BÁO CÁO KHOA HỌC: "ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI CẤY CALLUS CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL)" ppt

ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI CẤY CALLUS CÀ CHUA LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL Trương Thị Bích Phượng, Hồ

ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ

NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI CẤY CALLUS CÀ CHUA (LYCOPERSICON

ESCULENTUM MILL)

Trương Thị Bích Phượng, Hồ Thị Kim Khánh

Trường đại học Khoa học, Đại học Huế

phương thức chuyển hóa ở thực vật, làm tăng tích lũy hoặc

giảm hàm lượng các chất chuyển hóa như carbohydrate, acid hữu cơ, amino acid, các hợp chất amon và abscisic acid (Kaur và cs 2000) Khả năng diều chỉnh thẩm thấu và tích lũy các hợp chất hữu cơ hòa tan ở thực vật khi bị stress hạn đã được quan sát thấy ở nhiều loài, sự tích lũy prolin và đường sẽ khởi động tính chống chịu stress thẩm thấu và muối cao (Watanabe và cs 2000) Việt nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa hạn là yếu tố thường

xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, ảnh hưởng xấu đến năng suất và phẩm chất của chúng Vì vậy việc nghiên cứu các cơ chế chống chịu hạn sẽ là cơ sở cho việc cải thiện giống cũng như tạo ra được các giống có tính chống chịu

Cà chua là loại rau quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, nhưng ở một số vùng ở nước ta nó còn giữ giá trị thấp trong

cơ cấu cây trồng Hiện nay các nghiên cứu trên đối tượng này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn chỉnh Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô

và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu các cơ chế tế bào của tính chống chịu stress Kết quả

nghiên cứu của chúng tôi góp phần làm sáng tỏ về vai trò của sự tích luỹ các chất prolin và glucose của callus cà chua liên quan với sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong điều kiện stress nước

2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

vô trùng Hạt đã khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ

bản (Murashige-Skoog 1962), saccharose 30 g/l, agar 8 g/l

ở pH 5,8; sau 10 ngày nuôi sẽ xuất hiện các cây con Cây được nhân giống vô tính bằng cách chuyển đỉnh sinh

trưởng và đoạn thân có một đốt lá lên môi trường cơ bản

MS có bổ sung kinetin 1,0 mg/l; IBA 0,1 mg/l; B1 1,0

mg/l; B6 0,1 mg/l

2.3 Nuôi cấy callus:

Mảnh lá (5x5 mm) và đoạn thân (5 mm) của cây in-vitro được cấy lên môi trường tạo callus bao gồm môi trường cơ bản MS, bổ sung thêm saccharose 30 g/l; kinetin 2,0 mg/l; NAA 0,5 mg/l; agar 8 g/l ở pH 5,8

Các khối callus (đường kính 2 mm) được nuôi 1 tuần trên môi trường tạo callus có bổ sung ABA nồng độ 10-5 M để tiền xử lý Sau đó chúng được chuyển sang môi trường tương tự nhưng thay ABA bằng mannitol ở các nồng độ 3,

6, 9 và 12% để gây stress nước trong các thời gian khác nhau 7, 14, 21 và 28 ngày

Các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày

2.3 Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối

Khả năng sinh trưởng của callus cà chua được xác định bằng chỉ số tốc độ sinh trưởng tương đối (RGR) theo công thức của Lutt và cs (1996):

Trong đó:

 t = t2 - t1 (t1: thời điểm bắt đầu nuôi cấy, t2: thời điểm

sau khi nuôi cấy), W1: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t1, W2: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t2

2.4 Xác định áp suất thẩm thấu:

Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của Schardakov (Grodzinski và Grodzinski 1981) và tính toán

giá trị bằng phương trình Van-Hoff :

P = iCRT

0,987 atm = 0,1 MPa C: nồng độ mol của dung dịch T: nhiệt độ tuyệt đối R: hằng số khí (0,082) i: hệ số đẳng trương của dung dịch (i = 1 đối với dung dịch saccharose)

2.5 Phân tích hàm lượng prolin

Hàm lượng prolin được xác định theo phương pháp của Bates và cs (1973), đo hấp thụ quang của dịch chiết trên máy quang phổ ở  = 520 nm Hàm lượng prolin được xác định bằng đường chuẩn prolin và tính toán theo công thức sau:

TLT: trọng lượng tươi, TLTM: trọng lượng tươi của mô

2.6 Phân tích hàm lượng glucose:

Hàm lượng glucose được xác định theo phương pháp của Folin-Wu (Lecoq 1952) có cải tiến, đo hấp thụ quang của dịch chiết trên máy quang phổ ở  = 590 nm và tính toán giá trị theo đường chuẩn glucose

