BÁO CÁO KHOA HỌC: "BULLERA NINHBINHENSIS SP. NOV., MỘT LOÀI NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM" docx

NOV., MỘT LOÀI NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân Dũng.. ĐẶT VẤN ĐỀ Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, đã ph

BULLERA NINHBINHENSIS SP NOV., MỘT LOÀI NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân Dũng

Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN

Masako Takashima, Takashi Nakase

Bảo tàng Vi sinh vật Nhật Bản, Viện nghiên cứu Hoá Lý, Saitama, Nhật Bản

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương,

đã phân lập được 120 chủng nấm men sinh bào tử bắn Năm chủng thuộc chi Kockovaella là đại diện của 4 loài

mới là: Kockovaella calophylli, K cucphuongensis, K litsea và K vietnamensis đã được công bố [6] Trong bài

báo này chúng tôi thông báo một trong số 17 các loài chưa biết của chi Bullera [1]

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Chủng nấm men sử dụng: Chủng nấm men VY-112 được

phân lập từ bề mặt lá cây dong (Phrygnum parviflorum

Gagnep), thuộc họ Marantaceae mọc ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình, theo phương pháp của Nakase và

Takashima [9]

- Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Theo mô tả của Yarrow [16] Khả năng đồng hoá nitơ được xác định theo phương pháp của Nakase và Suzuki [8] Vitamin đòi hỏi bắt buộc được xác định theo Komagata và Nakase [5]

- Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách

chiết, tinh sạch và xác định ubiquinone theo phương pháp của Nakase và Suzuki [8] Xyloza trong tế bào được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng theo Nakase và cộng sự [7], sau khi thuỷ phân tế bào bằng axit trifluroaxetic theo Suzuki và Nakase [12]

- Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trật tự của

rADN 18S và ITS bao gồm cả rADN 5,8S được xác định theo phương pháp của Takashima và Nakase [13], sử dụng chương trình computer CLUSTAL W ver 1.74 của

Thompson và cộng sự [15] Các trật tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, Gen Bank Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura [4] sử dụng phương pháp của Saitou và Nei [10] Các khoảng trống tồn tại trong các sequence được loại trừ Các phân tích Bootstrap theo Felsenstein [2] được thực hiện từ 1000 mẫu Để so sánh các sequence của vùng rADN ITS trong các loài có quan hệ họ hàng gần, các

sequence được so sánh từng cặp bằng mắt thường

- Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN thực hiện theo phương pháp của Takashima và Nakase

[14] Thành phần của ADN được xác định bằng sắc ký lỏng cao áp Các thí nghiệm lai ADN-ADN được thực hiện theo phương pháp lọc màng của Hamamoto và Nakase [3]

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Bullera, một chi nấm men sinh bào tử bắn đã được mô tả từ năm 1930 bởi Derx [1] Chi này được đặc trưng bởi bào tử dạng đối xứng; khuẩn lạc màu trắng đến ngà; sinh sản theo

2 cách: Bằng bào tử bắn và bằng tế bào nảy chồi;

ubiquinone chủ yếu là Q-10 và chứa xyloza trong tế bào Chủng nấm men VY-112, phân lập từ bề mặt lá cây dong

(Phrygnum parviflorum Gagnep), thuộc họ Marantaceae ở

Vườn Quốc gia Cúc Phương, có đầy đủ các đặc điểm đặc

trưng trên và được xác định vào chi Bullera

Trật tự 1780 bazơ của rADN 18S của chủng VY-112 đã được xác định Cây phát sinh chủng loại được xây dựng

giữa chủng VY-112 với 34 loài của các chi Bullera,

Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella và các chi nấm

men khác Kết quả cho thấy chủng VY-112 nằm trên một

nhánh tách rời và có quan hệ gần gũi với Cryptococcus podzolicus (Hình 1)

Xác định thành phần ADN của G+C cho thấy chủng

VY-112 có tỷ lệ 59,9 G+C mol%, còn Cryptococcus podzolicus

lại có tỷ lệ 56,8 G+C mol%

Trật tự 274 bazơ của các đoạn rADN ITS cũng đã được xác định (Hình 2) và tỷ lệ bazơ giống nhau đã được tính giữa

VY-112 và Cryptococcus podzolicus Ở đoạn ITS 1 có tỷ lệ

85,8 % ba zơ giống nhau và 81,5% giống nhau ở đoạn ITS

2 Kết quả này cho thấy chủng VY-112 khác biệt với

Cryptococcus podzolicus [11]

Nghiên cứu về các đặc điểm sinh lý và sinh hoá cũng chỉ rõ

chủng VY-112 khác hẳn Cryptococcus podzolicus (Bảng 1)

