaloid trong nấm

Kết quả bảng 2 cho thấy:

Các phản ứng phát hiện alkaloid trong nấm Paneolus aff retirugis đều dương tính, chứng tỏ sự có mặt của nhóm chất này ở trong nấm Panaeolus aff retirugis Điều này hoàn

toàn đúng so với kết quả đã công bố của các tác giả nghiên cứu về những chất này[12]

3.2 Chiết xuất và định lượng alkaloid tổng số

Dựa vào tính chất của alkaloid, có thể tiến hành chiết rút alkaloid ra khỏi nguyên liệu, trước hết cần kiềm hoá

nguyên liệu để đẩy alkaloid ra ở dạng tự do rồi rút alkaloid bằng dung môi hữu cơ Sau đó có thể cho bay hơi dung môi

và cân trực tiếp lượng alkaloid đã được tách ra, hoặc có thể chuẩn độ alkaloid được tách ra bằng axít và dựa vào lượng axít đã dùng để chuẩn độ tính ra lượng alkaloid [7]

Bảng 3: Hàm lượng alkaloid tổng số trong nấm Panaeolus

aff retirugis

Như vậy, hàm lượng alkaloid tổng số trong nấm Panaeolus aff retirugis khá cao, có thể đạt tới 49 ÷ 50 mg/g bột nấm

khô (chiếm tới gần 5% trọng lượng khô của nấm ) Do đó cần phải quan tâm đến hợp chất này về mặt khai thác cũng như thành phần và chức năng sinh dược học của chúng Chế phẩm alkaloid tổng số này được dùng để thử độc tính của chúng

4 Kết quả nghiên cứu độc tính

4.1 Thử độc tính trên đối tượng tế bào hồng cầu

Chế phẩm alkaloid tổng số được hoà vào PBS với tỷ lệ chế phẩm/PBS =1g/20ml Sau đó dùng dịch này tiến hành thử hoạt tính trên hồng cầu của 3 nhóm máu: A, B, O Kết quả thu được như sau: Mặc dù chế phẩm của loài nấm này không gây ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu nhưng chúng

có khả năng làm tan huyết (giống với hiện tượng làm tan huyết của Saponin )

Bảng 4: Hoạt tính làm tan huyết của độc tố nấm

Qua bảng kết quả cho ta thấy: Khả năng làm tan huyết của

độc tố trong nấm Panaeolus aff retirugis thể hiện trên cả 3

nhóm máu Trong đó khả năng làm tan huyết mạnh nhất ở nhóm máu A (90 HHA)

4.2 Thăm dò khả năng kháng khuẩn của chế phẩm thô

Chế phẩm chiết rút từ nấm Panaeolus aff retirugis được

hoà với nước cất tạo thành dạng nhũ dịch với nồng độ là 0.025 g/ml Thử nghiệm được tiến hành trên 3 chủng vi khuẩn gram (-) và 2 chủng vi khuẩn gram (+) Kết quả thu được như sau:

Bảng 5: Tính kháng của chế phẩm chiết từ nấm Panaeolus

aff retirugis

Từ kết quả bảng trên cho thấy: Chế phẩm chiết rút từ nấm

Panaeolus aff retirugis có khả năng kháng đối với chủng gram (-) là S.typhy (không kháng đối với các chủng còn

lại) Do đó cần phải được nghiên cứu kỹ hơn để xác định chính xác chất nào trong alkaloid tổng số thể hiện tính

kháng khuẩn trên

4.3 Thử độc tính cấp của chế phẩm trên đối tượng chuột

Chế phẩm (độc tố) được hoà tan với nước tạo thành dạng nhũ dịch với các nồng độ từ 5- 20% tương ứng với từng lô, đưa vào cơ thể chuột theo đường uống, đảm bảo thể tích nhũ: 0.4 ml/chuột Chúng tôi đã tiến hành thí

nghiệm trên 25 chuột nhắt, được chia thành 5 lô, trong đó:

+ Thí nghiệm A: 1 lô đối chứng, uống nước cất

+ Thí nghiệm B: 4 lô, uống chế phẩm độc tố với các nồng độ tương ứng: 5%, 10%, 15% và 20%

Kết quả, ở thí nghiệm A- lô đối chứng: Trong thời gian thí nghiệm chuột sống khoẻ mạnh, không có biểu hiện gì khác thường

