BÁO CÁO KHOA HỌC: "TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM" doc

Phương pháp nghiên cứu - Nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum được trình bày trong [1,2] - Protein được xác định theo phương pháp của Lowry, dùng casein làm chất chuẩn [7] - Hoạt độ SOD được

TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM

Tạ Bích Thuận, Phạm Kiên Cường, Đặng Quang Hưng

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

ĐHQGHN

MỞ ĐẦU

Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) từ lâu đã được coi

như là một loại "thần dược” với những tác dụng giá trị

dược liệu như bổ gan, thận, phổi, điều hoà huyết áp, làm giảm lượng đường và colesteron trong máu Gần đây nấm Linh Chi còn được dùng để điều trị các bệnh ung thư và được xem là nguyên liệu chứa nhiều chất chống oxy hoá

Nhằm đóng góp thêm các dẫn liệu về loại nấm có nhiều giá trị dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu các

enzyme bảo vệ oxi hoá của nấm Linh Chi, trong đó trước hết tập trung vào 3 enzym chính đó là catalase, superoxid

dismutase và NADH oxidase Bài báo này giới thiệu một số kết quả mà chúng tôi đã thu được

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Nấm Linh Chi Ganoderma lucidum - ký hiệu GAL được

lấy từ phòng Giống nấm gốc của Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, được GS Trịnh Tam Kiệt định tên khoa học

Phương pháp nghiên cứu

- Nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum được trình bày trong [1,2]

- Protein được xác định theo phương pháp của Lowry, dùng casein làm chất chuẩn [7]

- Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp McCord

và Fredovich [3,9]

- Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của Thibodeau và cộng sự [8] và lượng H2O2 còn lại được xác định theo phương pháp của Mottola và cộng sự [10]

- Hoạt độ của NOX được xác định theo phương pháp của Poole và Clairborne [11]

- Điện di trên gel polyacrylamide được tiến hành theo

phương pháp của Laemmli [6]

-Tinh sạch enzyme bằng cột sắc ký trao đổi ion qua cột

DE-52, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G100 [4,5]

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm GAL

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hệ sợi của nấm GAL phát triển thích hợp ở 26-28oC Sau 18-24 giờ cấy, hệ

sợi bắt đầu phát triển mạnh trên môi trường nuôi cấy lỏng Chủng Ganoderma lucidum có tốc độ sợi mọc từ 150 - 200 ml/giờ Còn trong điều kiện nuôi cấy sinh quả thể, kết quả cho thấy sau khoảng 25-30 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm bắt đầu bện kết Sau khoảng 2-3 tháng kể từ khi cấy giống, tán nấm phát triển thành thục, mỗi bịch chỉ cho 1-2 tán nấm lớn, năng suất thu hái tương đối thấp từ 2,5 - 4%

Hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD của nấm GAL

Hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của nấm GAL

Kết quả xác định hoạt độ của enzym NADH oxidase được trình bày ở hình 1

Hình 1 Hoạt độ NADH oxidase (NOX) của nấm GAL

Qua đây chúng tôi thấy rằng hoạt độ NOX của nấm GAL nhìn chung là tương đối thấp, chỉ đạt 0,049 đơn vị/ g

nguyên liệu tươi Hoạt độ NOX của nấm GAL ở dạng sinh khối cao hơn so với hoạt độ NOX ở dạng quả thể đạt 0,029 đơn vị/g nguyên liệu tươi

Hoạt độ enzym catalase (CAT) của nấm GAL

Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữ vai trò quan trọng phân huỷ các H2O2 trong hầu hết các cơ thể sinh vật Kết quả xác định hoạt độ CAT của mẫu GAL ( hình 4) cho thấy hoạt độ CAT của nấm GAL nhìn chung là tương đối cao, đạt tương ứng là 2,331 đv/mg protein và 2,319 đv/mg

protein ở dạng quả thể và dạng sinh khối

Hình 2 Hoạt độ catalase (CAT) của nấm GAL

Hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) của nấm GAL

Kết quả phân tích hoạt độ enzym SOD của nấm GAL được biểu hiện ở hình 5, nhìn vào đồ thị cho ta thấy hoạt độ riêng enzym SOD của quả thể là 1,517 đv/mgPr, còn ở dạng sinh khối hoạt độ riêng tương ứng với 10,279 đv/mgPr

Hình 3 Hoạt độ superoxit dismuatse (SOD) của nấm GAL

Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NADH chúng tôi đã chọn enzym NADH oxidase để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất

Bước đầu tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của NOX từ sinh khối nấm GAL

Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NOX chúng tôi đã chọn enzym NOX để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất

Tinh sạch một phần enzym NOX từ sinh khối nấm GAL

Để tinh sạch NOX từ sinh khối của nấm GAL, chúng tôi tiến hành thu dịch chiết, bổ sung thêm 0,1 thể tích đệm

Tris-HCL 100mM, pH 8,0 để nồng độ cuối cùng của đệm

là 100mM, pH đảm bảo đạt 8,0 và cho sắc ký qua cột gel DEAEcellulose DE-52, cột Sigma có kích thước 3x14 cm, được cân bằng với cùng đệm trên Phần protein gắn trên cột được rửa chiết bằng gradient NaCl từ 50 mM- 1000 mM pha trong đệm Tris- HCl 100mM, pH 8,0

Kết quả phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn sắc ký qua cột cho thấy phần dịch không hấp thụ

không có hoạt độ NOX Phần hấp thụ được đẩy ra dưới dạng 3 đỉnh protein chính, trong đó chỉ có đỉnh đầu tiên được đẩy ra ở nồng độ khoảng 370mM là có hoạt độ NOX

Sử dụng SDS-PAGE để đánh giá độ sạch của chế phẩm NOX sau khi qua cột DE-52 (hình 4) cho thấy chế phẩm có một băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa và một số băng protein khác nhưng ít rõ nét hơn ( H4.cột 2)

Để tiếp tục tinh sạch NOX của GAL, chúng tôi đã tiến hành

tập trung các phân đoạn có hoạt độ NOX qua cột DE-52, cô đặc mẫu bằng centricon và cho sắc ký qua cột lọc gel

Sephadex G-100 Cột có kích thước 1x70cm, được cân

bằng với đệm Kết quả rửa chiết và phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn qua cột Sephadex G100 cho thấy có 2 đỉnh protein chính, trong đó đỉnh thứ nhất có hoạt độ NOX

Kết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm sau khi qua bước lọc gel cho thấy ngoài băng protein 40 kDa vẫn còn một số băng khác có mặt trong chế phẩm, cho thấy chế phẩm chưa được tinh sạch hoàn toàn và cần tiếp tục tinh sạch

Hình 4: Kết quả điện di phổ băng protein của nấm GAL Cột M: Thang chuẩn protein; Cột 1: Dịch mẫu thô nấm

GAL;

Cột 2: Mẫu chạy qua cột DE-52 ; Cột 3: Mẫu chạy cột lọc

gel G-100

Nghiên cứu một số tính chất của enzym NOX

Sau khi thu được chế phẩm NOX tinh sạch một phần qua bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu một số tính chất của enzym

Độ bền nhiệt

Kết quả phân tích độ bền của enzym NOX bằng cách ủ enzym ở các nhịêt độ khác nhau và sau đó xác định hoạt độ còn lại (hình 5) cho thấy NOX của nấm GAL là tương đối bền với nhiệt, ở nhiệt độ 30-60oC sau 15 phút xử lý enzym vẫn giữ nguyên hoạt độ ban đầu Tuy vậy khi xử lý ở 80oC, trong 15 phút thì enzym chỉ còn 10% hoạt độ ban đầu

Ảnh hưởng của một số ion kim loại

Kết quả phân tích ảnh hưởng của 5 ion kim loại (Ca2+,

Cu2+, Fe2+, Mg2+ , Zn2+) và anion F- lên hoạt độ của NOX (hình 6) cho thấy chỉ có Fe2+ ở nồng độ 3-4mM có khả

năng làm tăng một phần hoạt độ của NOX Các ion Ca2+,

Mg2+ và Zn2+ và anion F- không ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym Còn ion Cu2+ ở nồng độ 4mM ức chế hoạt độ của NOX

Hình 6: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ của NOX

Xác định NOX của nấm GAL là thuộc loại sinh H 2 O hay sinh H 2 O 2

Theo các nghiên cứu khác nhau [10], NADH oxidase của các sinh vật được phân thành hai nhóm: nhóm thứ nhất xúc tác cho phản ứng oxi hoá một phân tử NADH đến oxi và hình thành nên một phân tử H2O2, vì vậy được gọi là NOX sinh H2O2 Nhóm thứ hai oxi hoá 2 phân tử NADH và tạo