Các kết quả trên khẳng định chắc chắn rằng chủng VY-112

là đại diện của một loài mới

Loài này được chúng tôi đặt tên là Bullera ninhbinhesis

Mô tả loài mới

Bullera ninhbinhensis Luong, Takashima, Ty, Dung et

Nakase, sp nov

In liquido “YM” post dies 5 ad 17˚C, cellulae vegetativae sphaericae vel ovoideae aut elongatae, 2.0-6.0x3.0-8.0 m,

singulae, binae aut in catenis Post unum mensem ad 17˚C, pellicula et sedimentum formantur Cultura in agaro “YM”, subflava, glabra, non-nitida, mollis,butyracea et margine glabra Mycelium et pseudomycelium non formatur

Ballistoconidia rotundae vel napiformes, 2.0-2.5x1.5-2.0

m

Fermentatio nulla Glucosum, galactosum, L-sorbosum (exiguum), sucrosum, maltosum, cellobiosum, trehalosum, lactosum(exiguum), melibiosum(exiguum),

raffinosum(exiguum), melezitosum, amylum solubile, xylosum, L-arabinosum, arabinosum,

D-ribosum(exiguum), L-rhamnosum, ethanolum, glycerolum (exiguum), erythritolum (exiguum), galactitolum,

D-mannitolum (lente), D-glucitolum (lente),

-methyl-D-glucosidum, salicinum (exiguum), glucuno--lactonum, acidum 2-ketogluconicum, acidum 5-ketogluconicum,

acidum D-glucuronicum, acidum D-galacturonicum,

acidum DL-lacticum, acidum succinicum, acidum citricum (exiguum) et inositolum(exiguum) assimilantur at non

ribitolum nec inulinum, Ammonium sulfatum,

cadaverinum, ethylaminum, kalium nitricum et L-lysinum

assimilantur at non natrium nitrosum Maxima temperatura crescentiae: 32-33˚C Ad crescentiam thiaminum

necessarium est Materia amyloidea iodophila non

formantur Ureum hydrolysatur Diazonium caeruleum B: Positivum Proportio molaris guanini+cytosini in acido deoxyribonucleico: 59,9 mol% per HPLC Systema

ubiquini: Q-10 Xylosum in cellulis presens

Holotypus: Isolatus ex folio Phrygnum parviflorum,

Vietnam, VTCC1 0184 (originaliter ut VY-112)

conservatur in collectionibus culturarum quas “Vietnam Type Culture Collection”, Hanoi, Vietnam sustentat

Nuôi cấy trên môi trường YM dịch thể: Sau 5 ngày nuôi ở

170C các tế bào dinh dưỡng có dạng cầu tới oval, một số tế bào dạng thuôn dài, kích thước 2,0-6,0x3,0-8,0 m, chúng thường đơn độc, thành cặp hoặc thành nhóm, sinh sản bằng nảy chồi Sau một tháng nuôi ở 170C thấy xuất hiện một lớp cặn mỏng ở đáy và một lớp váng mỏng dễ tan ở thành ống nổi trên bề mặt môi trường

Nuôi cấy trên môi trường YM thạch nghiêng: Sau một

tháng nuôi cấy vạch, khuẩn lạc màu vàng nhạt, nhẵn đục, mềm và có mép trơn

Nuôi cấy trên môi trường thạch-bột ngô ở đĩa Petri: Khuẩn

ty thật và khuẩn ty giả đều không được tạo thành sau 2 tuần

ở 250C

Bào tử bắn: Bào tử bắn được tạo thành nhiều trên môi

trường thạch -bột ngô, sau 3 ngày nuôi ở nhiệt độ 170C Bào tử bắn có dạng cầu tới nhọn một đầu, kích thước 2,0-2,5x1,5-2,0 m

Khả năng lên men: Không có khả năng lên men

Khả năng đồng hoá các nguồn cacbon:

Khả năng đồng hoá các nguồn Nitơ:

Nhiệt độ sinh trưởng cực đại: 32-330C

Vitamin đòi hỏi bắt buộc: Tiamin

Cơ chất tạo thành giống tinh bột: Âm tính

Phản ứng mầu với Diazonium blue B: Dương tính

Phân giải ure: Dương tính

Tách axít béo: Âm tính

Hoá lỏng gelatin: Yếu

Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% glucoza: Âm tính Sinh axít trên môi trường glucoza: Yếu

Thành phần C+G của DNA: 59,9 mol % (bằng sắc ký lỏng cao áp)

Hệ thống ubiquinon: Q-10

Xyloza trong tế bào: Có mặt

Chủng kiểm tra: Chủng VY-112 do Đào Thị Lương phân

lập năm 1999 từ lá cây dong (Phrygnum parviflorum

Gagnep), mọc ở vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình Chủng này đang được bảo quản tại Bảo tàng Giống Vi sinh vật, Đại học Quốc gia Hà Nội

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân

Dũng(2001) Khảo sát các loài nấm men sinh bào tử bắn thuộc các chi Bullera và Kockovaella mới tìm thấy ở Việt