2.6 Xử lý thống kê

Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành với 3 lần lặp lại Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng thống kê sinh học

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng điều chỉnh thẩm thấu của callus cà chua

Kết quả trình bày ở hình 1 cho thấy, callus cà chua có khả năng điều chỉnh thẩm thấu tương đối tốt trên môi trường bổ sung mannitol Áp suất thẩm thấu của các công thức có xử

lý mannitol đều cao hơn so với đối chứng, đạt giá trị cao nhất là 0,289 MPa (ĐC: 0,177 MPa) ở môi trường có 12% mannitol sau 7 ngày xử lý và đạt giá trị nhỏ nhất là 0,192

MPa (ĐC: 0,181 MPa) ở môi trường có 3% mannitol sau

28 ngày xử lý

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy, sau 28

ngày xử lý ở tất cả các nồng độ mannitol áp suất thẩm thấu của callus giảm xuống đồng loạt so với các thời gian xử lý trước Như vậy nếu bổ sung mannitol vào môi trường với nồng độ tăng dần trong thời gian xử lý ngắn thì mô có khả năng điều chỉnh thẩm thấu tốt, nhưng khi kéo dài thời gian

xử lý, thì sẽ ức chế khả năng điều chỉnh thẩm thấu của mô

3.2 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tốc độ sinh trưởng tương đối của callus cà chua

Khi áp suất thẩm thấu nội bào tăng từ 0,210-0,224 MPa, tốc

độ sinh trưởng của callus tăng lên từ 0,065-0,067 Sau đó tốc độ sinh trưởng của callus giảm dần khi áp suất thẩm thấu tiếp tục tăng, chỉ đạt giá trị 0,0082 ở 0,278 MPa (Hình 2) Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2000) ở

callus lúa cho thấy tốc độ sinh trưởng tương đối của mô cũng tăng cùng áp suất thẩm thấu nội bào và đạt cực đại ở

giá trị 0,016/0,64 MPa, sau đó bắt đầu giảm dần tương quan nghịch với áp suất thẩm thấu

3.3 Khả năng tích luỹ prolin của callus

Tương tự như áp suất thẩm thấu, hàm lượng prolin trong các công thức thí nghiệm đều cao hơn so với đối chứng (Hình 3) Trong cùng thời gian xử lý, hàm lượng prolin trong callus tăng dần ở môi trường có 3-9% mannitol và giảm ở 12% mannitol Trường hợp ở cùng nồng độ

mannitol, hàm lượng prolin trong callus cà chua tăng theo thời gian xử lý từ 7-14 ngày và giảm ở 21-28 ngày Hàm lượng prolin đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/g TLT ở mannitol 9% sau 14 ngày xử lý (ĐC: 2,716 mol/g TLT) Theo Delauney và Verma (1973), sinh tổng hợp prolin được điều khiển bởi enzyme '-pyrrolin -carboxylate

synthetase (P5CS) Enzyme này được điều hoà nhờ prolin thông qua ức chế ngược Ở thực vật chịu stress nước, sự điều hoà ngược này đã biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng tích luỹ prolin dưới các điều kiện stress

3.4 Khả năng tích luỹ glucose của callus

Khác với trường hợp prolin , sự tích lũy glucose trong

callus xử lý stress nước có sự sai khác không đáng kể, tuy vẫn cao hơn so với đối chứng ở tất cả các công thức thí nghiệm Ở cùng một nồng độ mannitol, sự tích lũy glucose của callus cà chua tăng từ 7-21 ngày và giảm sau 28 ngày

xử lý Trường hợp ở cùng một thời gian xử lý, hàm lượng glucose trong callus tăng từ 3-9% và giảm ở 12% mannitol Hàm lượng glucose đạt giá trị cao nhất là 10,154 mg/g TLT (ĐC: 7,304 mg/g TLT) ở môi trường có 9% mannitol sau

21 ngày xử lý (Hình 4)

3.5 Thảo luận

Việc xử lý stress nước callus cà chua cho thấy sự thay đổi hàm lượng prolin và hàm lượng glucose trong dịch bào có liên quan với khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào Thực vật có thể duy trì một sức trương không đổi trong quá trình khô hạn bằng cách tích luỹ các chất hoà tan để tăng áp lực nội tại tế bào Hàm lượng prolin trong callus cà chua

tăng theo thời gian xử lý từ 7-14 ngày và giảm ở 21-28 ngày Ở mannitol 9% sau 14 ngày xử lý, hàm lượng prolin đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/gTLT, gấp khoảng 4,8 lần so với đối chứng So với hàm lượng prolin , hàm lượng glucose trong callus cà chua tăng ít hơn và đạt giá trị cao nhất là 10,154 mg/g TLT ở môi trường có 9% mannitol sau