H2O, nên có tên là NOX sinh H2O Kết quả xác định lượng

H2O2 sau phản ứng giữa NADH và enzym cho thấy H2O2 không hình thành sau phản ứng, chứng tỏ NADH oxidase của nấm GAL thuộc nhóm sinh H2O

Tóm lại, qua nghiên cứu này chúng tôi đã điều tra được hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá là SOD, CAT và NOX của nấm GAL ở dạng quả thể cũng như dạng sinh khối Có

sự khác nhau về hoạt độ enzym giữa hai loại mẫu này

Chúng tôi cũng đã bước đầu thu được chế phẩm NOX ở dạng tinh sạch một phần bằng phương pháp sắc ký qua cột trao đổi ion DE-52 và cột lọc gel Sephadex G-100 Các kết quả xác định tính chất chứng tỏ NOX của nấm GAL là thuộc nhóm sinh H20, khá bền với nhiệt, được hoạt hoá bởi

Fe2+ và bị ức chế bởi Cu2+

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nấm lớn ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật -

Hà Nội, 1981

2 Lê Xuân Thám - Nấm Linh Chi Dược Liệu quý ở Việt Nam, Nhà xuất bản mũi Cà Mau - 1996

3 Beanchamp, C., Fridovich, I., 1971 Superoxide

dismutase: Improved assays and assay applicable to

acrylamide gel Anal Biochem., 1: 276 - 287

4 Coco, D., Kinaldi, A., savini, I., Cooper, J.M., Bannister, J.V., 1988 " NADH oxidase from the extreme

Thermophile Thermus aquatiousYT-1 Purification and characteristic" Eur J Biochem., 174: 267 -271

5 David Toomey and Stephin, G.M., 1998 " Purification and characteristic of NADH oxidase from Thermus

aquatious YT -1 and evidnce that is function tin a

peroxidase reduction system", Eur.J Biochem, 254: 935 -

945

6 Leammli, U.K., 1970 Cleavage of structure protein

during the assembly of the head of bacterophage T4

Nature, 227: 680-685

7 Lowry,O.H Rose brough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J.,

1951 Protein measurement with the folin phenol reagent J Biochem., 193: 265 - 270 9 Mc Cord, J.M, Fridovich, L.,

1969 Superoxide dismutase an enzymic function

orerthoenperia J Biochem 244 : 6049 - 6055

8 Mc Cord, J.M, Fridovich, L., 1969 Superoxide

dismutase an enzymic function forerthoenperia J

Biochem 244 : 6049 - 6055 9 Mottola - Aebi, H.E.,

(1987), " Catalase" In : Methods of enzymatic analysis, , eds, Bermeyer, J., Grabl, M., VCH Publishers New York.,

273 - 285

10 Mottola, H.A., Simpson, B.E., Gorin, G., 1970

Absorptiometric determination of hydrogen peroxide in submicrogram amout with leucin crystal violet and

peroxodase as catalyst Anal Chemistry., 42 : 410 - 411

11 Poole, L.B., and Claibome, A 1986 Interactions of pyrimidine nucleotide with redox forms of the

flavin-containing NADH peroxidase form from streptococcus faecalis J Biol Chem., 261 : 14525 - 14533

SUMMARY

Investigation on some anti-oxidation enzymes of

Ganoderma lucidum

For many year Ganoderma lucidum (GAL) has been

considered to be a valualbe medicinal fungus with

anticancer and anti-oxidation activities In this study,

Ganoderma lucidum was selected for investigation of some anti-oxidation enzymes including catalase (CAT),

superoxide dismutase (SOD), NADH oxidase (NOX)

Our obtained results shows that GAL biomass grown in lab conditions has higher activity of CAT and NOX enzymes than GAL fruit body SOD is present at the lowest level in both of samples

The NOX (which was partially purifed by chromatography

on DEAE-cellulose and Sephadex-G100 columns) appears

to work well at pH 7.5 – 8 as a thermostable enzyme with more than 60% of activity remained after treatment at 60oC for 15 minutes However, the enzyme quickly lost its

activity when being incubated at 80oC Some ions such as

Mg2+, Ca2+ at 1 - 4mM concentrations hardly effect the activity of enzyme Fe2+ at 1 - 4mM concentration

stimulates the activities of the enzyme whereas Cu2+ at the same concentrations shows to be strongly inhibitory for its activity

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Bùi Phương Thuận