Nam Hội thảo Quốc tế Sinh học Hà Nội – Việt Nam (2-5 tháng 7) Tr 140-145

2 Boekhout, T & Nakase, T (1998) Bullera Derx In The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., ed By Kurtzman,

C P and Fell, J W., Elsevier, Amsterdam, pp 731-741

3 Felsenstein, J (1985) Confidence limits on

phylogenies: an approach using the bootstrap Evolution.,

39, 783-791

4 Hamamoto, M and Nakase, T (1995) Ballistosporous yeasts found on the surface of plant materials collected in New Zealand Six new species in the genus

Sporobolomyces Antonie van Leeuwenhoek., 67, 151-171

5 Kimura, M (1980) A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences J Mol Evol., 16, 111-120

6 Komagata, K and Nakase, T (1967) Reitoshokuhin

no biseibutsu ni kansuru kenkyu V Shihan reitoshokuhin yori bunri shita kobo no seijo (Microbiological studies on frozen foods V General properties of yeast isolated from frozen foods) (in Japanese) Shokuhin Eiseigaku Zasshi., 8, 53-57

7 Luong, D.T., Takashima, M., Ty, P V., Dung, N L., and Nakase, T (2000) Four new species of Kockovaella isolated from plant leaves collected in Vietnam J Gen Appl Microbiol., 46, 297-301

8 Nakase, T., Komagata, K and Fukazawa, Y (1976) Candida pseudointermedia sp nov isolated from

“Kamaboko”, a traditional fish-past product in Japan J Gen Appl Microbiol., 22, 177-182

9 Nakase, T and Suzuki, M (1986) Bullera

megalospora, a new species of yeast forming large

ballistospores isolated from dead leaves of Oryza sativa, Miscanthus sinensis, and Sasa sp in Japan J Gen Appl Microbiol., 32, 225-240

10 Nakase, T and Takashima, M (1993) A simple procedure for the high frequency isolation of new taxa of ballistosporous yeast living on the surfaces of plants

RIKEN Rev., 3, 33-34

11 Saitou, N and Nei, M (1987) The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic tree Mol Biol Evol., 4, 406-425

12 Sugita, T., Nishikawa, A., Ikeda, R and Shinoda, T

(1999) Identification of Medically Relevant Trichosporon Species Based on Sequences of Internal Transcibed Spacer Regions and Construction of a Database for Trichosporon Identification J Clin Microbiol., 37, 1985-1993

13 Suzuki, M and Nakase, T (1988) The distribution

of xylose in the cells of ballistosporous yeasts Application

of high performance liquid chromatography without

derivatization to the analysis of xylose in whole cell

hydrolysates J Gen Appl Microbiol., 34, 95-103

14 Takashima, M and Nakase, T.(1999) Molecular phylogeny of the genus Cryptococcus and related species based on the sequences of 18S rDNA and internal

transcribed spacer regions Microbiol Cult Coll., 15,

33-45

15 Takashima, M and Nakase, T Four new species of the genus Sporobolomyces isolated from leaves in

Thailand, Mycoscience (Accepted)

16 Thompson, J D., Higgins, D G and Gibson, T J (1994) CLUSTAL W: Improving the sensitivity of

progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight

matrix choice Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680

17 Yarrow, D (1998) Methods for the isolation,

maintenance and identification of yeasts In The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., ed by Kurtzman, C P and Fell,

J W., E lsevier, Amsterdam, pp 77-100

SUMMARY

BULLERA NINHBINHENSIS SP NOV., A NEW

BALLISTOCONIDIOGENOUS YEAST ISOLATED FROM VIETNAM

Dao Thi Luong, Pham Van Ty, Nguyen Lan Dung

Masako Takashima, Takashi Nakase

A ballistoconidiogenous yeast strain (VY-112), isolated

from a leaf of Phrygnum parviflorum Gagnep at Cuc

Phuong National Park of Ninh Binh Province, Vietnam,

was assigned to the genus Bullera based on morphological

and chemotaxonomical characteristics by the reproduction

of ballistoconidia and budding cells, Q-10 as the major

ubiquinone, and the presence of xylose in the cells The phylogenetic tree constructed based on the comparision of 18S rDNA sequences of VY-112 and 34 known species of

the genera Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella

and other by the neighbor-joyning method showed that

VY-112 made a group separated with Cryptococcus podzolicus

The sequences of ITS regions was determined, the

sequence similarties was compared and showed 83,2%

sequence similarities between VY-112 and Cryptococcus podzolicus The results showed that VY-112 represent as a new species Bullera ninhbinhensis is proposed for this

strain

Hình 2 So sánh trật tự r ADN ITS của C podzolicus và Bullera ninhbinhensis VY-112

Bảng 1 So sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng

VY-112 và Cryptococcus podzolicus*

Hình 1 Cây phát sinh chủng loại của Bullera ninhbinhensis

VY-112 và các loài có quan hệ gần