21 ngày xử lý, chỉ gấp khoảng 1,4 lần đối chứng Hàm

lượng prolin và glucose trong callus giảm sau 28 ngày xử

lý stress nước, tương ứng với việc giảm áp suất thẩm thấu nội bào Theo Gzik (1996), nhiều loài thực vật phản ứng nhanh với các nhân tố gây stress bằng cách tăng nồng độ các chất hòa tan thích hợp để điều chỉnh thẩm thấu, bảo vệ protein và màng ở điều kiện thế năng nước thấp Tích lũy prolin tự do dường như là phương thức phổ biến đối với stress ở thực vật bậc cao

Nguyễn Hoàng Lộc và cs (1992) nhận thấy các tế bào của những dòng thuốc lá có khả năng chịu muối và chịu mất nước, hàm lượng đường khử tăng một cách rõ rệt hơn từ 2,11 - 4,9 lần Nghiên cứu tế bào của callus lúa bị stress nước (Nguyễn Hoàng Lộc và cs 2000) cho thấy có sự gia tăng đáng kể hàm lượng glucose so với đối chứng ở tất cả

các công thức thí nghiệm; ở nồng độ mannitol từ 3-9% hàm lượng glucose tăng dần từ 7-28 ngày xử lý; ở mannitol 12% hàm lượng glucose tăng dần từ 7-21 ngày xử lý và giảm ở

28 ngày xử lý Như vậy rõ ràng những phân tử đường có cấu trúc phân tử nhỏ và dễ tan trong dịch bào có vai trò quan trọng trong việc tham gia điều chỉnh áp suất thẩm

thấu Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được rằng sự tích luỹ nhiều chất tương ứng với áp suất thẩm thấu trong tế bào

có thể ngăn chặn sự mất nước hay gia tăng khả năng giữ nước, với sự tích luỹ này giúp cho tế bào trương lên và tăng kích thước (Kogan và cs 2000) Morgan (1984) cho rằng các hợp chất hoà tan liên quan đến sự điều chỉnh thẩm thấu

là các loại đường đặc biệt, các amino acid, các ion vô cơ và hữu cơ, trong đó sự tích lũy prolin và đường sẽ khởi động tính chống chịu stress thẩm thấu (Watanabe và cs 2000)

Áp suất thẩm thấu của callus cà chua gia tăng theo nồng độ mannitol trong môi trường nuôi cấy từ 3-12%, tuy nhiên sự tích lũy prolin và glucose ở môi trường có 12% mannitol lại giảm xuống Trường hợp áp suất thẩm thấu vẫn tiếp tục tăng ở 12% mannitol có thể là do tác động của sự tích lũy

của các chất hòa tan khác trong tế bào hoặc tế bào có sự thay đổi về cấu trúc Theo kết quả xác định kích thước tế bào callus cà chua (Trương Thị Bích Phượng và cs 2000) cho thấy ở môi trường có 12% mannitol tế bào có kích

thước nhỏ nhất sau 2 và 3 tuần nuôi cấy và sau 4 tuần nuôi cấy thì kích thước tế bào thay đổi không đồng đều, bên

cạnh những tế bào có kích thước lớn là những tế bào có kích thước bé Nghiên cứu của Gebre và cs (1997) cho

thấy sự tích lũy của glucose và fructose trong các dòng

Populus delfoids tạo ra thế năng thẩm thấu của lá thấp hơn

và đây là yếu tố giúp duy trì sức trương tế bào dưới điều kiện stress nước Sucrose và các loại đường hòa tan khác có thể giúp cho thực vật tăng khả năng chống chịu sự mất

nước thông qua vai trò là một nhân tố thẩm thấu (Nieves và

cs 2001) Điều này cho thấy có mối liên quan giữa điều chỉnh áp suất thẩm thấu với việc tích luỹ các chất hoà tan trong dịch bào và thay đổi kích thước tế bào Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì một trong những phương thức

thích nghi với sự thiếu nước của môi trường là khả năng làm tăng áp suất thẩm thấu nội bào liên quan tới việc tăng tích luỹ các chất hoà tan như các loại đường polyol, prolin ,

glycinebetain , các ion vô cơ (Serrano và cs 1994), cùng với việc tăng tính đàn hồi của màng tế bào và giảm kích thước tế bào (Mussell và cs 1979)