Ở thí nghiệm B: Với nồng độ thấp 5% sau khi uống, chuột

có hiện tượng giảm hoạt động và khó thở nhẹ, hơi lờ đờ, sau 5 giờ hồi phục dần và sống hoàn toàn qua 24 giờ Với nồng độ cao hơn sau khi uống 20 phút đã giảm hoạt động, khó thở lảo đảo như say, đầu co giật, trương phềnh bụng,

có phản ứng ngứa ngáy, xù lông, tím tái, hiện tượng trên tăng dần theo nồng độ Nhiều chuột vật vã nhảy chồm lên mất phản xạ lật, khi chết toàn thân mềm Một số chuột qua cơn vật vã chống cự được thì hồi phục dần sau 10 giờ Tỷ

lệ chuột chết tăng theo nồng độ

Bảng 6: Tỷ lệ chuột chết dưới tác động của độc tố alkaloid

trong nấm Panaeolus aff retirugis

Ngay sau khi chuột chết, chúng tôi tiến hành mổ để quan sát phủ tạng Kết quả cho thấy

- Phổi xung huyết, một số phế nang chảy máu

- Não không thấy tổn thương

- Dạ dày, ruột trương phềnh , trong chứa đầy khí

Hình 2: Chuột chết do uống chất độc trong nấm Panaeolus

aff retirugis

IV KẾT LUẬN

1 Nấm Paneolus aff retirugis có khả năng phân lập thuần

khiết và nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây với tốc

độ mọc của sợi nấm là 68-70 m/giờ Sợi nấm có các tế bào phình chứa nội chất, đạt kích thước tới 10 m đường kính

2 Hàm lượng alkaloid tổng số được chiết rút từ nấm

Paneolus aff retirugis là: (49,5 ± 0.3) mg/g

3 Độc tố trong nấm Paneolus aff retirugis có khả năng

gây tan huyết trên cả 3 nhóm máu: A, B, O ở người và ức

chế đối với chủng vi khuẩn Salmonella typhy Độc tố này

tác dụng nhanh, mạnh lên cơ thể chuột (với liều uống 3330 mg/kg số chuột chết chiếm tới 80%)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Huy Chính (2001), Vi Sinh vật y học, Nxb Y học, Hà Nội

2 Trần Công Khánh, Phạm Hải (1992), Cây độc ở Việt Nam - nhiễm độc, giải độc và cách điều trị, NxbY học, Hà Nội

3 Trịnh Tam Kiệt (1981), Nấm lớn ở Việt Nam, Nxb khoa học, Hà nội

4 Trịnh Tam Kiệt và cộng sự (1996), Sinh học và kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, Nxb Nông nghiệp, Hà nội

5 Trịnh Tam Kiệt và các cộng sự (2001), Danh lục thực vật Việt nam- phần nấm, tr 296

6 Hoàng Thuỷ Long (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, tr.328

7 Nguyễn Quang Vinh, Bùi phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (1997), Thực tập hoá sinh học, tr.75-76

8 Goodwin & Mercer (1989), “introduction to plant

biochemistry”, The Alkaloid, pp.480-527 9 Fleish M and Maider L., 1985: A one step procedure proisolation and

resolution of the Phaseolus vulgaris isolectin by affinity chrromatography Biol Chem Hoppe- Seyler, 266, pp 1029- 1032

10 Richard B (1995), "The organic chemistry of drug design and drug action", Acdemic Press, Inc Lon Don, pp.289

11 Vander Gergher D.A and Vlietink A.J (1994),

"Menthod in plant biochemistry"

12 http:// Panaeolus/ DaoDas1 htm

SUMMARY

RESEACHING BIOLOGICAL CHARACTERISTIC AND TOXIN OF

PANAEOLUS AFF RETIRUGIS

Hoang Van Vinh, Trinh Tam Kiet

Center of biotechnology - Vietnam national

University, Hanoi

Do Ngoc Lien

Vietnam national university, Hanoi

The fungi Panaeolus aff retirugis is isolated and

growing in pure culture of potato- agar with increasing speed 70 m/h Total alkaloid's content was extrated in this

fungi about 49.5 ± 0.3 mg/g Toxin in panaoelus aff

retirugis able to dissolve red blood cells of the three of human blood A, B, O and to restrain bacterria: Samonella typhy Specialy, whitle mouse was died about 80% by this

toxin with dose: 3330 mg/g