4 KẾT LUẬN

- Áp suất thẩm thấu của callus cà chua tăng dần theo nồng

độ mannitol (3-12%) và thời gian xử lý từ 7-21 ngày, sau

đó giảm ở 28 ngày Áp suất thẩm thấu của callus cà chua ở các môi trường có mannitol đều cao hơn so với đối chứng, đạt cực đại là 0,289 MPa (ĐC: 0,177 MPa) ở nồng độ

mannitol 12% sau 7 ngày xử lý

- Hàm lượng prolin của callus tăng dần ở môi trường nuôi

có 3-9% mannitol và giảm ở 12% mannitol Hàm lượng prolin đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/g TLT ở nồng độ mannitol 9% sau 14 ngày xử lý (ĐC: 2,716 mol/gTLT)

- Sự tích luỹ glucose trong callus cà chua bị stress cao hơn

so với đối chứng ở các công thức thí nghiệm Hàm lượng glucose trong callus tăng dần theo thời gian xử lý từ 7-21

ngày, giảm ở 28 ngày xử lý và đạt giá trị cao nhất là 10,154 mg/g TLT ở mannitol 9% sau 21 ngày xử lý (ĐC: 7,304 mg/g TLT)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bates LS, Waldren RP and Teare ID 1973 Rapid

determination of free proline for water stress studies Plant and soil 39, 205-207

Delauney AJ and Verma DPS 1993 Proline biosynthesis and osmoregulation in plants The Plant Journal, 4(2): 215-

223

Gebre GM, Brandle JR, Kuhns MR 1991 Influence of rewatering and time of sampling on solute accumulation of two Populus deltoides clones Tree Physiol 17: 341-346 -aminoaGzik A 1996 Accumulation of proline and pattern

of acid in sugar beet plants in response to osmotic, water and salt stress Enviromental and Experimental Botany, 39(1): 29-38

Grodzinski AM và Grodzinski DM 1981 Sách tra cứu tóm tắt về sinh lý thực vật NXB Mr-Maxcơva, NXB Khoa học

và Kỹ thuật Hà nội

Karakas B, Akin PO, Stushnoff C, Suefferhelo M and

Rieger M 1997 Salinity and drought tolerance of

mannitol-accumulating transgenic tobacco Plant Cell and Environment, 20: 609-616

Kaur S, Gupta AK, Kaur N 2000 Effects of GA3, kinetin and indole acetic acid on carbohydrate metabolism in

chickpea seedlings germinating under water stress Plant Growth Regulation 30: 61-70

Kogan MJ, Kristoff G, Benavides MP and Tomaro ML

2000 Effect of pre-treatment with ethanolamine on the response of Helianthus annuus L to salt stress Plant

prolin và glucose liên quan với khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus lúa (Orya sativa L.) TC Sinh học, 22(3b) CĐ, 96-100

Lutt S, Kinet JM, Bourhamont J 1996 Effects of various salts and of mannitol on ion and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in rice (Oryza sativa L.)

callus cultures J Plant Physiol 149, 186 - 195

Morgan JM 1984 Osmoregulation and water stress in

higher plants Ann Rev Plant Physiol 35: 299-319

Murashige T, Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Plant,

Khoa học Đại học Huế, số 8, 85-91

Serrano R and Gaxiola R 1994 Microbial models and salt stress tolerance in plants Critical Review in Plant Sciences 13(2): 121-138

Watanabe S, Kojima K, Ide Y, Sasaki S 2000 Effects of saline and osmotic stress on proline and sugar accumulation

in Populus euphratica in vitro Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: 199-206

SUMMARY

Effects of mannitol on proline and glucose accumulation

in relation to osmotic adjustment in tomato

(Lycopersicon esculentum Mill) callus culture

Truong Thi Bich Phuong, Ho Thi Kim Khanh

College of Science, Hue University

Nguyen Huu Dong

Institute of Agriculture Genetics

Tomato calli were obtained and treated on the medium

containing 10-5 M ABA After 7 days, treated calli were transferred into the medium containing different

concentration of mannitol (3, 6, 9 and 12%) after 1, 2, 3 and 4 weeks of water stress treatment Osmotic pressure, relative growth rate, proline and glucose accumulation were quantified in the same the experimental condition

The results showed that relative grow rate, proline and

glucose concentrations relate to osmotic adjustment ability The osmotic pressure of tomato callus increased during water-stress treatment periods from 7 to 21 days at all

different concentrations of mannitol (3, 6, 9 and 12%

mannitol) and then decrease at 28 days, but the value of osmotic pressure of water-stress treatment callus was

greater than that of control callus The maximum value of osmotic pressure of callus was 0,289 MPa at 12% mannitol after 7 days of treatment, while that of the control callus was 0,177 MPa At the osmotic pressure of 0,210-0,224 MPa, the relative growth rate ranged from 0,065-0,067 After that relative growth rate was negatively correlated